本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素在制備抑制血小板聚集和血栓藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血栓是血流在心血管系統(tǒng)血管內(nèi)面剝落處或修補(bǔ)處的表面所形成的小凝血斑塊。在凝血生理過(guò)程中，血栓是凝血系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終產(chǎn)物，它主要由沉積的血小板，不溶性纖維蛋白，積聚的白細(xì)胞和紅細(xì)胞組成。血小板聚集是止血過(guò)程的的起始步驟之一，也是血栓形成的重要因素之一。血管中血栓的形成會(huì)阻礙血流的流動(dòng)，甚至導(dǎo)致血管的完全閉塞，血栓從血管內(nèi)壁剝落和脫離容易形成游走型栓塞。由此引發(fā)的心腦血管疾病包括心肌梗死、腦血栓、動(dòng)脈血栓栓塞和靜脈血栓栓塞等。血栓疾病形成是由遺傳和環(huán)境因素相互作用、相互影響的多因素變化過(guò)程。其發(fā)病形式多樣，而且往往具有反復(fù)性，綜合發(fā)病率高居各種疾病之首，近年來(lái)還有發(fā)病率逐漸增加，發(fā)病時(shí)間年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

目前臨床上用于預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物主要有抗凝血類(lèi)藥物，溶血栓類(lèi)藥物和抗血小板聚集類(lèi)藥物，但是常見(jiàn)的抗血栓藥物如阿司匹林、氯吡格雷等往往會(huì)產(chǎn)生藥效減弱、腸胃刺激和粒細(xì)胞減少等副作用，另外，阿司匹林、氯吡格雷等藥物還會(huì)造成出血風(fēng)險(xiǎn)增加，這嚴(yán)重影響臨床使用和患者的生命健康。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素在抑制血小板聚集中的應(yīng)用，所述藥物的應(yīng)用能夠降低出血風(fēng)險(xiǎn)，使用安全，擴(kuò)大臨床和醫(yī)藥用途。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素在制備抑制血小板聚集的藥物中的應(yīng)用，所述3,4,7-三羥基異黃酮具有式Ⅰ所示結(jié)構(gòu)，所述3-甲氧基大豆素具有式Ⅱ所示結(jié)構(gòu)：

優(yōu)選的，所述血小板聚集由膠原和二磷酸腺苷誘導(dǎo)產(chǎn)生。

優(yōu)選的，所述藥物的劑型為口服劑。

優(yōu)選的，所述3,4,7-三羥基異黃酮按照不同體重的患者給藥量≥10μmol/kg。

優(yōu)選的，所述3-甲氧基大豆素按照不同體重的患者給藥量≥100μmol/kg。

本發(fā)明提供了3,4,7-三羥基異黃酮及3-甲氧基大豆素在制備預(yù)防和/或治療血栓的藥物中的應(yīng)用；所述3,4,7-三羥基異黃酮和3-甲氧基大豆素的結(jié)構(gòu)式如權(quán)利要求1所述應(yīng)用中的結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，所述血栓為由血小板聚集引起。

優(yōu)選的，所述藥物的劑型為口服劑。

優(yōu)選的，所述3,4,7-三羥基異黃酮按照不同體重的患者給藥量≥100μmol/kg。

優(yōu)選的，所述3-甲氧基大豆素按照不同體重的患者給藥量≥300μmol/kg。

本發(fā)明提供了3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素在制備抑制血小板聚集的藥物中的應(yīng)用，所述3,4,7-三羥基異黃酮具有式Ⅰ所示結(jié)構(gòu)，所述3-甲氧基大豆素具有式Ⅱ所示結(jié)構(gòu)。所述3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素人對(duì)血小板聚集有明顯的抑制作用，同時(shí)實(shí)施例出血實(shí)驗(yàn)表明，3,4,7-三羥基異黃酮和3-甲氧基大豆素給藥的小鼠均沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的出血活性，而對(duì)照組同樣濃度的氯吡格雷給藥組有非常明顯的出血活性，這說(shuō)明本發(fā)明提供3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素在抑制血小板聚集中的應(yīng)用，所述藥物的應(yīng)用能夠降低出血風(fēng)險(xiǎn)，使用安全，擴(kuò)大臨床和醫(yī)藥用途。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中3,4,7-三羥基異黃酮在膠原誘導(dǎo)的血小板聚集中的抑制作用；

圖2為實(shí)施例1中3-甲氧基大豆素在膠原誘導(dǎo)的血小板聚集中的抑制作用；

圖3為實(shí)施例1中3,4,7-三羥基異黃酮在對(duì)ADP誘導(dǎo)的鼠尾血栓的抑制作用；

圖4為實(shí)施例1中3-甲氧基大豆素在對(duì)ADP誘導(dǎo)的鼠尾血栓的抑制作用；

圖5為實(shí)施例2中3,4,7-三羥基異黃酮和3-甲氧基大豆素在對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的鼠尾血栓的抑制圖片；

圖6為實(shí)施例2中3,4,7-三羥基異黃酮在對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的鼠尾血栓的抑制的變化情況；

圖7為實(shí)施例2中3-甲氧基大豆素在對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的鼠尾血栓的抑制的變化情況；

圖8為實(shí)施例3中80mg/kg3,4,7-三羥基異黃酮和氯吡格雷對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的影響；

圖9為實(shí)施例3中80mg/kg3-甲氧基大豆素和氯吡格雷對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的影響。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素在制備抑制血小板聚集的藥物中的應(yīng)用，所述3,4,7-三羥基異黃酮具有式Ⅰ所示結(jié)構(gòu)，所述3-甲氧基大豆素具有式Ⅱ所示結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明中，所述血小板聚集優(yōu)選由膠原和二磷酸腺苷誘導(dǎo)產(chǎn)生。所述膠原和二磷酸腺苷誘導(dǎo)機(jī)理是所述兩種化合物抑制血小板與其血小板膜受體的結(jié)合，從而抑制血小板聚集。所述膠原優(yōu)選為卡拉膠或交叉菜膠。所述膠原的誘導(dǎo)濃度優(yōu)選為0.5～0.8μg/mL，更優(yōu)選為0.6μg/mL。所述二磷酸腺苷誘導(dǎo)濃度優(yōu)選為50～100μmol/L，更優(yōu)選為70μmol/L。

本發(fā)明中，所述藥物的劑型優(yōu)選為口服劑。

本發(fā)明中，所述3,4,7-三羥基異黃酮對(duì)不同體重的患者用藥量?jī)?yōu)選≥10μmol/kg；更優(yōu)選為20μmol/kg～100μmol/kg，最優(yōu)選為60μmol/kg，即患者每千克給藥摩爾量≥10μmol/kg，根據(jù)不同質(zhì)量的患者來(lái)確定用藥的摩爾量。所述3,4,7-三羥基異黃酮的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的3,4,7-三羥基異黃酮的來(lái)源即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述3,4,7-三羥基異黃酮購(gòu)于北京普益華科技有限公司。

本發(fā)明中，所述3-甲氧基大豆素對(duì)不同體重的患者用藥量?jī)?yōu)選≥100μmol/kg，更優(yōu)選為120μmol/kg～300μmol/kg，最優(yōu)選為200μmol/kg，即患者每千克給藥摩爾量≥100μmol/kg，根據(jù)不同質(zhì)量的患者來(lái)確定用藥的摩爾量。所述3-甲氧基大豆素的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的3-甲氧基大豆素的來(lái)源即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述3-甲氧基大豆素購(gòu)于北京普益華科技有限公司。

本發(fā)明中，所述口服劑還包括醫(yī)學(xué)上接受的輔料。所述輔料包括溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、抗黏合劑、整合劑、滲透促進(jìn)劑、pH值調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、增塑劑、表面活性劑、發(fā)泡劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保濕劑、吸收劑、稀釋劑、絮凝劑與反絮凝劑、助濾劑、釋放阻滯劑等。

本發(fā)明中，所述口服劑的用藥頻率為每日一次，3～7d為一個(gè)療程。

本發(fā)明提供了3,4,7-三羥基異黃酮及3-甲氧基大豆素在制備預(yù)防和/或治療血栓的藥物中的應(yīng)用；所述3,4,7-三羥基異黃酮和3-甲氧基大豆素的結(jié)構(gòu)式如所述應(yīng)用中的結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中，所述血栓為優(yōu)選由血小板聚集引起。

本發(fā)明中，所述藥物的劑型優(yōu)選為口服劑。

本發(fā)明中，所述3,4,7-三羥基異黃酮對(duì)不同體重的患者用藥量?jī)?yōu)選≥100μmol/kg，更優(yōu)選為150μmol/kg～400μmol/kg，最優(yōu)選為250μmol/kg，即患者每千克給藥摩爾量≥100μmol/kg，根據(jù)不同質(zhì)量的患者來(lái)確定用藥的摩爾量。

本發(fā)明中，所述3-甲氧基大豆素對(duì)不同體重的患者用藥量?jī)?yōu)選≥300μmol/kg，更優(yōu)選為300μmol/kg～500μmol/kg，最優(yōu)選為400μmol/kg，即患者每千克給藥摩爾量≥300μmol/kg，根據(jù)不同質(zhì)量的患者來(lái)確定用藥的摩爾量。

本發(fā)明中，所述口服劑還包括醫(yī)學(xué)上接受的輔料。所述輔料包括溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、抗黏合劑、整合劑、滲透促進(jìn)劑、pH值調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、增塑劑、表面活性劑、發(fā)泡劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保濕劑、吸收劑、稀釋劑、絮凝劑與反絮凝劑、助濾劑和釋放阻滯劑中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了所述口服劑的制備方法，包括下列質(zhì)量百分含量組分：5～20％的活性成分，2～10％的崩解劑，0.2～2％的潤(rùn)滑劑，0.1～1.5％的助流劑及0～0.5％的添加劑，余量為填充劑混合，制成口服劑；所述活性成分為3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素。

本發(fā)明中，所述口服劑的用藥頻率為每天一次，3-7天為一個(gè)療程。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的3,4,7-三羥基異黃酮或3-甲氧基大豆素在制備抑制血小板聚集和血栓藥物中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

健康人血小板用血漿稀釋至2.5×10⁸個(gè)/mL。取富血漿血小板300μL，加入不同濃度樣品37℃保溫5min后，添加70μmol/L的ADP誘導(dǎo)聚集，在血小板聚集儀上繪制5min內(nèi)的聚集曲線。以沒(méi)有樣品處理過(guò)的血小板聚集為對(duì)照。

檢測(cè)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集使用洗滌的人血小板。如圖1所示，3,4,7-三羥基異黃酮及其類(lèi)似物以梯度依賴的方式抑制由0.6μg/mL膠原誘導(dǎo)的血小板的聚集。20μM的3-甲氧基大豆素能抑制約50％的血小板的聚集，而20μM的3,4,7-三羥基異黃酮能完全抑制的血小板的聚集。血小板洗滌方法如下：

a.每個(gè)1.5mLEP管裝1.4mL血小板(濃縮血小板血漿)，室溫400g離心5min，棄上清；

b.每管用0.5mL臺(tái)式A液重懸血小板，把兩管重懸的血小板合并到新的1.5mLEP管，混勻，400g室溫離心5min；

c.每管用1mL臺(tái)式A液重懸血小板，移到新的EP管中400g室溫離心5min；

d.每管用1mL臺(tái)式B液重懸血小板，并用臺(tái)式B液調(diào)整血小板到適當(dāng)?shù)臐舛取?/p>

如圖3和圖4所示分別表示3,4,7-三羥基異黃酮(3’,4’,7-Trihydroxyiso flavone)和3-甲氧基大豆素(3’-methoxydaidzein)以梯度依賴的形式抑制由ADP誘導(dǎo)的血小板的聚集。300μM的能抑制約50％的血小板的聚集，而100μM的3,4,7-三羥基異黃酮能抑制約50％的血小板的聚集。

實(shí)施例2

卡拉膠致鼠尾血栓模型

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用雄性昆明小鼠，體重20-25g，飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分組(n＝10)。第1組為生理鹽水對(duì)照組，樣品組分別使用33、100、300μmol/kg濃度3,4,7-三羥基異黃酮和3-甲氧基大豆素灌胃，陽(yáng)性對(duì)照使用300μmol/kg氯吡格雷灌胃。灌胃給藥處理30min后，以40mg/kg的劑量從小鼠腹腔注射卡拉膠(carrageenan，typeI，Sigma)，由于在低溫環(huán)境下，血栓形成率>90％，所用飼養(yǎng)溫度為18℃。24h后根據(jù)尾部皮膚顏色變化測(cè)定血栓形成的平均長(zhǎng)度?？诜?,4,7-三羥基異黃酮和3-甲氧基大豆素對(duì)血栓的抑制率隨著濃度的增加變大。和陰性對(duì)照組相比，口服300μmol/kg3-甲氧基大豆素和100μmol/kg3,4,7-三羥基異黃酮都能顯著抑制鼠尾血栓的形成，其中300μmol/kg3,4,7-三羥基異黃酮灌胃組平均血栓長(zhǎng)度要低于300μmol/kg氯吡格雷灌胃組(圖5-圖7)。

實(shí)施例3

3,4,7-三羥基異黃酮和3-甲氧基大豆素的出血風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

雄性C57BL/6(18-20g)8只一組，測(cè)試樣品及對(duì)照組通過(guò)灌胃給藥，給藥3、6、12小時(shí)后，將小鼠置于自制的專(zhuān)用固定器中，使其尾部穿過(guò)修剪后的1mL移液器槍頭，用消毒保險(xiǎn)刀片切去尾尖5mm，立即將鼠尾浸入37℃的生理鹽水中，以血流停止時(shí)間為指標(biāo)，觀察記錄斷尾出血停止的時(shí)間。

結(jié)果如圖8所示，在80mg/kg劑量時(shí)，3,4,7-三羥基異黃酮組與未給藥組相比在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的出血活性，而同樣濃度的氯吡格雷給藥組有非常明顯的出血活性。結(jié)果如圖9所示，在80mg/kg劑量時(shí)，3-甲氧基大豆素組與未給藥組相比在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的出血活性，而同樣濃度的氯吡格雷給藥組有非常明顯的出血活性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。