本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗感染功能的可吸收人工硬腦膜及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硬腦膜是一層位于頭骨內(nèi)側(cè)和大腦外側(cè)的結(jié)締組織，是保護(hù)腦組織的天然屏障。開放性顱骨損傷、腫瘤轉(zhuǎn)移及其他腦顱疾患等原因均會(huì)造成硬腦膜缺損，進(jìn)而導(dǎo)致腦脊液漏的發(fā)生。同時(shí)，由于細(xì)菌性腦膜炎等導(dǎo)致的顱內(nèi)感染仍然是顱腦術(shù)后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥。文獻(xiàn)報(bào)道，術(shù)后顱內(nèi)感染的發(fā)生率仍然高達(dá)0.2％～5％。術(shù)后一旦出現(xiàn)感染，不僅大大增加患者的醫(yī)療費(fèi)用，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致手術(shù)的失敗及死亡。因此如何有效修復(fù)硬腦膜缺損并防治術(shù)后感染是脊柱外科、神經(jīng)外科醫(yī)生及生物材料領(lǐng)域的科學(xué)家亟待解決的問題。
目前已有多種材料制成的人工硬腦膜正在臨床使用，主要可分為兩大類：生物衍生材料和人工合成高分子材料。生物衍生材料主要有同種異體的人體硬腦膜及異種的豬/牛源心包膜、真皮基質(zhì)以及利用牛肌腱i型膠原制備的生物膜等。人工合成高分子材料主要包括聚酯類可降解高分子，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯以及聚氨酯等。此外還包括聚四氟乙烯等不可降解高分子材料。但到目前為止，臨床中使用上述材料制成的人工硬腦膜產(chǎn)品都不具有防治術(shù)后感染的功能，不能很好地滿足臨床需要。
殼聚糖是自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一一種帶陽離子的堿性多糖，具有良好的生物相容性、降解性和預(yù)防組織粘連特性，更重要的是大量研究已證實(shí)其具有優(yōu)異的廣譜抑菌特性，已在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，因此是用于制備抗感染人工硬腦膜的理想材料。
中國發(fā)明專利cn103480042a，發(fā)明名稱為：“一種人工硬脊膜及其制備方法和使用方法”，公開了一種具有雙層結(jié)構(gòu)的人工硬脊膜，由取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纖維膜內(nèi)層和無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖纖維膜外層組成。該人工硬脊膜雖然可實(shí)現(xiàn)硬膜再生及預(yù)防瘢痕及粘連的目的，但存在如下缺點(diǎn)：(1)外層纖維采用聚乳酸/乙醇酸共聚物和殼聚糖復(fù)合而成，而當(dāng)殼聚糖含量較低時(shí)，抗感染活性必然會(huì)受到限制，而該專利中也未提及此人工硬腦膜的抗感染性能；(2)在臨床使用過程中需要將外層和內(nèi)層纖維分開放置在腦膜缺損位置，同時(shí)還需要再兩層之間涂覆粘結(jié)劑，極大增加了臨床使用過程中的不便。中國發(fā)明專利cn103656749a，發(fā)明名稱為“一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜及其制備方法”，公開了一種包含萬古霉素或鹽酸氧氟沙星注射液、殼聚糖及β-甘油磷酸鈉的抗菌人工硬腦膜，但該產(chǎn)品主要是利用材料組合中的抗生素藥物來實(shí)現(xiàn)抗菌目的，殼聚糖僅作為藥物載體。同時(shí)該人工硬腦膜作為藥械結(jié)合產(chǎn)品存在注冊報(bào)批困難等問題，不易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和臨床應(yīng)用。
因此，目前臨床上迫切需要一種抗感染效果良好、同時(shí)制備和臨床使用過程簡單、可縫合又可直接貼附使用、產(chǎn)業(yè)化前景廣闊的人工硬腦(脊)膜修補(bǔ)材料。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為臨床提供一種具有良好的抗感染功能，柔韌性、粘附性和力學(xué)強(qiáng)度良好、降解速率適中且在體內(nèi)可完全降解吸收的、能顯著促進(jìn)硬腦膜再生、同時(shí)既可縫合又可直接貼附使用的抗感染型人工硬腦膜。
本發(fā)明所提供的抗感染型人工硬腦膜，由具有雙層結(jié)構(gòu)的納米纖維膜和三維多孔結(jié)構(gòu)的高分子材料復(fù)合而成。
所述雙層結(jié)構(gòu)的納米纖維膜由可降解聚酯納米纖維膜和殼聚糖納米纖維膜兩層結(jié)構(gòu)復(fù)合而成，其中，納米纖維的直徑在100-1000納米之間、纖維間孔徑尺寸在300-3000納米之間。
所述雙層結(jié)構(gòu)的納米纖維膜的厚度為0.05-2毫米，其中，所述可降解聚酯納米纖維膜的厚度為0.04-1.5毫米，所述殼聚糖納米纖維膜的厚度為0.01-0.5毫米。
所述雙層結(jié)構(gòu)的納米纖維膜由可降解聚酯高分子材料和殼聚糖材料依次通過靜電紡絲制備而成。
所述可降解聚酯高分子選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙醇酸、聚對(duì)二氧環(huán)己酮、聚三亞甲基碳酸酯、聚乙二醇、聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯、聚丁二酸丁二醇酯及聚氨酯中的一種或幾種的共聚物，重均分子量在30-500kda之間。
優(yōu)選地，所述可降解聚酯高分子為左旋聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物，重均分子量為300kda。
所述殼聚糖的脫乙酰度在60％以上，重均分子量在10-100萬之間。
優(yōu)選地，所述殼聚糖的脫乙酰度為90％，重均分子量為70萬。
所述三維多孔結(jié)構(gòu)的高分子材料由天然高分子制成，存在于所述納米纖維膜的內(nèi)部及表面。
所述天然高分子選自羧甲基殼聚糖、羥丁基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽、殼聚糖季銨鹽、透明質(zhì)酸鈉、羧甲基纖維素、羥乙丙纖維素、氧化再生纖維素、海藻酸鈉、膠原蛋白、明膠、硫酸軟骨素及纖維蛋白中的至少一種，重均分子量為10-100萬。
優(yōu)選地，所述天然高分子為透明質(zhì)酸鈉，重均分子量為50萬。
所述三維多孔結(jié)構(gòu)的高分子材料具有海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，其孔徑尺寸在10-1000微米之間。
本發(fā)明還提供了上述抗感染型人工硬腦膜的制備方法。
所述方法包括下述步驟：
1)分別配制可降解聚酯高分子靜電紡絲溶液和殼聚糖靜電紡絲溶液；
2)將步驟1)中的兩種溶液依次通過靜電紡絲工藝得到具有可降解聚酯纖維及殼聚糖纖維雙層結(jié)構(gòu)的納米纖維膜材料；
3)將步驟2)中得到的納米纖維膜材料浸泡在天然高分子溶液中，得到浸泡后的納米纖維膜材料；
4)將上述浸泡后的納米纖維膜材料取出后冷凍干燥得到人工硬腦膜。
上述方法在步驟2)和步驟3)之間還可包括對(duì)步驟2)中得到的納米纖維膜材料依次通過乙醇和去離子水浸泡去除殘留溶劑的操作。
其中，在乙醇中浸泡6-24小時(shí)后再在去離子水中浸泡6-24小時(shí)，具體可為8小時(shí)、12小時(shí)，并重復(fù)該過程2-8次，具體可為3次、5次。
上述方法在步驟4)之后還可包括對(duì)得到的人工硬腦膜進(jìn)行分剪、滅菌的操作。
所述滅菌工藝可為co-60、電子束輻照或環(huán)氧乙烷滅菌。
上述方法步驟1)中所述可降解聚酯高分子靜電紡絲溶液通過將可降解聚酯高分子溶解在特定的溶劑中制備而成。
所述可降解聚酯高分子選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙醇酸、聚對(duì)二氧環(huán)己酮、聚三亞甲基碳酸酯、聚乙二醇、聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯、聚丁二酸丁二醇酯及聚氨酯中的一種或幾種的共聚物，重均分子量在30-500kda之間。
所述溶劑選擇為丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、去離子水、1,4-二氧六環(huán)、六氟異丙醇、乙醇、二甲基亞砜、三氟乙酸中的一種或幾種的混合物。
所述可降解聚酯高分子靜電紡絲溶液中可降解聚酯高分子的重量占溶液總重的1-20％。
較佳的，所述可降解聚酯高分子為聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物，重均分子量為300kda，紡絲溶液中高分子重量占溶液總重的10％。較佳的，所述靜電紡絲溶液的溶劑可選擇六氟異丙醇。
所述殼聚糖靜電紡絲溶液通過將殼聚糖溶解在特定的溶劑中制備而成。
所述殼聚糖的脫乙酰度在60％以上，重均分子量在10-100萬之間；所述溶劑為六氟異丙醇、乙酸、三氟乙酸、三氟乙醇、去離子水中的一種或幾種的混合物。
所述殼聚糖靜電紡絲溶液中高分子重量占溶液總重的0.5-10％之間。
較佳的，所述殼聚糖的脫乙酰度為90％，重均分子量為70萬，靜電紡絲溶液中高分子重量占溶液總重的1％，所述靜電紡絲溶液的溶劑為六氟異丙醇和乙酸的混合物，其中乙酸的體積分?jǐn)?shù)為1％。
上述方法步驟2)中所采用的靜電紡絲工藝為，先將步驟1)中制得的紡絲溶液依次裝入靜電紡絲液供給裝置；通過流量泵調(diào)控電紡絲液的供給流量為0.1-20毫升/小時(shí)，具體可為1毫升/小時(shí)；調(diào)節(jié)高壓發(fā)生端同收集裝置之間的距離為3厘米-30厘米，具體可為15厘米；通過高壓發(fā)生器給靜電紡絲過程提供高壓，可在0.1-40千伏(具體可為15千伏)之間調(diào)控；將轉(zhuǎn)速為100-1000轉(zhuǎn)/分(具體可為100轉(zhuǎn)/分)、直徑為2-20厘米(具體可為8厘米)的滾筒與接地端相連，作為靜電紡絲過程的收集基板；在旋轉(zhuǎn)滾筒上依次收集可降解聚酯高分子和殼聚糖后獲得具有厚度在0.05-2毫米(具體可為0.2毫米、0.25毫米)的雙層納米纖維膜，其中可降解聚酯高分子纖維膜厚度為0.04-1.5毫米，殼聚糖纖維膜厚度為0.01-0.5毫米。
上述紡絲工藝中，較佳的，供給流量設(shè)定為3毫升/小時(shí),高壓發(fā)生端同收集裝置之間的距離設(shè)定為10厘米，高壓設(shè)定為15千伏，滾筒的轉(zhuǎn)速設(shè)定為100轉(zhuǎn)/分，滾筒直徑為8厘米，可降解聚酯高分子纖維膜厚度為0.2毫米，殼聚糖纖維膜厚度為0.05毫米。
上述方法步驟3)中的浸泡工藝為，將所述納米纖維膜材料浸泡在天然高分子溶液中，浸泡時(shí)間為2-24小時(shí)，具體可為12小時(shí)。
所述天然高分子選自羧甲基殼聚糖、羥丁基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽、殼聚糖季銨鹽、透明質(zhì)酸鈉、羧甲基纖維素、羥乙丙纖維素、氧化再生纖維素、海藻酸鈉、膠原蛋白、明膠、硫酸軟骨素及纖維蛋白中的至少一種，重均分子量為10-100萬。
所述天然高分子溶液中的溶劑為去離子水，天然高分子重量占溶液總重的0.1-10％。
較佳的，所述天然高分子為透明質(zhì)酸鈉，重均分子量為50萬，高分子重量占溶液總重的2％，浸泡時(shí)間為12小時(shí)。
步驟4)中的凍干工藝為，將浸泡后的納米纖維膜材料平鋪放置在冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干12-48小時(shí)，具體可為12小時(shí)、36小時(shí)。
本發(fā)明所述步驟6中的滅菌工藝可選擇為co-60、電子束輻照或環(huán)氧乙烷滅菌。
上述抗感染型人工硬腦膜在制備硬腦(脊)膜缺損修補(bǔ)產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明所述的具有抗感染功能的可吸收人工硬腦膜具有以下有益效果：
1、組成中含有具有良好抗感染性能的殼聚糖納米纖維，可有效防止術(shù)后顱內(nèi)感染；
2、組成中含有的可降解聚酯高分子納米纖維可提供良好的力學(xué)強(qiáng)度，使得該人工硬腦膜能承受一定的縫合力，不撕裂、不脫邊，可發(fā)生形變但不至于破損；同時(shí)納米級(jí)微孔結(jié)構(gòu)也可有效防止組織粘連的發(fā)生；
3、組成中含有的三維多孔天然高分子可使得該人工硬腦膜有良好的水化特性、順應(yīng)性和粘附性，同時(shí)天然高分子自身良好的水溶特性使產(chǎn)品在臨床使用中可直接貼附使用，實(shí)現(xiàn)免縫合固定；
4、植入體內(nèi)后隨著時(shí)間延長緩慢發(fā)生降解，最終可完全降解和吸收，避免了膜片致癌的風(fēng)險(xiǎn)；
5、產(chǎn)品組成和制備工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，能實(shí)現(xiàn)高效率低成本的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
因此本發(fā)明所述的抗感染型人工硬腦膜是一種結(jié)構(gòu)新穎、性能優(yōu)越的新型醫(yī)用生物材料，在修復(fù)硬腦膜缺損領(lǐng)域顯示出了良好的應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的抗感染型可吸收人工硬腦膜的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1表示可降解聚酯纖維層，2表示殼聚糖纖維層，3表示三維多孔天然高分子。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試劑、材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1
將重均分子量為30萬的聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物溶解于六氟異丙醇中，濃度為0.08克/毫升；將相對(duì)分子量為30萬、脫乙酰度為85％的殼聚糖溶于六氟異丙醇和乙酸的混合溶液中，乙酸的體積分?jǐn)?shù)為2％，溶液濃度為0.015克/毫升；分別在室溫下攪拌后形成均一穩(wěn)定的溶液。之后將兩種溶液分別置入注射器中，注射器針頭處連接高壓電源。溶液供給流量控制在1毫升/小時(shí)，施加電壓為15千伏，高壓端同接地端的距離為15厘米，使用直徑為8厘米的旋轉(zhuǎn)滾筒作為收集裝置，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分。依次將聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物溶液和殼聚糖溶液紡絲后可收集到厚度在0.2毫米左右的雙層結(jié)構(gòu)納米纖維膜。
將雙層納米纖維膜利用乙醇和去離子水各清洗12小時(shí)，重復(fù)5次。將清洗后的雙層納米纖維膜浸泡在分子量為50萬的透明質(zhì)酸鈉溶液中，溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％，浸泡時(shí)間為12小時(shí)。之后將浸漬有透明質(zhì)酸鈉溶液的雙層納米纖維膜放置在冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干12小時(shí)，取出后滅菌并根據(jù)需要裁剪成具有特定形狀和尺寸的人工硬腦膜補(bǔ)片。
實(shí)施例2
將重均分子量為30萬的左旋聚乳酸溶解于三氯甲烷中，濃度為0.1克/毫升；將相對(duì)分子量為50萬、脫乙酰度為90％的殼聚糖溶于三氟乙醇和乙酸的混合溶液中，乙酸的體積分?jǐn)?shù)為5％，溶液濃度為0.01克/毫升；分別在室溫下攪拌后形成均一穩(wěn)定的溶液。之后將兩種溶液分別置入注射器中，注射器針頭處連接高壓電源。溶液供給流量控制在1.5毫升/小時(shí)，施加電壓為17.5千伏，高壓端同接地端的距離為12.5厘米，使用直徑為8厘米的旋轉(zhuǎn)滾筒作為收集裝置，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分。依次將左旋聚乳酸溶液和殼聚糖溶液紡絲后可收集到厚度在0.25毫米左右的雙層結(jié)構(gòu)納米纖維膜。
將雙層納米纖維膜利用乙醇和去離子水各清洗8小時(shí)，重復(fù)3次。將清洗后的雙層納米纖維膜浸泡在分子量為50萬的羧甲基殼聚糖溶液中，溶液濃度為1.5％，浸泡時(shí)間為12小時(shí)。之后將浸漬有羧甲基殼聚糖溶液的雙層納米纖維膜放置在冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干36小時(shí)，取出后滅菌并根據(jù)需要裁剪成具有特定形狀和尺寸的人工硬腦膜補(bǔ)片。
實(shí)施例3
將重均分子量為25萬的聚乳酸-乙醇酸共聚物溶解于丙酮中，濃度為0.2克/毫升；將相對(duì)分子量為70萬、脫乙酰度為95％的殼聚糖溶于三氟乙酸中，溶液濃度為0.01克/毫升；分別在室溫下攪拌后形成均一穩(wěn)定的溶液。之后將兩種溶液分別置入注射器中，注射器針頭處連接高壓電源。溶液供給流量控制在2毫升/小時(shí)，施加電壓為20千伏，高壓端同接地端的距離為20厘米，使用直徑為8厘米的旋轉(zhuǎn)滾筒作為收集裝置，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分。依次將聚乳酸-乙醇酸溶液和殼聚糖溶液紡絲后可收集到厚度在0.15毫米左右的雙層結(jié)構(gòu)納米纖維膜。
將雙層納米纖維膜利用乙醇和去離子水各清洗12小時(shí)，重復(fù)2次。將清洗后的雙層納米纖維膜浸泡在分子量為50萬的羧甲基纖維素溶液中，溶液濃度為2％，浸泡時(shí)間為8小時(shí)。之后將浸漬有羧甲基殼聚糖溶液的雙層納米纖維膜放置在冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24小時(shí)，取出后滅菌并根據(jù)需要裁剪成具有特定形狀和尺寸的人工硬腦膜補(bǔ)片。
實(shí)施例4
將重均分子量為40萬的聚對(duì)二氧環(huán)己酮溶解于六氟異丙醇中，濃度為0.15克/毫升；將相對(duì)分子量為60萬、脫乙酰度為90％的殼聚糖溶于三氟乙酸中，溶液濃度為0.012克/毫升；分別在室溫下攪拌后形成均一穩(wěn)定的溶液。之后將兩種溶液分別置入注射器中，注射器針頭處連接高壓電源。溶液供給流量控制在1.5毫升/小時(shí)，施加電壓為17.5千伏，高壓端同接地端的距離為12.5厘米，使用直徑為8厘米的旋轉(zhuǎn)滾筒作為收集裝置，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分。依次將聚乳酸-乙醇酸溶液和殼聚糖溶液紡絲后可收集到厚度在0.3毫米左右的雙層結(jié)構(gòu)納米纖維膜。
將雙層納米纖維膜利用乙醇和去離子水各清洗10小時(shí)，重復(fù)3次。將清洗后的雙層納米纖維膜浸泡在分子量為50萬的膠原蛋白溶液中，溶液濃度為2.5％，浸泡時(shí)間為12小時(shí)。之后將浸漬有羧甲基殼聚糖溶液的雙層納米纖維膜放置在冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24小時(shí)，取出后滅菌并根據(jù)需要裁剪成具有特定形狀和尺寸的人工硬腦膜補(bǔ)片。
實(shí)施例5
稱取實(shí)施例2中的人工硬腦膜樣品0.75克放入一個(gè)250毫升的三角燒瓶中，分別加入70毫升磷酸鹽緩沖液(pbs)和5毫升金黃色葡萄球菌懸液，使菌懸液在pbs中的濃度為5×104cfu/ml。將三角燒瓶固定于振蕩搖床上，以300r/min振搖1小時(shí)。取0.5毫升振搖后的樣液，以瓊脂傾注法接種平皿，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)設(shè)對(duì)照組和空白組，對(duì)照組為不含有殼聚糖成分的聚酯納米纖維膜，空白組為不加樣品的空白菌液，分別于0時(shí)間和振蕩1小時(shí)后，各取0.5毫升菌懸液與pbs的混合液做適當(dāng)稀釋，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)共重復(fù)3次，人工硬腦膜樣品組抑菌率與對(duì)照組抑菌率的差值平均值為55％，由此證明實(shí)施例2中的人工硬腦膜產(chǎn)品有抗菌作用。
實(shí)施例6
采用健康成年的新西蘭家兔20只，19月齡，體重在2.5和3.4千克之間，雌雄不限。耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉(30毫克/千克)麻醉。沿頭部正中切口縱形切開頭皮，逐層分離至顱骨骨膜，微型磨鉆在雙側(cè)顱頂部制備直徑約1.2厘米的對(duì)稱圓形骨窗，于手術(shù)顯微鏡下制備8×8mm2大小硬腦膜缺損。
將實(shí)施例2制備得到的抗感染型人工硬腦膜補(bǔ)片剪成12×12mm2尺寸，貼附在右側(cè)硬腦膜缺損區(qū)，左側(cè)不做任何處理作為空白對(duì)照。人工硬腦膜補(bǔ)片植入完畢后，將頭部皮膚縫合。在植入6個(gè)月后將動(dòng)物處死，取出硬腦膜補(bǔ)片及周圍組織，觀察其外觀形貌，檢測是否有炎癥反應(yīng)，并觀察硬腦膜重建情況，及與周圍組織是否發(fā)生粘連。術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，維持環(huán)境溫度并定時(shí)投喂飼料。
術(shù)后所有的實(shí)驗(yàn)兔保持健康，沒有明顯的癲癇等異常行為發(fā)生。切口愈合良好，手術(shù)部位無囊腫和膨出，無腦脊液漏。人工硬腦膜補(bǔ)片發(fā)生明顯降解，無炎癥反應(yīng)，與周圍組織無粘連，植入部位有一層新生的類硬腦膜結(jié)締組織生成。