本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高分子磁共振成像探針，具體涉及一種可生物降解的多聚HPMA-Gd磁共振成像探針。

背景技術(shù)：

由于核磁共振成像(MRI)具有高空間分辨率、3D圖像信息及無放射性等優(yōu)勢，已成為目前有效的腫瘤非侵入性診斷方法。據(jù)不完全統(tǒng)計，臨床上50％以上MRI腫瘤診斷需使用MRI磁共振成像探針。臨床常用的MRI磁共振成像探針包括釓噴酸葡胺(Magnevist)和釓特酸葡胺(Dotarem)。然而，它們都屬于小分子磁共振成像探針，存在敏感性低、非特異性、很快從體內(nèi)清除等缺點(diǎn)；并且主要是通過被動擴(kuò)散至腫瘤間質(zhì)或組織間質(zhì)中，導(dǎo)致很難達(dá)到滿意的成像效果。因此，更優(yōu)異的、能克服以上缺點(diǎn)的MRI磁共振成像探針具有很高的研究價值，而基于Gd(III)的納米復(fù)合物在新型磁共振成像探針的研究中展示了巨大的潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明構(gòu)建了可生物降解的多聚HPMA-Gd磁共振成像探針，是一種高效率的具生物相容性的高分子MRI磁共振成像探針，可用于臨床腫瘤診斷以及輔助治療。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種可生物降解的多聚HPMA-Gd磁共振成像探針，鏈結(jié)構(gòu)如下：

其中：m:n:o＝35～45:410～450:65～70；

本發(fā)明設(shè)計并表征了具有較高分子量、可生物降解的多聚HPMA聚合物-Gd(III)偶合物的納米體系，體系中C、B和A基團(tuán)的排列順序不定，R基團(tuán)可連接C、B和A中的任意一個。多聚HPMA(N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺)能夠結(jié)合多個小分子量Gd(III)共軛物(DOTA)從而大大提高弛豫效能，且具有無免疫性、無毒性、水溶性及良好的生物兼容性；同時，大分子量的納米材料可以延長在血液中的循環(huán)時間，增加EPR(滲透滯留效應(yīng))被動靶向的能力，提高磁共振成像探針在腫瘤部位的聚集度，從而增加腫瘤部位的成像效果及治療效果。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp RGD)的環(huán)肽cRGDyK是一種特異性腫瘤靶向短肽，本發(fā)明通過引入帶cRGDyK的R1基團(tuán)對材料進(jìn)行表面修飾，使其具有主動靶向功能。cRGDyK可以被α_vβ₃整合素特異性的識別和結(jié)合，而α_vβ₃在多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量明顯升高，但在正常組織細(xì)胞中表達(dá)較低甚至不表達(dá)。

盡管高分子量的HPMA共聚物可以提高磁共振成像探針在腫瘤部位的聚集，但是腎臟排泄閾值又要求其必須小于50kDa，否則將引起Gd中毒。由于HPMA主鏈不具有生物降解性，因此須在主鏈中引入可生物降解的基團(tuán)。本發(fā)明設(shè)計構(gòu)建了插入組織蛋白酶B底物GFLG多肽的HPMA聚合物，使其可以在溶酶體組織蛋白酶B存在的情況下被降解成小于50kDa的小片段。而溶酶體組織蛋白酶B作為一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶在多種腫瘤及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高表達(dá)。相對于傳統(tǒng)HPMA聚合物，本發(fā)明可降解的HPMA納米藥物遞送系統(tǒng)表現(xiàn)出了更高的抗腫瘤效率及生物安全性。

該磁共振成像探針的平均分子量為85-94KDa。該分子量在腫瘤微環(huán)境下，降解為分子量低于50kDa的片段，能兼顧抗腫瘤效果及生物安全性，保證降解后能夠被清除出體內(nèi)。

優(yōu)選地，其中，m:n:o＝40:443:66。為了保證水溶性的高分子具有一定的釓離子的含量(質(zhì)量百分含量一般為3-10％)，可保證有效的磁共振成像。同時，調(diào)節(jié)o值，保證cRGDyK的含量(質(zhì)量百分含量大于10％)，以便提高其腫瘤靶向性。

本發(fā)明首先通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合，將酶敏感的多肽甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(GFLG)插入多聚HPMA主鏈結(jié)構(gòu)中；并通過與Gd(III)偶聯(lián)，合成線性化的HPMA-DOTA-Gd。在此基礎(chǔ)之上，引入多肽cRGDyK使其成為具有潛在主動腫瘤靶向性的MRI磁共振成像探針HPMA-DOTA-Gd-cRGD。

本發(fā)明多聚HPMA-Gd磁共振成像探針的制備方法，當(dāng)R1＝SH時，包括以下步驟：

多聚HPMA-Gd偶聯(lián)物(pHPMA-DOTA-Gd)的合成：

1)將HPMA、MA-DOTA、pTEMA和CTA-GFLGK-CTA溶于含有VA044的去離子水/甲醇混合溶液，置于氬氣中充溢40-60分鐘，然后攪拌反應(yīng)；溶液用液氮淬滅后經(jīng)丙酮沉淀，析出吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA。

優(yōu)選地，去離子水與甲醇以4：1的體積比混合得到步驟1)中的混合溶液。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述混合溶液中含引發(fā)劑VA044，VA044的濃度是鏈轉(zhuǎn)移劑CTA-GFLGK-CTA的1/3-1/5當(dāng)量。為1/3當(dāng)量時，聚合反應(yīng)可快速完成，且分子量和PDI可獲得有效控制。通過RAFT聚合(RAFTpolymerization；可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合)制備的聚合物分子量基本可控，分子量多分散系數(shù)(PDI)低。

2)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA溶于去離子水中，加入DTT攪拌反應(yīng)，獲得中間產(chǎn)物；將中間產(chǎn)物與GdCl₃·6H₂O溶于蒸餾水中，攪拌反應(yīng)后，調(diào)節(jié)pH值，再室溫攪拌反應(yīng)后，獲得pHPMA-DOTA-Gd產(chǎn)物。

通過快速蛋白色譜柱提出，洗脫劑為水與甲醇以7：3的混合液，通過去離子水透析和冷凍干燥獲得中間產(chǎn)物；

優(yōu)選地，所述步驟2)調(diào)節(jié)pH值至5.2-5.4，保證釓離子的配位，同時保證短肽的穩(wěn)定性。

本發(fā)明還提供了多聚HPMA-Gd磁共振成像探針的另一種制備方法，當(dāng)R1不為SH時，pHPMA-DOTA-Gd-cRGD的合成包括以下步驟：

取pHPMA-DOTA-Gd溶于去離子水中，同時加入吡啶二硫改性修飾的cRGD，反應(yīng)后通過快速蛋白柱分離和透析提純，獲得pHPMA-DOTA-Gd-cRGD。

本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

1、本發(fā)明設(shè)計并表征了具有較高分子量、可生物降解的多聚HPMA聚合物-Gd(III)偶合物的納米體系，聚合物主鏈由親水和疏水嵌段構(gòu)成，并在主鏈中心引入酶敏感短肽GFLGK。Gd(III)通過可降解兩親性嵌段HPMA聚合物-Gd(III)偶聯(lián)物的方式自組裝形成納米粒子來進(jìn)行遞送。多聚HPMA能夠結(jié)合多個小分子量Gd(III)共軛物(DOTA)從而大大提高弛豫效能，且具有無免疫性、無毒性、水溶性及良好的生物兼容性；同時，大分子量的納米材料可以延長在血液中的循環(huán)時間，增加EPR被動靶向的能力，提高磁共振成像探針在腫瘤部位的聚集度，從而增加腫瘤部位的成像效果及治療效果。

2、本發(fā)明通過引入帶cRGDyK的R1基團(tuán)對材料進(jìn)行表面修飾，使其具有主動靶向功能；在主鏈中引入可生物降解的GFLGK多肽基團(tuán)，使其可以在溶酶體組織蛋白酶B存在的情況下被降解成小于50kDa的小片段，兼具高效率的腫瘤靶向性及生物相容性的納米級MRI磁共振成像探針，適用于臨床腫瘤診斷以及輔助治療等。

3、本發(fā)明的制備方法設(shè)計并通過RAFT和“點(diǎn)擊”化學(xué)構(gòu)建了功能化的pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD共軛物。首先通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合，將酶敏感的多肽甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(GFLG)插入多聚HPMA主鏈結(jié)構(gòu)中；制備的聚合物分子量基本可控，分子量多分散系數(shù)(PDI)低；并通過與Gd(III)偶聯(lián)，合成線性化的HPMA-DOTA-Gd。在此基礎(chǔ)之上，引入多肽cRGDyK使其成為具有潛在主動腫瘤靶向性的MRI磁共振成像探針HPMA-DOTA-Gd-cRGD。本發(fā)明的HPMA-Gd(III)共軛物(>90kDa)可以降解為低于腎臟閾值的低分子量產(chǎn)物(<44kDa)。與臨床上在用的二乙基三胺五乙酸-Gd(DTPA-Gd)磁共振成像探針相比，縱向弛豫效能(T1)是前者的三倍多(15.16mM^-1·s^-1/Gd)。

4、多聚HPMA-Gd磁共振成像探針的提高弛豫效能，顯著高于臨床試劑DTPA-Gd的3倍以上，在腫瘤部位的磁共振信號強(qiáng)度顯著高于臨床試劑；同時，其在腫瘤微環(huán)境下可降解為低分子量的產(chǎn)物，便于其快速排出體外，降低毒副作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明多聚HPMA-Gd(III)共軛物的合成路線圖。

圖2為pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD的¹HNMR譜圖。

圖3為A.T₁加權(quán)MRI成像結(jié)果；B.不同濃度的縱向弛豫率(1/T₁)(溶劑：PBS，1.5T)。

圖4為A.DTPA-Gd、pHPMA-DOTA-Gd或pHPMA-DOTA-Gd-cRGD(0.08mmolGd(III)/kg小鼠體重)給藥后不同時間點(diǎn)腫瘤及膀胱軸MR成像的典型代表。B.小鼠腫瘤組織相對水模的信號增強(qiáng)比率(*P﹤0.05，**P﹤0.01)。C.小鼠膀胱相對水模的信號增強(qiáng)比率(**P﹤0.001)(n＝5)。

圖5為U87移植瘤模型BALB/c裸鼠不同組織中Gd(III)含量的定量分析結(jié)果(n＝5)。

圖6為L02細(xì)胞(A)和U87細(xì)胞(B)的細(xì)胞毒性分析。

圖7為不同材料處理后紅細(xì)胞裂解情況：A.pHPMA-DOTA-Gd；B.pHPMA-DOTA-Gd-cRGD；C.不同濃度處理后紅細(xì)胞的相對溶血率(mean±SD)。

圖8為通過SEM檢測不同材料處理對紅細(xì)胞聚集和形態(tài)的影響：A.PBS對照；B.pHPMA-DOTA-Gd；C.pHPMA-DOTA-Gd-cRGD。

圖9為不同材料處理對APTT和PT的影響：A.pHPMA-DOTA-Gd；B.pHPMA-DOTA-Gd-cRGD。

圖10為分別給予PBS(A)、pHPMA-DOTA-Gd(B)和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD(C)后，不同小鼠器官組織學(xué)分析結(jié)果(100×)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1

一種可生物降解的多聚HPMA-Gd磁共振成像探針，鏈結(jié)構(gòu)如下：

其中：m:n:o＝35～45:410～450:65～70；

體系中C、B和A基團(tuán)的排列順序不定，R基團(tuán)可連接C、B和A中的任意一個。

實(shí)施例2

在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上：

其中，R1為SH，m:n:o＝35:410:65。

該磁共振成像探針的平均分子量為85KDa。

實(shí)施例3

在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上：

其中，R1不為SH，m:n:o＝45:450:70。

該磁共振成像探針的平均分子量為94KDa。

實(shí)施例4

在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上：

其中，R1不為SH，m:n:o＝40:443:66。

該磁共振成像探針的平均分子量為90KDa。

實(shí)施例5

實(shí)施例2的磁共振成像探針的制備方法，包括以下步驟：

1)將HPMA、MA-DOTA、pTEMA和CTA-GFLGK-CTA溶于含有VA044的去離子水/甲醇混合溶液，置于氬氣中充溢40-60分鐘，然后攪拌反應(yīng)；溶液用液氮淬滅后經(jīng)丙酮沉淀，析出吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA；

2)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA溶于去離子水中，加入DTT攪拌反應(yīng)，獲得中間產(chǎn)物；將中間產(chǎn)物與GdCl₃·6H₂O溶于蒸餾水中，攪拌反應(yīng)后，調(diào)節(jié)pH值，再室溫攪拌反應(yīng)后，獲得pHPMA-DOTA-Gd產(chǎn)物。

實(shí)施例6

實(shí)施例2的磁共振成像探針的制備方法，包括以下步驟：

1)將HPMA、MA-DOTA、pTEMA和CTA-GFLGK-CTA溶于含有VA044的去離子水/甲醇混合溶液，置于氬氣中充溢40-60分鐘，然后攪拌反應(yīng)；溶液用液氮淬滅后經(jīng)丙酮沉淀，析出吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA。

去離子水與甲醇以4：1的體積比混合得到步驟1)中的混合溶液；所有聚合反應(yīng)、分離提純用到的溶劑均為三類溶劑。

所述混合溶液中含引發(fā)劑VA044，VA044的濃度是鏈轉(zhuǎn)移劑CTA-GFLGK-CTA的1/3-1/5當(dāng)量。為1/3當(dāng)量時，聚合反應(yīng)可快速完成，且分子量和PDI可獲得有效控制。

2)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA溶于去離子水中，加入DTT攪拌反應(yīng)，獲得中間產(chǎn)物；通過快速蛋白色譜柱提出，洗脫劑為水與甲醇以7：3的混合液，通過去離子水透析和冷凍干燥獲得中間產(chǎn)物；該中間產(chǎn)物與GdCl₃·6H₂O溶于蒸餾水中，攪拌反應(yīng)后，調(diào)節(jié)pH值至5.2-5.4，室溫攪拌反應(yīng)后，獲得pHPMA-DOTA-Gd產(chǎn)物。

實(shí)施例7

實(shí)施例3和4的磁共振成像探針的制備方法，合成路線見圖1，在實(shí)施例5制備方法的基礎(chǔ)上：

3)取pHPMA-DOTA-Gd溶于去離子水中，同時加入吡啶二硫改性修飾的cRGD，反應(yīng)后通過快速蛋白柱分離和透析提純，獲得pHPMA-DOTA-Gd-cRGD。

實(shí)施例8

實(shí)施例3和4的磁共振成像探針的制備方法，在實(shí)施例6制備方法的基礎(chǔ)上：

3)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA-Gd溶于去離子水中，加入吡啶二硫改性cRGD攪拌反應(yīng)；通過快速蛋白色譜柱提出，洗脫劑為水與甲醇以7：3的混合液，通過去離子水透析和冷凍干燥產(chǎn)物pHPMA-DOTA-Gd-cRGD。

實(shí)驗(yàn)方法

材料和方法

偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽(VA044)購買自sigma-Adrich。單體HPMA(Eur.Polym.J.,1973,9,7-14)、MA-DOTA(ACS Appl.Mater.Interfaces,2016,8,10499-10512)、PTEMA(Bioconjug.Chem.,1998,9,749-757)、CTA-GFLGK-CTA(Biomaterials 2013,34(33),8430–8443)均按已有文獻(xiàn)制備。吡啶二硫改性cRGD的合成方法見文獻(xiàn)(ACSAppl.Mater.Interfaces,2016,8,10499-10512)。合成材料的數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)以及多分散性均采用體積排阻色譜法(SEC)進(jìn)行檢測(GE公司，系統(tǒng))，使用含30％甲醇的乙酸鈉溶液作為流動相。Zeta電位通過納米粒度及電位分析儀檢測(Malvern儀器，烏斯特郡，英國)，并采用DTS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以頻率曲線圖顯示。

二嵌段式主鏈可降解的HPMA共聚物-Gd共軛物而作為MRI磁共振成像探針，其可以通過EPR效應(yīng)增加在腫瘤部位的聚集從而提高腫瘤MR成像效果。此外，弛豫效能同樣取決于磁共振成像探針的結(jié)構(gòu)和分子量(MW)，但HPMA共聚物的主鏈不能被降解，易造成Gd累積毒性。為了提高生物安全性，本發(fā)明通過HPMA單體、MA-DOTA及PTEMA的RAFT聚合化將一種酶促降解的寡肽(GFLGK)引入線性主鏈中(如圖1)。

pHPMA-DOTA-Gd的合成

將HPMA(1.16g,8.13mmol)、MA-DOTA(1.61g,3.13mmol)、PTEMA(635mg,2.5mmol)和CTA-GFLGK-CTA(23.7mg,22.7μmol)溶于含有VA044(5.0mg,15.4μmol)的去離子水/甲醇(4:1,10mL)溶液，置于0℃氬氣中充溢50分鐘，然后轉(zhuǎn)至44℃攪拌12小時。溶液用液氮淬滅后經(jīng)丙酮沉淀，獲得帶有一些粉紅色的固體。用水透析24小時后冷凍干燥，獲得了帶有輕微粉紅色的吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA(60％純度，2.06g)。

在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將粉紅色固體(2.0g)溶于20mL去離子水中，加入DTT(200mg，1.3mmol)攪拌8小時。粗產(chǎn)物經(jīng)過排阻色譜純化(系統(tǒng)，Superose 6HR10/30；流動相為緩沖液/甲醇＝7:3，pH 6.5；流速：2.5mL/分鐘)。然后，水透析24小時并冷凍干燥，獲得白色產(chǎn)物(1.69g)，硫醇基含量通過已有文獻(xiàn)報道的方法進(jìn)行檢測(ACS Appl.Mater.Interfaces,2016,8,10499-10512)。

在RAFT聚合中，本發(fā)明使用了酶響應(yīng)多肽GFLGK功能化的鏈轉(zhuǎn)移劑(CTA-GFLGK-CTA)，共聚物的MW和PDI均得到很好的控制。將吡啶二硫改性產(chǎn)物pHPMA-DOTA與DTT反應(yīng)，使其帶有硫醇基團(tuán)，每種產(chǎn)物的硫醇基含量為0.66mmol/g(表2)。產(chǎn)物顏色為粉紅色。在1H核磁共振波譜的峰值7.31-7.71ppm。

將1.5g白色產(chǎn)物與GdCl₃·6H₂O(1.48g,4.0mmol)溶于30mL蒸餾水中，攪拌15小時并使用0.1MNaOH調(diào)節(jié)pH值直至5.2-5.4范圍內(nèi)。室溫攪拌15小時。然后，水透析20小時并冷凍干燥，獲得白色pHPMA-DOTA-Gd產(chǎn)物(1.46g)。通過前述氨基酸分析方法檢測GFLGK多肽的含量(ACS Appl.Mater.Interfaces,2016,8,10499-10512)，并通過電感耦合等離子體質(zhì)譜分析(ICP-MS)得出產(chǎn)物中Gd(III)的含量為6.5％，pHPMA-DOTA-Gd的¹H NMR波譜圖見圖2A。

pHPMA-DOTA-Gd-cRGD的合成:

取800mgpHPMA-DOTA-Gd溶于乙酸鈉溶液(pH 6.5,8mL)，同時加入400mg吡啶二硫改性修飾的cRGD，室溫攪拌20小時。粗產(chǎn)物經(jīng)過SEC法純化(系統(tǒng)，GE醫(yī)療):Superose 6HR10/30預(yù)裝柱裝載含30％甲醇(pH6.5)的乙酸鈉溶液作為流動相(流動率：2.5mL/min)。然后，經(jīng)過24小時的水透析及冷凍干燥，獲得785mg白色產(chǎn)物。通過氨基酸分析方法檢測GFLGK和cRGDyK多肽的含量，硫醇基含量為0.10mmol/g，經(jīng)ICP-MS檢測，其中Gd(III)含量為4.0％(表2)，pHPMA-DOTA-Gd-cRGD的¹H NMR譜圖見圖2B。表1.pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD共軛物的氨基酸組成，相對氨基酸含量按所占樣品質(zhì)量的百分比表示。

表2.pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD的組成分析。

表明芳香環(huán)質(zhì)子的存在(圖2A)，也預(yù)示著GFLG多肽的兩個硫代苯甲酸酯基團(tuán)及苯丙氨酸殘渣中含有芳基。與GdCl₃·6H₂O反應(yīng)后，獲得白色產(chǎn)物pHPMA-DOTA-Gd。釓共軛物通過ICP-MS進(jìn)行鑒定，其中釓含量為總質(zhì)量的6.5％。甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸的含量分別為總質(zhì)量的0.17％、0.18％、0.14％和0.17％(表1)，而摩爾比十分接近于2：1：1：1，表明GFLGK成功引入到主鏈當(dāng)中，并且在二嵌段可生物降解HPMA-Gd共軛物的整個制備過程中穩(wěn)定存在。

為了增強(qiáng)聚合物MRI磁共振成像探針在腫瘤部位的聚集，本發(fā)明通過硫醇基與硫醇-二硫化物的交換反應(yīng)，將吡啶二硫改性的環(huán)肽cRGDyK與pHPMA-DOTA共聚物進(jìn)行偶聯(lián)。而cRGDyK可以特異性識別腫瘤血管中活化內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)的α_vβ₃整合素。因此，cRGDyK修飾的共軛物pHPMA-DOTA-Gd-cRGD將作為一種主動靶向的MRI磁共振成像探針。共軛物通過FPLC系統(tǒng)進(jìn)行純化和透析，有效去除小分子化合物及副產(chǎn)物。功能化的共軛物通過硫醇基、氨基酸分析及¹H核磁共振波譜進(jìn)行鑒定。相較于pHPMA-DOTA，pHPMA-DOTA-Gd-cRGD ¹H核磁共振波譜含有更多位于4.44、4.55、6.88、7.16及7.04 ppm的峰(圖2B)。4.44和4.55 ppm峰表明cRGDyK氨基酸中手性氫原子(α-H)的存在，7.16和7.04 ppm所代表的的芳環(huán)質(zhì)子可歸于cRGDyK中酪氨酸所含的芳環(huán)質(zhì)子。共軛物中硫醇基的含量為0.10 mmol/g,明顯低于pHPMA-DOTA-Gd(0.66 mmol/g)。此外，根據(jù)氨基酸的含量(表1)，精氨酸、天冬氨酸及色氨酸的摩爾比接近1：1：1，共軛物中氨基酸占總質(zhì)量的百分比為22.74％。然而，pHPMA-DOTA-Gd的總氨基酸含量僅為0.66％。pHPMA-DOTA-Gd-cRGD硫醇基含量減少、¹HNMR波譜出現(xiàn)更多的峰(4.44、4.55、6.88、7.16及7.04ppm)以及氨基酸含量的升高表明，通過硫醇-二硫化物交換，本發(fā)明成功將cRGDyK多肽偶聯(lián)到pHPMA-DOTA-Gd共聚物之中。cRGDyK含量占總質(zhì)量的22％，釓含量占總質(zhì)量的4％。

本發(fā)明對多聚HPMA-Gd磁共振成像探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測：

一、生物降解性研究

本發(fā)明采用溶酶體組織蛋白酶B和具有相似活性的木瓜蛋白酶來研究材料的生物降解性，不含酶的PBS作為陰性對照。將pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD溶于含有4mM木瓜蛋白酶或2.4mM組織蛋白酶B的McIlvaine's緩沖液(3mg/mL，50mM檸檬酸鹽/0.1M磷酸鹽，2mM EDTA，2mM谷胱甘肽，pH＝5.4)，37℃孵育24小時，然后通過SEC(系統(tǒng)，GE醫(yī)療)對樣本的降解性進(jìn)行檢測，Superose 6HR10/30預(yù)裝柱裝載含30％甲醇(pH6.5)的乙酸鈉溶液作為流動相(流動率：0.4mL/min)。

為了提高弛豫效能及腫瘤部位的聚集，需要提高釓共軛物的分子量。pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD的分子量分別為85kDa和94kDa。此外，為了滿足腎臟排泄的需要，腎閾值又要求分子量更低。因此，可生物降解的多肽被引入到兩種共軛物的主鏈結(jié)構(gòu)中。在組織蛋白酶B存在的情況下，兩種共軛物能夠降解成低分子量的片段。與組織蛋白酶B共孵育8小時后，線性化的共聚物主鏈已完全降解為低分子量產(chǎn)物(小于43kDa)(表3)，而這一大小低于腎閾值(50kDa)。這一降解性歸因于組織蛋白酶B可以切開GFLGK多肽。然而，兩種共軛物在PBS中可以穩(wěn)定存在(pH 7.4，37℃)，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的降解性。無酶條件下不可降解而在腫瘤微環(huán)境中快速的生物降解揭示HPMA共軛物可以在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在，而一旦到達(dá)腫瘤部位完成作為MRI對比劑的任務(wù)就會發(fā)生降解，從而保證他們的有效清除和生物相容性。

表3.pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD的分子量和PDI，以及其降解隨時間變化的分析。

二、體外馳豫效能研究

將DTPA-Gd、pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD分別溶解于0.1M PBS中，制備成不同Gd(III)濃度的溶液(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6and 0.7mM)。隨后，使用1.5T臨床磁共振掃描儀(西門子)對樣本進(jìn)行自旋-點(diǎn)陣馳豫時間(T₁)加權(quán)MRI檢測。參數(shù)設(shè)置：TE＝8.7ms；TR＝25、30、50、70、90、110、150、170、190、210、250、300、400、600、700及800ms；視野(FOV)＝200mm；層面厚度＝2.0mm；矩陣尺寸＝256×256。用不同濃度梯度樣本的縱向弛豫率[1/T₁(s^-1)]與Gd(III)濃度作圖，其斜率代表r1值。

圖3A顯示的是獲得的不同濃度Gd(III)共軛物在1.5T MR掃描儀上T₁加權(quán)MR成像結(jié)果。與臨床上使用的DTPA-Gd相比，本發(fā)明制備的共軛物在相同Gd(III)濃度下具有更高的均勻增強(qiáng)信號。圖3B是根據(jù)1/T1(s^-1)與Gd(III)濃度制作的曲線。pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD共軛物的r₁值分別是13.91mM^-1·s^-1/Gd(III)和15.16mM^-1·s^-1/Gd(III)，均高于DTPA-Gd(3.98mM^-1·s^-1/Gd(III))3倍以上。根據(jù)Solomon-Bloembergen-Morgan理論可以很好的解釋這一結(jié)果：由于旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間τ_R直接與大小相關(guān)，通過將低分子量的順磁性Gd(III)共軛物與共聚物結(jié)合可以獲得更高的弛豫率。兩個材料1/T1(s^-1)值均成線性說明本發(fā)明的材料在水溶液中具有較高的溶解性和穩(wěn)定性。此外，cRGD修飾后的共軛物與pHPMA-DOTA-Gd相比表現(xiàn)出更高的r₁值，這可能是因?yàn)閜HPMA-DOTA-Gd-cRGD的分子量更高。以上特性及較高的弛豫率預(yù)示著本發(fā)明制備的材料在體內(nèi)可成為有效的MRI磁共振成像探針。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)動物

U87細(xì)胞(人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞)和L02細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞)購買自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。兩種細(xì)胞均使用含10％胎牛血清(Hyclone)及1％青霉素/鏈霉素(Hyclone)的RPMI1640培養(yǎng)基，放置于37℃、含5％CO2的飽和濕度孵育箱培養(yǎng)。雌性BALB/c裸鼠購買自成都達(dá)碩生物科技有限公司，6-8周齡，體重約20g。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照四川大學(xué)動物管理委員會的要求執(zhí)行。

1、體內(nèi)MRI成像研究

本發(fā)明使用一臺3.0T成像系統(tǒng)(西門子Sonata醫(yī)療系統(tǒng))進(jìn)行小鼠體內(nèi)對比增強(qiáng)MRI研究。簡言之，將U87細(xì)胞(1×10⁷個細(xì)胞溶于200μL PBS)接種于BALB/c裸鼠的背部右下側(cè)皮下。待移植的U87人惡性腦膠質(zhì)瘤直徑達(dá)到3-5mm，將小鼠隨機(jī)分為三組，每組5只，分別注射DTPA-Gd、pHPMA-DOTA-Gd及pHPMA-DOTA-Gd-cRGD(0.08mmol Gd(III)/kg小鼠體重)。戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將其置于MRI掃描儀定制的小鼠線圈中進(jìn)行信號傳遞及檢測。T₁加權(quán)成像變量設(shè)置如下：TR/TE＝450/11ms，層面＝11，立體尺寸＝0.2×0.2×1.5mm³，F(xiàn)OV＝51mm。分別采集了不同時間點(diǎn)(注射前，注射后10分鐘、30分鐘、1小時、3小時、19小時及24小時)的目的區(qū)域信號相關(guān)增強(qiáng)變化。結(jié)果使用信噪比表示(△SNR)：△SNR_T＝SI(腫瘤)/SI(水模)，△SNR_B＝SI(膀胱)/SI(水模)；其中，SI(腫瘤)、SI(膀胱)及SI(水模)分別代表腫瘤、膀胱及水模的信號強(qiáng)度。

取不同時間點(diǎn)(注射前到注射后24小時)用3.0T MR掃描儀進(jìn)行檢測(圖4A)。注射后10分鐘時，使用DTPA-Gd造影的腫瘤組織與正常組織及水模相比僅有輕微的信號改變，并且信號增強(qiáng)不到30分鐘就會衰退。相反，使用本發(fā)明制備的HPMA-Gd共軛物進(jìn)行造影的小鼠腫瘤組織具有更高的信號增強(qiáng)，從注射后10分鐘開始一直可以持續(xù)到24小時。此外，共軛物造影可以更好地界定正常組織與疾病組織間的邊界，這一點(diǎn)對于腫瘤診斷和治療至關(guān)重要。

隨后使用相對增強(qiáng)的MR成像信號強(qiáng)度(SI)，即環(huán)繞腫瘤部位與放置于旁邊的水模的信號差值，進(jìn)一步定量分析了腫瘤組織的對比增強(qiáng)。用MRI SI相對增強(qiáng)的平均值與時間作圖(圖4B)。DTPA-Gd組的最高值(183％)出現(xiàn)在處理后的10分鐘，之后逐漸下降，直至處理后3小時恢復(fù)成與注射前相當(dāng)(149％)。SI的迅速下降可能與其較短的體內(nèi)循環(huán)時間以及被快速清除有關(guān)。相反，使用pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD進(jìn)行造影的腫瘤組織在注射后10分鐘時具有更高的SI值，并且SI值仍會繼續(xù)升高，分別達(dá)到200％和240％。pHPMA-DOTA-Gd組的高SI值可以從注射后10分鐘一直持續(xù)到注射后19小時，pHPMA-DOTA-Gd-cRGD組的維持時間更長至注射后24小時。

對于多聚共軛物的信號增強(qiáng)可以達(dá)到24小時的原因，可能是由于循環(huán)時間的延長和較高的腫瘤聚集兩方面原因。對于小鼠膀胱SI信號增強(qiáng)的研究結(jié)果是這一結(jié)論的有力證據(jù)。DTPA-Gd組膀胱SI增強(qiáng)的最高點(diǎn)出現(xiàn)在注射后10分鐘，然后在10到30分鐘迅速下降(圖4C)。因此，可以判定DTPA-Gd的腎排泄在注射后幾分鐘之內(nèi)就開始了，這就解釋了為什么腫瘤成像的造影效果很差。相反，共軛物組的膀胱SI信號增強(qiáng)可以從注射后30分鐘維持到3小時，暗示著較慢的腎臟排泄以及較長的循環(huán)時間，究其原因是高的分子量介導(dǎo)的EPR效應(yīng)使共軛物聚集在腫瘤部位。有趣的是，pHPMA-DOTA-Gd-cRGD相對于pHPMA-DOTA-Gd和DTPA-Gd具有更高及更長時間的SI增強(qiáng)，這一現(xiàn)象可能是由于cRGD多肽與α_vβ₃整合素的特異性結(jié)合引起的，并且這種結(jié)合更加穩(wěn)定，進(jìn)一步促進(jìn)了共軛物在腫瘤組織的聚集從而延長了循環(huán)時間。

2、共軛物納米系統(tǒng)的組織分布

U87荷瘤小鼠隨機(jī)分成3組(每組7只)，分別注射DTPA-Gd、pHPMA-DOTA-Gd及pHPMA-DOTA-Gd-cRGD(0.08mmolGd(III)/kg小鼠體重)進(jìn)行MRI對比增強(qiáng)成像研究，注射后24小時處死小鼠。取心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟及腫瘤組織進(jìn)行稱重，并用1mL H₂O₂和3mL HNO₃消化，樣本在120℃處理48小時。樣本的Gd(III)含量通過ICP-MS進(jìn)行測量，數(shù)據(jù)采用所占每克小鼠的注射劑量的百分比表示。

圖5顯示，本發(fā)明制備的納米系統(tǒng)相較于DTPA-Gd在腫瘤組織具有更高的Gd(III)滯留量(p<0.01)。這一結(jié)果與體內(nèi)MR成像結(jié)果相一致。

pHPMA-DOTA-GdP和HPMA-DOTA-Gd-cRGD的腫瘤組織積累分別比DTPA-Gd組高出13倍和44倍。不難看出，cRGD多肽介導(dǎo)的配體特異性結(jié)合在共軛物的腫瘤組織聚集及殘留中起了重要作用。此外，肝臟及脾臟中存在較高濃度的釓也確證了共聚物在體內(nèi)具有更長的循環(huán)時間。這也提示磁共振成像探針的排泄路徑及可能引起毒性的靶器官。

3、細(xì)胞毒性分析

采用CCK-8(同仁化學(xué)，日本)試劑盒進(jìn)行三種材料的體外細(xì)胞毒性分析。將U87和L02細(xì)胞分別接種96孔板(5×10³個/孔)，培養(yǎng)24小時后，換成分別含有不同濃度DTPA-Gd、pHPMA-DOTA-Gd或pHPMA-DOTA-Gd-cRGD的培養(yǎng)基(Gd(III)濃度：50、100、250及500nmol/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。PBS洗3次，每孔加入100μL CCK-8試劑(10μL原液：90μL RPMI1640培養(yǎng)基)。孵育2小時后，通過VarioscanFlash酶標(biāo)儀(Thermo Fisher科技，美國)檢測450nm的吸光度。未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為100％活性細(xì)胞對照。

圖6A顯示，經(jīng)過不同濃度DTPA-Gd、pHPMA-DOTA-Gd或pHPMA-DOTA-Gd-cRGD處理48小時后的L02細(xì)胞活性沒有明顯改變(Gd(III)含量：50-500nmol/mL)。然而，pHPMA-DOTA-Gd和pHPMA-DOTA-Gd-cRGD兩者均表現(xiàn)出對U87細(xì)胞活性的劑量依賴性抑制作用(圖6B)。這可能與HPMA共聚物與U87細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。U87細(xì)胞高表達(dá)α_vβ₃和α_vβ₅整合素，而cRGD靶向α_vβ₃和α_vβ₅整合素，提高了細(xì)胞對磁共振成像探針的吞噬量，由于釓離子的毒性等引發(fā)了癌細(xì)胞的凋亡。值得注意的是，較低濃度的共軛物(Gd(III)﹤50nmol/mL)處理U87細(xì)胞沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。

pHPMA-Gd共軛物體外生物相容性評估：

1、溶血分析

將健康人體新鮮血液使用PBS稀釋后(16％v/v，300μL)，分別與1mg/mL、3mg/mL或5mg/mL的不同材料共同在37℃孵育12小時，然后1000g離心10min，取200μL上層液至96孔板，通過VarioscanFlash酶標(biāo)儀測量540nm的吸光度。血液樣品溶于蒸餾水及PBS分別作為100％溶血及陰性對照。

紅細(xì)胞溶血根據(jù)美國材料試驗(yàn)協(xié)會(ASTM)標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明制備的磁共振成像探針均具有較高的血液相容性(紅細(xì)胞溶血﹤5％)(圖7)，較高濃度下(5mg/mL)材料組與PBS對照組相比溶血率依然沒有明顯差異。這其中共軛物所具有的合適分子量、親水性質(zhì)及表面負(fù)電荷等卓越特性保護(hù)了紅細(xì)胞胞膜免受磁共振成像探針的破壞，使之具有血液相容性。

紅細(xì)胞聚集和形態(tài) 本發(fā)明通過SEM方法進(jìn)一步評估了高濃度實(shí)驗(yàn)磁共振成像探針(5mg/mL)處理后紅細(xì)胞有無聚集和形態(tài)改變。圖8顯示，與PBS對照組類似，共軛物處理后紅細(xì)胞依然保持著單分散的正常雙凹形態(tài)及光滑的表面。根據(jù)已有文獻(xiàn)，材料處理后紅細(xì)胞的溶血、聚集及形態(tài)改變通常與靜電相互作用、親水及疏水基團(tuán)的分布和高分子量聚合物的聚集性等有關(guān)。幸運(yùn)的是，經(jīng)過精心設(shè)計，本發(fā)明制備的磁共振成像探針兼具表面負(fù)電荷、親水基團(tuán)以及合適的分子量，從而對紅細(xì)胞具有很好的生物相容性。

2、凝血分析

采集健康人體新鮮血液，離心收集乏血小板血漿。取360μL血漿分別與三種不同材料(40μL)混合。活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)通過全自動凝血分析儀檢測。每個濃度做3個平行組。等體積的PBS作為對照。

如圖9所示，本發(fā)明制備的磁共振成像探針即使在較高的濃度下(5mg/mL)依然具有與PBS對照組相似的APTT和PT。這表明本發(fā)明的材料對血液凝集因子沒有明顯的影響，歸因于HPMA共聚物主鏈的親水性。

3、血栓彈力圖(TEG)

抽取健康人體新鮮血液與不同材料混合(血液：材料＝9：1，1mL)使納米材料的最終濃度為0.1mg/mL和1mg/mL。將混合物加入到含有高嶺土的特制管中。取340μL上清液與20μL的CaCl₂(0.2M)加入到測樣杯中，通過血栓彈力圖儀(Haemoscope公司)進(jìn)行測試。等體積PBS作為對照。

不同實(shí)驗(yàn)材料處理的全血均與對照組相類似。不同組間R、K值、α角和MA均無明顯差異。所有這些均證明本發(fā)明的磁共振成像探針(5mg/mL)不影響血液凝集過程，這都?xì)w因于精心設(shè)計的共軛物具有的合適分子量、親水性以及表面負(fù)電荷。綜上所述，可以確定制備的HPMA-Gd(III)共軛物是安全且血液相容的。

四、體內(nèi)毒性研究

體外毒性研究僅僅是體內(nèi)研究的前提，只有經(jīng)過體內(nèi)安全性驗(yàn)證后，磁共振成像探針才可以應(yīng)用于臨床。本發(fā)明采用健康的BALB/c小鼠進(jìn)行研究，具體操作詳見方法部分。本發(fā)明通過對動物的行為、體重、血液學(xué)及組織學(xué)分析對磁共振成像探針的體內(nèi)毒性進(jìn)行了全面評估。經(jīng)過為期19天的研究，本發(fā)明沒有發(fā)現(xiàn)任何脫水、運(yùn)動障礙、肌肉萎縮、厭食或者其他與動物毒性相關(guān)的現(xiàn)象。同時，共軛物納米系統(tǒng)給藥后的小鼠具有與GTPA-Gd組相似的體重變化。沒有發(fā)現(xiàn)其他異?，F(xiàn)象。

為了進(jìn)一步研究其他潛在毒性或明顯的副作用，本發(fā)明對實(shí)驗(yàn)動物的紅細(xì)胞、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、血小板、血小板平均體積及白細(xì)胞等進(jìn)行了檢測。與對照組相比，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。這一結(jié)果表明，共軛物納米系統(tǒng)在血液中與體外研究一致，同樣具有生物相容性。為了研究組織或器官毒性，本發(fā)明對主要器官和組織進(jìn)行了組織學(xué)分析。圖10顯示了心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟五大主要器官均是正常的，不存在組織病理學(xué)上認(rèn)為的異常、退化或損傷。因此，本發(fā)明認(rèn)為制備的共軛物具有很好的生物相容性和安全性，這其中pHPMA-Gd(III)共軛物精心設(shè)計的結(jié)構(gòu)和可生物降解的特性必然起到了重要的作用。

統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用mean±SD表示。各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性采用ANOVA及Student's雙側(cè)t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計分析，P﹤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。