本發(fā)明涉及光學(xué)分子成像領(lǐng)域，具體涉及熒光探針領(lǐng)域，特別涉及一種TEM1特異性熒光探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，光學(xué)成像以其非侵襲性、實(shí)時(shí)、分辨率高等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究領(lǐng)域，可對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷，反映腫瘤解剖學(xué)結(jié)構(gòu)及代謝情況。吲哚氰綠(IndoCyanine Green，ICG)是最常見(jiàn)的傳統(tǒng)的非特異性熒光探針，主要應(yīng)用于臨床的視網(wǎng)膜血管造影和肝臟功能測(cè)定。但是，ICG可以與大部分的清蛋白非特異性的結(jié)合，因此極大的限制了其在臨床診斷中的作用。

卵巢癌是一種女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，死亡率高居?jì)D科癌癥首位，由于其發(fā)病隱蔽，臨床癥狀、體征不典型，目前缺乏有效的早期診斷方法。新近發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(TEM)，其在正常組織中少量表達(dá)或不表達(dá)，能夠成為良好的腫瘤標(biāo)志物。研究證明內(nèi)皮唾液酸蛋白(TEM1/endosialin/CD248)在卵巢癌組織中高表達(dá)，與體內(nèi)其他器官差異明顯。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種TEM1特異性熒光探針，其包括抗TEM1單鏈抗體、連接子MAL-PEG-NH₂和熒光染料ICG-NHS，其中，所述熒光染料ICG-NHS通過(guò)酰胺鍵與連接子MAL-PEG-NH₂連接，所述抗TEM1單鏈抗體的C末端為半胱氨酸，并通過(guò)硫醚鍵與連接子MAL-PEG-NH₂連接。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗TEM1單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗TEM1單鏈抗體由SEQ ID NO.2所示的核酸序列編碼。

在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述連接子MAL-PEG-NH₂中，PEG分子量為10K。

在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述TEM1特異性熒光探針的親和系數(shù)為6-10nM，優(yōu)選7-9nM。

本發(fā)明還提供了TEM1特異性熒光探針在制備診斷卵巢癌的試劑中的用途。

本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含所述的TEM1特異性熒光探針和藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包含所述的TEM1特異性熒光探針。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“試劑盒”包括本發(fā)明的TEM1特異性熒光探針和使用說(shuō)明書(shū)。該試劑盒能進(jìn)一步包含至少一種另外的試劑。試劑盒通常包括一個(gè)標(biāo)簽，簡(jiǎn)要地說(shuō)明了試劑盒內(nèi)容的目的用途。

本發(fā)明提供的TEM1特異性熒光探針特異性好，靈敏度高，無(wú)細(xì)胞毒性，由于抗TEM1單鏈抗體的分子量較小，其在血清中易于清除，并且免疫原性較小，在體內(nèi)不易引發(fā)特異性反應(yīng)；另外，本發(fā)明的TEM1特異性熒光探針還具有干擾小、穿透力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，適于臨床應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為構(gòu)建質(zhì)粒的克隆驗(yàn)證的結(jié)果；

圖2為各表達(dá)菌株超聲破碎后的SDS-PAGE結(jié)果；

圖3為不同批次復(fù)性的包涵體蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；

圖4為ELISA檢測(cè)抗TEM1單鏈抗體親和力的結(jié)果；

圖5為78C-PEG-ICG合成示意圖；

圖6為ELISA檢測(cè)78C-PEG-ICG親和力的結(jié)果；

圖7為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)78C-PEG-ICG特異性的結(jié)果；

圖8為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)78C-PEG-ICG內(nèi)吞能力的結(jié)果；

圖9為78C-PEG-ICG內(nèi)吞能力的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果；

圖10為78C-PEG-ICG蛋白電泳檢測(cè)的結(jié)果；

圖11為應(yīng)用近紅外成像檢測(cè)78C-PEG-ICG的特異性和靈敏度的結(jié)果；

圖12為用78C-ICG、78C-PEG-ICG或IgG-ICG通過(guò)尾經(jīng)脈注射小鼠48小時(shí)后的活體成像結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行描述，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1載體構(gòu)建與抗TEM1單鏈抗體的表達(dá)、純化與復(fù)性

編碼抗TEM1單鏈抗體的核酸其序列如SEQ ID NO.2所示，3’末端是編碼半胱氨酸(Cys)的密碼子，用限制性?xún)?nèi)切酶Nsi I/Xho I將其克隆到PET302載體上，構(gòu)建成一個(gè)完整的質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪板并過(guò)夜培養(yǎng)。待平板上長(zhǎng)出菌落后提取質(zhì)粒，用外源基因上的一個(gè)引物與載體上的另一個(gè)引物進(jìn)行PCR，克隆驗(yàn)證的結(jié)果如圖1所示，除了2號(hào)克隆沒(méi)有特異性的條帶之外，其他克隆均有特異性條帶出現(xiàn)。測(cè)序結(jié)果也證明載體構(gòu)建成功。

將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21D3，鋪板并過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落，用5ml LB培養(yǎng)基重懸，并置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。按1:100的比例將上述5ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到裝有500ml LB培養(yǎng)基的燒瓶?jī)?nèi)，置于37℃搖床中培養(yǎng)2小時(shí)。按1:1000的比例加入IPTG誘導(dǎo)(計(jì)算得到IPTG終濃度為1mM)作為誘導(dǎo)組，設(shè)置未加IPTG的對(duì)照組，37℃培養(yǎng)2小時(shí)。4℃條件下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集菌體。用40ml EQ緩沖液洗滌一次，并用40ml含8M尿素的EQ緩沖液將菌體配成懸液。將菌體懸液的容器置于冰浴中，采用超聲波破碎，設(shè)置功率40％，破碎時(shí)間1秒，間歇時(shí)間2秒，運(yùn)行6分鐘，超聲后的對(duì)照組菌液作為誘導(dǎo)前總蛋白(Before)，超聲后的誘導(dǎo)組菌液作為誘導(dǎo)后總蛋白(Total)。4℃條件下以最大轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集上清(Soluble)和菌體。分別取10μl Before、Total和Soluble進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖2，可以看出Total里面有大量的誘導(dǎo)蛋白存在，而Soluble中卻沒(méi)有相應(yīng)的蛋白，證明誘導(dǎo)蛋白以包涵體形式存在。因此按以下步驟進(jìn)行包涵體純化和復(fù)性。

用PBS重懸菌體，加入3ml磁珠液(預(yù)先用10ml EQ緩沖液清洗磁珠)，4℃條件下結(jié)合2小時(shí)。用20ml含8M尿素的清洗液洗滌磁珠2次。用3ml含8M尿素的洗脫液洗滌2次，將目的蛋白78C洗脫下來(lái)。將2次洗滌后的洗脫液合并共6ml，用含8M尿素的EQ緩沖液定容至25ml。4℃條件下，將上述25ml懸液放置于1L PBS緩沖液中透析過(guò)夜。將不同批次復(fù)性的包涵體蛋白(1-12批)進(jìn)行SDS-PAGE，上樣量為5μl或10μl。結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)蛋白純度較高，幾乎沒(méi)有雜質(zhì)存在。利用Millipore公司50ml濃縮管的對(duì)蛋白懸液濃縮離心，將蛋白濃度濃縮至1mg/ml。

實(shí)施例2ELISA檢測(cè)抗TEM1單鏈抗體的親和力

用2％明膠為96孔板鋪板，每孔50μl。37℃下孵育30至60分鐘。將MS1-TEM1細(xì)胞(轉(zhuǎn)染了TEM1質(zhì)粒能夠高表達(dá)TEM1蛋白的小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞)加入96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為10⁴-10⁵。37℃培養(yǎng)過(guò)夜。利用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入合適濃度(0.0001nM、0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1mM、10mM)的抗TEM1單鏈抗體，4℃條件下孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次。加入抗His-HRP二抗，4℃條件下孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入100μl TMB液，37℃條件下孵育時(shí)間不超過(guò)30分鐘。每孔加入100μl終止液，利用bioteck比色儀檢測(cè)OD值。圖4顯示了抗TEM1單鏈抗體的親和力檢測(cè)結(jié)果，可見(jiàn)抗TEM1單鏈抗體具有極高的親和力，親和常數(shù)達(dá)到3.941nM。

實(shí)施例3熒光染料ICG與抗TEM1單鏈抗體的結(jié)合(78C-PEG-ICG)

文獻(xiàn)報(bào)道ICG與抗體結(jié)合的時(shí)會(huì)出現(xiàn)淬滅的現(xiàn)象，本發(fā)明創(chuàng)新性地引入一個(gè)連接子(linker)，使染料與抗體之間存在一定的距離，從而避免熒光染料的淬滅。Linker為兩端分別含有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)(MAL)和氨基基團(tuán)(NH₂)的聚乙二醇(PEG)，簡(jiǎn)寫(xiě)為MAL-PEG-NH₂。位于抗TEM1單鏈抗體尾段的半胱氨酸(cys)會(huì)和linker上的MAL基團(tuán)特異性結(jié)合，而linker上的氨基和熒光染料上的NHS基團(tuán)特異性結(jié)合，從而將抗TEM1單鏈抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)78C)與熒光染料結(jié)合，形成一個(gè)特異性針對(duì)TEM1的ICG熒光體系。圖5為上述反應(yīng)流程的示意圖。具體步驟如下：

按照每2mg熒光染料吲哚氰綠-氮羥基琥珀酰亞胺酯(簡(jiǎn)稱(chēng)ICG-NHS)對(duì)應(yīng)1mg PEG的比例，混合ICG-NHS和MAL-PEG-NH₂，其中ICG-NHS由DMSO稀釋到終濃度4mg/ml，MAL-PEG-NH₂由水稀釋到終濃度2mg/ml?；旌弦涸谑覝叵戮徛鹗幓旌?小時(shí)。脫鹽柱預(yù)先用水清洗，以1000g的轉(zhuǎn)速離心2分鐘。將混合液緩慢注入脫鹽柱中，以1000g的轉(zhuǎn)速離心2分鐘，將過(guò)量的ICG-NHS清除，即得到ICG-PEG。將500μg 78C加入上述ICG-PEG中，室溫下緩慢震蕩結(jié)合2小時(shí)，或者4℃結(jié)合過(guò)夜。用30KD的濃縮管，洗滌并純化，即得78C-PEG-ICG。經(jīng)換算，ICG:PEG:78C的摩爾比是200:10:1。

實(shí)施例4ELISA檢測(cè)78C-PEG-ICG的細(xì)胞親和力

應(yīng)用Sigma公司的ELISA試劑盒對(duì)合成的78C-PEG-ICG的細(xì)胞親和力進(jìn)行檢測(cè)。用2％明膠為96孔板鋪板，每孔50μl。37℃下孵育30至60分鐘。將MS1-TEM1細(xì)胞加入96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為10⁴-10⁵。37℃培養(yǎng)過(guò)夜。利用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入合適濃度(10^-5nM、10^-4nM、10^-3nM、10^-2nM、10^-1nM、1nM、10nM、10²nM、10³nM、10⁴nM)的抗體，4℃條件下孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次。加入抗His-HRP二抗，4℃條件下孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入100μl TMB，37℃條件下孵育時(shí)間不超過(guò)30分鐘。每孔加入100μl終止液，利用bioteck比色儀檢測(cè)OD值。

由圖6可以看出，結(jié)合了染料的78C的親和力并沒(méi)有受到很大影響，親和系數(shù)高達(dá)8.091nM，這為之后特異性識(shí)別抗原提供了基礎(chǔ)。

實(shí)施例5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)78C-PEG-ICG的特異性

在細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入6ml維爾烯(versene)溶液，37℃下消化10分鐘。加入6ml的細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco 1640)重懸細(xì)胞，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。用7ml流式緩沖液(FACS緩沖液)重懸細(xì)胞，緩慢吹打混勻，按每管1ml分裝入7只流式管中。每管加入2ml流式緩沖液混勻后，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。加入100μl用流式緩沖液稀釋的濃度為50mM的78C-PEG-ICG。4℃條件下孵育結(jié)合1小時(shí)(4℃為避免78C-PEG-ICG被細(xì)胞內(nèi)吞)。加入3ml流式緩沖液混勻，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。再次用3ml流式緩沖液洗滌2次。每管加入100μl的鼠源His抗體，4℃條件下孵育結(jié)合1小時(shí)。加入3ml流式緩沖液洗滌2次。每管加入100μl的鼠源APC抗體，4℃條件下孵育結(jié)合1小時(shí)。加入3ml緩沖液洗滌2次。加入300μl vial死細(xì)胞探針溶液，上機(jī)。

由圖7可以看到，結(jié)合了熒光染料的TEM1單鏈抗體仍然可以特異性的結(jié)合具有抗原的細(xì)胞，而不具有抗原的細(xì)胞上則不會(huì)出現(xiàn)抗體的結(jié)合。

實(shí)施例6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)78C-PEG-ICG的內(nèi)吞能力

37℃時(shí)，當(dāng)抗原與抗體特異性結(jié)合后，抗原抗體復(fù)合物會(huì)內(nèi)吞入細(xì)胞，再接著進(jìn)行以一系列的生理生化反應(yīng)。由于將熒光染料人為加入到單鏈抗體上，由可能會(huì)影響單鏈抗體的內(nèi)吞效果，對(duì)于成像不利。因此本發(fā)明通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，分別在4℃和37℃條件下，將相應(yīng)的抗體與細(xì)胞孵育，然后用胰酶消化掉細(xì)胞表面的抗原抗體復(fù)合物，如果抗原抗體復(fù)合物被內(nèi)吞入細(xì)胞，就可以避免被消化掉，從而在流式細(xì)胞儀中呈現(xiàn)陽(yáng)性的結(jié)果。具體步驟為：

在細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入6ml維爾烯溶液，37℃下消化10分鐘，一共準(zhǔn)備兩組相同的樣品。加入6ml的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。用7ml流式緩沖液(FACS緩沖液)重懸細(xì)胞，緩慢吹打混勻，按每管1ml分裝入7只流式管中。每管加入2ml流式緩沖液混勻后，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。加入100μl用流式緩沖液稀釋的濃度為50mM的78C-PEG-ICG。4℃或者37℃條件下孵育結(jié)合1小時(shí)。加入3ml流式緩沖液混勻，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。再次用3ml流式緩沖液洗滌2次。每管加入100μl的鼠源His抗體，4℃條件下孵育結(jié)合1小時(shí)。加入3ml流式緩沖液洗滌2次。每管加入100μl的鼠源APC抗體，4℃條件下孵育結(jié)合1小時(shí)。加入1ml的胰酶，消化1分鐘。加入3ml流式緩沖液洗滌2次。加入300μl vial死細(xì)胞探針溶液，上機(jī)。

由圖8可以看到，78C-PEG-ICG仍然具有內(nèi)吞的作用。圖9為三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明78C-PEG-ICG的內(nèi)吞效果是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

實(shí)施例7應(yīng)用近紅外成像對(duì)78C-PEG-ICG進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)

應(yīng)用10％的分離膠對(duì)78C-ICG、78C-PEG-ICG、IgG-ICG和78C(單純的蛋白質(zhì)，沒(méi)有連接熒光染料)分別進(jìn)行變性和非變性蛋白電泳。將跑好的蛋白膠在800μm下應(yīng)用近紅外線(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)。再將跑好的蛋白膠用考馬斯亮藍(lán)染色。

由圖10可知，在紅外檢測(cè)下，除了沒(méi)連接熒光基團(tuán)的78C外，其他蛋白在各自分子量對(duì)應(yīng)的位置處均有熒光條帶顯現(xiàn)。而在普通的染色條件下，無(wú)論是變性條件還是非變性條件都表現(xiàn)正常，在各自分子量對(duì)應(yīng)的部位處均有條帶，證明熒光染料的加入不會(huì)改變蛋白的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例8應(yīng)用近紅外成像對(duì)78C-PEG-ICG的特異性和靈敏度的檢測(cè)

在96孔板上分別種植1×10⁴的MS1細(xì)胞(不表達(dá)TEM1的MS1細(xì)胞)和MS1-TEM1細(xì)胞(表達(dá)TEM1的MS1細(xì)胞)，然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。分別在每孔中加入不同濃度(0、0.4nM、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM、300nM)的78C-ICG、78C-PEG-ICG或者IgG-ICG。37℃于二氧化碳培養(yǎng)箱孵育1小時(shí)。PBS洗三次，2000g離心3分鐘。在小動(dòng)物活體成像儀上應(yīng)用紅外成像進(jìn)行檢測(cè)。

由圖11可以看出，78C-ICG和IgG-ICG非特異性地與細(xì)胞結(jié)合，同時(shí)都可以被紅外檢測(cè)到熒光。而加入了linker的78C-PEG-ICG則表現(xiàn)為特異性的與MS1-TEM1細(xì)胞結(jié)合，而且即便78C-PEG-ICG濃度降低到3.7nM，仍然可以表現(xiàn)為特異性結(jié)合TEM1抗原的能力。因此表明，78C-PEG-ICG具有抗體的特異性，同時(shí)具有極高的親和力。

實(shí)施例9 TEM1+動(dòng)物模型的建立

用5×10⁵的MS1-TEM1細(xì)胞皮下注射于裸鼠皮下用于建立TEM1+小鼠模型(也稱(chēng)為表達(dá)TEM1小鼠，或TEM1陽(yáng)性小鼠)。將注射好的小鼠在動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)，大約10天左右長(zhǎng)處2cm左右的瘤子。

實(shí)施例10應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)78C-PEG-ICG特異性

將長(zhǎng)瘤的小鼠分成78C-ICG、78C-PEG-ICG和IgG-ICG三組，分別將78C-ICG、78C-PEG-ICG或IgG-ICG通過(guò)尾經(jīng)脈注射小鼠，使抗體最終在小鼠體內(nèi)濃度為100nM。分別按照0、2、4、8、12、24、48、72小時(shí)，應(yīng)用小動(dòng)物活體成像對(duì)小鼠進(jìn)行檢測(cè)。1小時(shí)后即進(jìn)行熒光觀察，可以看到小鼠的肝臟部位存在著大量的熒光，此時(shí)還看不出不同組間的區(qū)別。在48小時(shí)后(圖12)，大部分的染料已經(jīng)經(jīng)過(guò)肝臟的代謝被排除體外，而明顯可以觀察到靶向到腫瘤上的熒光仍然保留。證明所構(gòu)建的熒光探針可以特異性的識(shí)別TEM1+的動(dòng)物模型。

本文中應(yīng)用了具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)。

序列表

<110> 天津醫(yī)科大學(xué)

<120> TEM1特異性熒光探針及其應(yīng)用

<130> PP169732

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TEM1單鏈抗體的編碼序列

<400> 1

gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aaactttaag aaggagatat 60

acatatgcat catcatcacc atcaccatgt ccagcctgtg ctgactcagc caccttccct 120

ctctgcatct cctggagcat cagccagtct cacctgcacc ttacgcagtg acatcaatgt 180

tggttcctac aggatatcct ggtaccagca gaagccaggg agtcctcccc agtatctcct 240

gagctacaaa tcagactcag ataagcagaa gggctctgga gtccccagcc gcttctctgg 300

atccaaagat gcttcggcca atgcagggat tttactcatc tctgggctcc agtctgagga 360

tgaggctgac tattattgta tgatttggca caacagcgct ggggtgttcg gcgggggcac 420

caagctgacc gtcctaggcg gtggttcctc tagatcttcc tcctctggtg gcggtggctc 480

gggcggtggt gggcaggtgc agctgcagga gtcgggggga accttggtac agcctggggg 540

gtccctgaga ctctcttgtg aagcctctgg attcaccttt agcaactatg ccatgggctg 600

ggtccgccag actccaggaa aggggctgga gtggctgtcg gctattcgta aaagtggcac 660

taccacatac tacgcggact ccgtgaaggg ccggttcatc atctccagag acaattccaa 720

gaacaccctg tatctgcaaa tgaataggct gagagtcggc gacacggcca cttattactg 780

tgcgactcac cccatcgcgg gctactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctccgg 840

aggttcttgc tagctcgaga tcgatgatat tcgagcctag gtataatcgg atccggctgc 900

taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccac 939

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met His His His His His His His Val Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro

1 5 10 15

Pro Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr

20 25 30

Leu Arg Ser Asp Ile Asn Val Gly Ser Tyr Arg Ile Ser Trp Tyr Gln

35 40 45

Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Ser Tyr Lys Ser Asp

50 55 60

Ser Asp Lys Gln Lys Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

65 70 75 80

Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln

85 90 95

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Asn Ser Ala

100 105 110

Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

145 150 155 160

Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala

165 170 175

Met Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ser

180 185 190

Ala Ile Arg Lys Ser Gly Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

195 200 205

Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

210 215 220

Gln Met Asn Arg Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Thr His Pro Ile Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser Gly Gly Ser Cys

260