本發(fā)明屬于生物制藥技術領域，具體涉及化合物麝香酮(Muscone，簡稱Mus)作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應用。

背景技術：

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,簡稱AD)是一種進行性中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床特征為進行性記憶及認知功能障礙。65歲以上人群患病率約5％，85歲以上人群患病率則為20％，AD已成為僅次于心臟病、惡性腫瘤、中風的第四位死亡病因，給家庭和社會帶來沉重的負擔。

研究表明，學習與記憶相關的突觸形成和重塑與染色質的重塑密切相關，其中組蛋白乙酰化在認知功能方面的重要作用越來越受關注。組蛋白乙?；€(wěn)態(tài)受組蛋白乙?；D移酶(Histone acetytransferases,HATs)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylases,HDACs)調控,HATs能夠提高轉錄活性，而HDACs能抑制基因轉錄。文獻研究提示AD患者腦內組蛋白乙酰化水平降低，非特異性HDAC抑制劑(HDACi)能促進組蛋白乙酰化，增強海馬長時程增強(Long term potentiation,LTP)并增強突觸可縮性，改善學習記憶功能。人類HDAC具有11種鋅依賴的亞型，其中HDAC2是已被驗證的與記憶形成和突觸可塑性密切相關的HDAC亞型。HDAC2可結合于一系列與記憶相關的突觸形成及突觸重塑基因啟動子，抑制相關基因表達，損害突觸可塑性和記憶形成；相反，阻斷HDAC2可改善突觸可塑性并增強記憶功能，促進記憶形成。

目前臨床治療AD的藥物主要分為兩類:1)乙酰膽堿酯酶抑制劑；2)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑。但上述藥物可暫時緩解AD臨床癥狀，并不能阻止AD病理進展。非特異性HDACi治療AD已進入臨床實驗(II/III期)。但非特異性HDACi作用底物廣，因此可能產生較嚴重的毒副作用。故針對AD的HDAC亞型靶向治療藥物有望為臨床AD治療提供新的理念和策略。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種Mus作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應用。

本發(fā)明的技術方案是：

麝香酮作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應用，其主要技術特征在于將麝香酮制備成治療阿爾茨海默病的注射制劑。

所述麝香酮的分子量為238.415Da。

所述麝香酮注射制劑為每次腹腔注射2mg/Kg。

所述麝香酮2％(v/v)乙醇和98％(v/v)生理鹽水混合，按照500μg：1000ul，制成治療阿爾茨海默病的注射液制劑。

所述注射液制劑體內腹腔注射2mg/Kg/天。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于治療阿爾茨海默病時，由于麝香酮(以下簡稱Mus)：

1.是一種小分子化合物，注射用藥，可透過血腦屏障；

2.作用于AD的病理過程，符合當今研制治療AD藥物的決策；首先直接抑制Aβ神經毒性作用，減少神經元死亡；其次，抑制組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2,HDAC2)表達，調節(jié)記憶功能和突觸可塑性。

本發(fā)明的其他具體優(yōu)點和效果將在下面繼續(xù)說明。

本發(fā)明利用現(xiàn)代生物學技術和生物信息學分析對麝香酮在治療阿爾茨海默病領域進行了研究，發(fā)現(xiàn)Mus能夠抑制Aβ神經毒性作用，減少神經元死亡，可將麝香酮制備成治療阿爾茨海默病的注射制劑，對阿爾茨海默病進行治療。

附圖說明

圖1——MTT檢測神經元細胞活力示意圖：

A——不同濃度Mus處理原代神經元細胞活力圖；

B——Mus抑制Aβ降低的神經元活力圖。

圖2——Calcein-AM/PI雙染檢測Mus對Aβ誘導原代神經元細胞凋亡率的影響示意圖：

A——正常對照組神經元、Mus單獨處理組神經元、Aβ單獨處理組神經元及Mus預處理后和Aβ共培養(yǎng)組神經元凋亡率示意圖；

B——各組細胞凋亡率統(tǒng)計圖。

圖3——Western blot檢測Mus對Aβ誘導原代神經元Bcl-2、Bax蛋白表達的影響示意圖:

A——正常對照組神經元、Mus單獨處理組神經元、Aβ單獨處理組神經元及Mus預處理后和Aβ共培養(yǎng)組神經元Bax、Bcl-2、GAPDH蛋白條帶示意圖；

B——各組細胞蛋白表達變化統(tǒng)計圖。

圖4——APP/PS1小鼠morris水迷宮實驗結果示意圖：

A——Mus處理后小鼠水迷宮平均逃避潛伏期圖；

B——第6天去平臺，Mus處理后小鼠水迷宮穿越平臺次數(shù)圖；

C——第6天去平臺，Mus處理后小鼠水迷宮目標象限停留時間圖；

D——第6天去平臺，Mus處理后小鼠水迷宮平均逃避潛伏期圖；

E——第6天去平臺，各組小鼠水迷宮游泳軌跡圖。

圖5——APP/PS1小鼠條件性恐懼實驗結果示意圖：

A——Mus處理后小鼠關聯(lián)條件恐懼測試凝滯時間示意圖；

B——Mus處理后小鼠暗示條件恐懼測試凝滯時間示意圖。

圖6——APP/PS1小鼠曠場實驗結果示意圖：

A——Mus處理后小鼠曠場中心區(qū)域停留時間示意圖；

B——Mus處理后小鼠曠場四周拐角區(qū)域停留時間示意圖；

C——Mus處理后小鼠在曠場內運動距離示意圖。

圖7——Golgi染色檢測Mus對APP/PS1小鼠腦內海馬神經元樹突棘密度的影響示意圖：

A——APP/PS1小鼠海馬神經元樹突棘密度示意圖；

B——Mus處理后APP/PS1小鼠海馬神經元樹突棘密度示意圖；

B——各組小鼠海馬神經元樹突棘密度統(tǒng)計圖。

圖8——Western blot檢測Mus對APP/PS1小鼠海馬HDAC2蛋白表達的影響示意圖。

A——Mus處理后小鼠海馬HDAC2蛋白條帶示意圖；

B——各組小鼠海馬HDAC2蛋白表達變化統(tǒng)計圖。

具體實施方式

本發(fā)明的技術思路是：

從體外到體內水平，系統(tǒng)探討Mus對Aβ誘導的原代神經元凋亡的影響及Mus對APP/PS1小鼠行為學的影響及其分子機制，以證明Mus系一種治療AD的新型藥物。本發(fā)明首先，從體外角度，通過體外研究Mus抑制Aβ誘導的原代神經元細胞凋亡作用，從而證明Mus能抑制Aβ神經毒性；其次，從體內角度，行為學驗證Mus能改善APP/PS1轉基因小鼠認知功能，從而證明Mus對AD具有治療作用；最后，用分子生物學等技術研究Mus對APP/PS1小鼠海馬神經元樹突棘密度的影響及Mus對APP/PS1小鼠海馬HDAC2蛋白表達的影響，以證明Mus可制備為治療AD新型藥物的應用。

下面是本發(fā)明的具體實施例說明:

Muscone，分子量為238.415，棕褐色粉狀，干燥避光密封保存于0-5℃；與2％(v/v)乙醇和98％(v/v)生理鹽水混合，按照500μg：1000ul，制成治療阿爾茨海默病的注射液制劑；體內Muscone腹腔注射2mg/Kg/次。該劑量范圍內,Mus未見毒、副作用。

本發(fā)明應用過程及測試說明：

實施例1：

體外研究證明Mus抑制Aβ的神經毒性及其誘導的神經細胞凋亡對AD具有治療作用：

1)材料和方法

原代皮層神經元培養(yǎng)：懷孕15-17d C57BL/6J(B6)小鼠，斷頸處死后，取其胚胎，置于盛有預冷PBS的培養(yǎng)皿中，分離大腦皮層，1X胰酶消化后，置多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，1×10⁵個細胞/ml，每2-3d部分換液，共培養(yǎng)8-10d。細胞培養(yǎng)在無血清、無酚紅和無雌激素的培養(yǎng)液(Neurobasal加上Hepes、B27和谷氨酰胺)中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱。

神經元細胞活力檢測：使用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測細胞活力。向100μl培養(yǎng)液/孔中加入MTT，37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后傾去全部培養(yǎng)液,每孔中加入100μl DMSO溶液,搖床上搖動至藍紫色的結晶完全溶解，酶標計數(shù)儀測定各組OD值。

藥物處理：篩選Mus處理原代神經元的安全濃度，Mus(0，0.1，1，2.5，5，10，20，40uM)處理神經元細胞24小時，隨后MTT檢測神經元細胞活力；篩選Mus抑制Aβ神經毒性的有效藥物濃度，Mus(0，0.1，1，2.5，5，10uM)預處理神經元細胞2小時后，加入Aβ2uM處理上述神經元24小時，隨后MTT檢測神經元細胞活力。

Calcein-AM/PI雙染：用1ml無水DMSO溶解1mg Calcein-AM，制備成1mmol/L的Calcein-AM儲備液，-20℃下密閉冷凍保存。用1ml ddH2O溶解1mg PI，制備成1.5mmol/L的PI儲備液(1mg PI/1ml H2O)，-20℃下密閉冷凍保存。將Calcein-AM儲備液和PI儲備液放置于室溫。加10μl Calcein-AM儲備液和15μl PI儲備液至5ml PBS中配制成染色溶液。37℃染色15min到30min可以用顯微鏡觀察細胞。

2)結果

①MTT提示Aβ明顯降低原代神經元的細胞活力，Mus能抑制Aβ的神經毒性：我們用不同濃度的Mus單獨處理原代神經元，顯示其對原代神經元細胞活力無明顯影響(圖1A)；加入不同劑量Mus預處理神經元，隨后加入Aβ2uM處理神經元24小時后，提示Aβ能顯著降低細胞活力，Mus能提高神經元的細胞活力呈劑量依賴性(圖1B)。

②Calcein-AM/PI雙染結果提示Mus5μM單獨處理神經元不會引起神經元細胞死亡，Aβ2μM處理原代神經元能夠明顯增加神經元死細胞比例，Mus5μM預處理原代神經元2小時后加入Aβ2μM共培養(yǎng)24小時,能夠顯著減少Aβ誘導的神經元死亡(圖2B)。

實施例2：

體外研究證明Mus能抑制Aβ誘導的神經元細胞凋亡：

本部分研究為進一步證實Mus通過調控細胞凋亡調控因子Bcl-2、Bax的蛋白表達水平發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用。

1)材料和方法

免疫印跡(Western blot)定量測定神經元細胞中Bcl-2、Bax含量：提取蛋白質，然后溶解在5Xloading Buffer中，煮沸5分鐘。在4-20％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，將蛋白轉到PVDF膜上。以5％脫脂牛奶室溫封閉1小時。分別加一抗抗體兔抗-Bcl-2(1:1000,Cell signaling technology)、兔抗-Bax(1:1000,Cell signaling technology)、兔抗-GAPDH(1:5000，Bioworld technology)，4℃過夜，辣根過氧化酶標記二抗(1：5000，Bioworld)結合2小時，用增強的化學發(fā)光法測定其蛋白表達。

2)結果

①Western blot結果顯示：Aβ處理后，下調神經元Bcl-2表達水平，上調神經元Bax表達水平，而Mus預處理后顯著上調Bcl-2表達水平，下調Bax表達水平(圖3)。

實施例3：

體內研究證明Mus對APP/PS1小鼠具有治療作用：

以B6C3-Tg(APPswe/PSEN1dE9)轉基因小鼠簡稱APP/PS1作為AD動物模型，予Mus腹腔注射治療。通過行為學證明，Mus對AD具有治療作用。

1)材料和方法

以B6C3-Tg(APPswe/PSEN1dE9)轉基因小鼠簡稱APP/PS1作為AD動物模型，實驗隨機分成3組：APP/PS1同窩野生型小鼠，APP/PS1轉基因小鼠，APP/PS1小鼠+Mus 2mg/kg腹腔注射，每日1次，治療15天，每組8只小鼠。

行為學檢測：水迷宮試驗為用于檢測動物學習記憶能力的公認方法，Morris水迷宮：圓形水池直徑為122cm,高75cm,平臺高度50cm,直徑10cm,平臺低于水面1cm,水溫23±2℃。實驗期間水迷宮外參照物保持不變。實驗前1天，讓小鼠熟悉水迷宮環(huán)境。實驗歷時5天，每天訓練1次，分別從東、南、西、北4個點入水，入水時，小鼠面向池壁，記錄小鼠找到平臺所需時間即逃避潛伏期。于第6天撤去平臺，將受試小鼠在西北象限池壁中點面向池壁放入水中，記錄1min內小鼠穿越平臺的次數(shù)作為小鼠的記憶成績。

條件性恐懼實驗可用于測定動物學習、記憶不悅經歷和環(huán)境暗示之間的關聯(lián)能力。實驗設備包括條件恐懼箱、隔音箱和關聯(lián)條件箱。條件恐懼箱包括箱底格柵地板相聯(lián)的電擊發(fā)生器(可產生0.1～1.0mA的各種強度的電擊)、聲音發(fā)生器，并與計算機相聯(lián)。隔音箱裝有一燈、一小風扇(用于通風和產生背景音)以及一個與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴音器。關聯(lián)箱由透明有機玻璃制成，有可移動的格柵式地板，關聯(lián)條件箱為26cm×21cm×10cm，格柵地板由不銹鋼條組成(直徑1.5mm，中央間距為0.5cm)。此外，還有電壓計和聲強計，用來檢測刺激強度。實驗分為訓練和測試兩個階段。第一天為訓練階段，將小鼠放入條件恐懼箱適應3min，隨后加以80Db聲音刺激30s，緊接著給予一次0.7mA電擊2s，隨后無刺激1min，記錄整個訓練過程階段動物凝滯時間以作為實驗評價的基線，將小鼠移開操作箱，用70％的酒精徹底清潔操作箱，以備下一只動物訓練。第二天為測試階段，關聯(lián)條件恐懼測試(contextual fear conditioning test)是將動物放入第一階段中的環(huán)境中5min，記錄小鼠在操作箱中的凝滯時間以評價海馬依賴的記憶。暗示條件恐懼測試(cued fear conditioning test)是將小鼠放入經改造后的關聯(lián)箱探索1min后，給予聲音刺激30s,隨后無刺激1.5min，記錄小鼠在操作箱內的凝滯時間以評價杏仁核依賴的記憶。

曠場實驗可用于觀察小鼠自發(fā)性探索運動活性和焦慮行為，設備為底面積40cm×40cm，高50cm的白色開口有機玻璃盒，底面可平均分為16個10cm×10cm的小方格，正上方2m處架一數(shù)碼攝像頭，其視野可覆蓋整個曠場內部。實驗在安靜的環(huán)境下進行，將小鼠放入箱內底面中心，同時進行10min觀察，利用Any-maze動物行為分析系統(tǒng)統(tǒng)計每只小鼠在底面中心4個小方格及周圍4個拐角方格的停留時間和運動距離。

2)結果

①行為學結果：Morris水迷宮試驗結果提示，經過5天的訓練，Mus明顯減少APP/PS1小鼠找到平臺的逃避潛伏期(圖4A)，第6天撤去平臺，可見Mus明顯增加APP/PS1鼠穿越平臺的次數(shù)(圖4B)，并且顯著提高APP/PS1小鼠在目標象限的停留時間(圖4C)，此外，Mus明顯減少APP/PS1小鼠找到平臺的潛伏期(圖4D)。

②條件性恐懼實驗結果提示，經過第一天的訓練階段，第二天的關聯(lián)條件恐懼測試中APP/PS1小鼠較野生型小鼠凝滯時間顯著減少，而Mus給藥組小鼠較APP/PS1小鼠凝滯時間顯著增加，提示Mus能夠改善APP/PS1小鼠的海馬依賴性記憶(圖5A)。暗示條件恐懼測試中各組小鼠的凝滯時間未見明顯差異，提示Mus未能改善APP/PS1小鼠的杏仁核依賴性記憶(圖5B)。

③曠場實驗結果提示，APP/PS1同窩野生型小鼠、APP/PS1小鼠及接受Mus治療的APP/PS1小鼠，三組小鼠在曠場中心區(qū)域的停留時間未見明顯差異(圖6A)，各組小鼠在曠場周圍四個拐角的停留時間未見明顯差異(圖6B)，此外，各組小鼠在曠場中的運動距離也沒有差異(圖6C)，提示Mus不會影響小鼠的探索能力及焦慮狀態(tài)。

實施例4：

體內研究證明Mus能增加APP/PS1小鼠海馬內樹突棘密度。

1)材料和方法

Golgi染色：利用FD快速高爾基染色試劑盒(FD Rapid GolgiStain^TM Kit，PK401)進行染色，將小鼠麻醉后，快速取腦，用雙蒸水快速沖掉組織表面血液，按試劑盒說明將組織浸泡于溶液A和溶液B等體積混合液中避光保存兩周，浸泡12小時后更換新的浸漬液。轉移組織到溶液C避光浸泡72小時。利用冰凍切片機將組織切成100-200μm厚的薄片，把樣本轉移到含有溶液C的明膠包被的載玻片上。用雙蒸水沖洗切片兩次，每次4min。將切片置于由1份溶液D，1份溶液E和2份雙蒸水組成的混合液中10min。用蒸餾水沖洗切片2次，每次4min。用結晶紫對切片復染，在50％，75％和95％的乙醇中對切片進行脫水，每個濃度梯度脫水4min。在無水乙醇中對切片進行脫水4次，每次4min。在二甲苯中透明，3次，每次4min，并用樹脂封片劑對蓋玻片進行封片。

2)結果

①Golgi染色結果提示Mus給藥組APP/PS1小鼠海馬內樹突棘密度較APP/PS1對照組小鼠明顯增多，提示Mus能夠增加APP/PS1小鼠腦內海馬區(qū)突觸的數(shù)量(圖7)。

實施例5：

體內研究證明在APP/PS1小鼠AD模型中Mus能抑制HDAC2的表達：

1)材料和方法

Western Blot：方法同上，分別加第一抗體兔抗HDAC2(1:1000,Bioworld technology),及兔抗GAPDH(1:5000,Bioworld technology)抗體，4℃過夜，辣根過氧化酶標記二抗(1：5000,Bioworld technology)結合2小時，用增強的化學發(fā)光法測定其蛋白表達。

2)結果

①Western blot結果顯示：與APP/PS1對照組相比，Mus給藥組小鼠海馬內HDAC2的表達顯著降低，提示Mus能夠抑制APP/PS1小鼠海馬內HDAC2表達(圖8)。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員，在不脫離本發(fā)明技術方案范圍內，依據(jù)本發(fā)明的技術實質，對以上實施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進等，均仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍之內。