本發(fā)明是關(guān)于一種青藤堿在醫(yī)藥領(lǐng)域的新用途，更具體地說，是關(guān)于一種鹽酸青藤堿在制備用于治療人腦膠質(zhì)瘤的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

顱內(nèi)腫瘤中以膠質(zhì)瘤最常見，膠質(zhì)瘤約占所有顱內(nèi)腫瘤的45％～50％，此類腫瘤以惡性者多見，而且由于腫瘤的侵潤性生長，利用傳統(tǒng)的手術(shù)治療難以徹底切除，是目前嚴重威脅人類健康的一大疾病。近年來惡性腫瘤的治療有了明顯的進步，抗腫瘤藥物研究經(jīng)過40余年的努力已發(fā)展到一個新的階段，其研究領(lǐng)域已遠遠超過傳統(tǒng)的以核酸及其組成成分為靶點的細胞毒類藥物。為尋找有新的作用機理及獨特化學結(jié)構(gòu)的細胞毒類藥物，人們一直在做著努力，最近人們認為治療惡性腫瘤的藥物應該是通過刺激腫瘤細胞凋亡來使其死亡，而細胞毒性自噬途徑同樣引起了人們的關(guān)注。

青藤堿是植物藥青風藤中所提純的生物堿，具有抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)控的作用，其片劑和針劑已經(jīng)成為國家正式批準使用的藥物。現(xiàn)已經(jīng)用于風濕性關(guān)節(jié)炎的治療，并取得了滿意效果。近年來，隨著對青藤堿研究的深入，發(fā)現(xiàn)了一些新的藥理作用及作用機制，尤其是抗腫瘤方面的作用越來越受到國內(nèi)外學者的重視。

關(guān)于青藤堿在抗膠質(zhì)瘤方面的作用目前僅見對鼠源性膠質(zhì)瘤C6細胞株抑制作用的報道，例如CN101002773A以鼠源性膠質(zhì)瘤C6細胞株為靶細胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)堿溶并重結(jié)晶后得到的鹽酸青藤堿單晶對于鼠源性膠質(zhì)瘤C6細胞株具有抑制作用，抑制率隨劑量的增加而提高。然而，C6細胞是經(jīng)硝基甲脲誘發(fā)Wistar種系大鼠獲得的腦膠質(zhì)瘤細胞，與人腦膠質(zhì)瘤存在種屬差異。關(guān)于藥物的抗腫瘤機制比較復雜，通常與腫瘤細胞的種類有關(guān)，甚至在不同的腫瘤細胞中的作用機制也有很大的不同，對不同腫瘤細胞的影響作用不同。例如，Curicumin能夠抑制C6膠質(zhì)瘤細胞增殖，但卻不能明顯抑制缺乏野生型PTEN基因的U87MG膠質(zhì)瘤細胞的分裂增殖。

目前，并未見關(guān)于青藤堿在抗人腦膠質(zhì)瘤方面的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于提供一種青藤堿在醫(yī)藥領(lǐng)域的新應用，特別是鹽酸青藤堿在制備用于治療人腦膠質(zhì)瘤的藥物中的應用。

本發(fā)明中所述的青藤堿包括其鹽的形式，例如鹽酸青藤堿。

本案發(fā)明人在研究中意外地發(fā)現(xiàn)，市售普通的青藤堿(無需經(jīng)堿溶并重結(jié)晶處理)對人源性膠質(zhì)瘤U87MG和SF767細胞株具有抑制作用，并隨劑量和時間的遞增而提高。并且，本發(fā)明的青藤堿能夠誘導自噬體的增加，能夠增加自噬囊泡的數(shù)量，促進人膠質(zhì)瘤細胞LC3B-Ⅱ的表達增加，能夠誘導人膠質(zhì)瘤細胞自噬性死亡，能夠抑制U87MG細胞異種移植瘤生長。

從而，本發(fā)明提供了青藤堿的新應用。

具體而言，本發(fā)明提供了青藤堿在制備用于治療人腦膠質(zhì)瘤的藥物中的應用。

本發(fā)明還提供了所述的青藤堿在制備對人源性膠質(zhì)瘤U87MG和SF767細胞株具有抑制作用的抑制劑中的應用。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述抑制作用隨青藤堿劑量和作用時間的增加而提高。

本發(fā)明還提供了所述的青藤堿在制備誘導自噬體的增加的制劑中的應用。

本發(fā)明還提供了所述的青藤堿在制備增加自噬囊泡的數(shù)量的制劑中的應用。

本發(fā)明還提供了所述的青藤堿在制備促進人膠質(zhì)瘤細胞LC3B-Ⅱ的表達的制劑中的應用。

本發(fā)明還提供了所述的青藤堿在制備誘導人膠質(zhì)瘤細胞自噬性死亡的制劑中的應用。

本發(fā)明還提供了所述的青藤堿在制備抑制U87MG細胞異種移植瘤生長的制劑中的應用。

綜上所述，本發(fā)明所述的青藤堿是一種很有潛力的新型、有效的抗膠質(zhì)瘤新藥，可用于制備治療人腦部腫瘤藥物，為人腦部腫瘤的內(nèi)科治療開辟一條新途徑，也拓寬了青藤堿的醫(yī)藥應用。

附圖說明

圖1A顯示本發(fā)明的鹽酸青藤堿對人源性膠質(zhì)瘤U87MG細胞株的抑制作用。

圖1B顯示本發(fā)明的鹽酸青藤堿對人源性膠質(zhì)瘤SF767細胞株的抑制作用。

圖2顯示本發(fā)明的鹽酸青藤堿誘導自噬體的實驗中的透射電鏡觀察結(jié)果。

圖3顯示本發(fā)明的鹽酸青藤堿對自噬囊泡影響實驗中的MDC染色觀察結(jié)果。

圖4顯示本發(fā)明的鹽酸青藤堿影響人膠質(zhì)瘤細胞LC3B-Ⅱ表達水平的實驗結(jié)果。

圖5A顯示本發(fā)明的鹽酸青藤堿誘導人源性膠質(zhì)瘤U87MG細胞株的自噬性死亡實驗結(jié)果。

圖5B顯示本發(fā)明的鹽酸青藤堿誘導人源性膠質(zhì)瘤SF767細胞株的自噬性死亡實驗結(jié)果。

圖6A～圖6D顯示本發(fā)明的鹽酸青藤堿對U87MG細胞異種移植瘤裸鼠體重及腫瘤組織重量及體積的影響。

具體實施方式

以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施過程和產(chǎn)生的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)和特點，不作為對本案可實施范圍的限定。各實施例中未詳細注明的實驗方法，按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進行。各實施例中所用的本發(fā)明的鹽酸青藤堿為市售普通產(chǎn)品，商購品即直接用于本發(fā)明，未經(jīng)堿溶、重結(jié)晶等處理。

實施例1、以人源性膠質(zhì)瘤U87MG和SF767細胞株為靶細胞進行鹽酸青藤堿對于人膠質(zhì)瘤細胞株的抑制作用的實驗

實驗方法為：將由中國醫(yī)學科學院細胞資源中心提供的人源膠質(zhì)瘤細胞株U87MG和SF767用胰酶消化后，懸浮于含10％胎牛血清的培養(yǎng)液中，利用玻璃滴管輕輕吹打成細胞懸液，顯微鏡下用細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞。將腫瘤細胞接種于無菌的96孔培養(yǎng)板，每孔加腫瘤細胞懸液100μl。將細胞置于37℃、體積百分比為5％的CO₂培養(yǎng)箱中24小時后，棄去上清液，然后加入不同濃度的鹽酸青藤堿溶液。在37℃、體積百分比5％的CO₂培養(yǎng)箱中分別孵育24小時、48小時、72小時，轉(zhuǎn)移上清液，在每孔中加入10微升CCK8，同等條件孵育1小時，在酶標儀上以波長為450nm，測定各孔吸光度，計算細胞生存率。

實驗結(jié)果參見圖1A與圖1B。結(jié)果表明，不同濃度的本發(fā)明的鹽酸青藤堿對人源性膠質(zhì)瘤U87MG和SF767細胞株具有不同程度的抑制。

實施例2、鹽酸青藤堿能夠誘導自噬體的增加

實驗方法：細胞經(jīng)處理后，2000轉(zhuǎn)/分，離心10min，去除上層培養(yǎng)基，并用冷的PBS洗滌3次，離心后保留下層細胞，輕輕的加入2.5％的戊二醛固定液，固定24小時，2％鋨酸固定2小時，梯度脫水：50％、70％、90％、100％的丙酮酸脫水，每級10分鐘，60℃包埋24小時，使細胞成塊，切片，透射電鏡觀察。

觀察結(jié)果請參見圖2所示，與其中的圖片A對照組比較，經(jīng)0.5mM鹽酸青藤堿處理后人膠質(zhì)瘤U87MG和SF767細胞胞漿內(nèi)均觀察到多個雙層膜性結(jié)構(gòu)，即自噬體，其中圖片C為圖片B的局部放大。結(jié)果表明，鹽酸青藤堿能夠誘導自噬體的增加。

實施例3、鹽酸青藤堿能夠增加自噬囊泡的數(shù)量

實驗方法：單丹磺酰戊二胺(MDC)染色，其能夠選擇性地聚集于自噬體，溶酶體和自噬溶酶體等酸性囊泡中，當MDC在激發(fā)光下，呈藍綠色或黃綠色顆粒狀結(jié)構(gòu)，可用熒光顯微鏡進行觀察，是檢測自噬的一種常用方法。將細胞接種于共聚焦單孔培養(yǎng)皿內(nèi)，5×10⁴個細胞/孔，3復孔，加入100μmol/LMDC工作液，重新置于37度溫箱內(nèi)孵育30min，PBS洗細胞兩遍，加入4％多聚甲醛1ml固定15min，PBS清洗細胞2次，上機檢測。

實驗結(jié)果請參見圖3所示。結(jié)果顯示，對照組細胞中少見酸性囊泡，而0.5mM鹽酸青藤堿處理后的細胞中酸性囊泡數(shù)量顯著提高，與自噬抑制劑3MA共同作用后則明顯減少。表明，鹽酸青藤堿能夠增加人膠質(zhì)瘤U87MG和SF767細胞中酸性囊泡的數(shù)量，且其作用可被自噬抑制劑部分阻斷。

實施例4、鹽酸青藤堿能夠促進人膠質(zhì)瘤細胞LC3B-Ⅱ的表達增高

實驗方法：LC3B是自噬研究領(lǐng)域公認的自噬特異性標志物，以胞漿形式存在的LC3B-I在自噬激活過程中，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w形式的LC3B-II，后者的表達與細胞中自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)。利用Western blot檢測0.0625，0.125，0.25和0.5mM鹽酸青藤堿作用U87及SF767細胞24h后，其自噬相關(guān)的特異性標志物LC3B的表達變化。

結(jié)果如圖4所示，在U87和SF767細胞中，與對照組比較，LC3B-Ⅱ的表達量隨著鹽酸青藤堿作用濃度的提高而顯著增加。表明，鹽酸青藤堿能夠誘導人膠質(zhì)瘤細胞自噬的發(fā)生。

實施例5、鹽酸青藤堿能夠誘導人膠質(zhì)瘤細胞自噬性死亡

實驗方法：3MA為目前通用的自噬抑制劑，將細胞株U87和SF767用胰酶消化后，懸浮于含10％胎牛血清的培養(yǎng)液中，利用玻璃滴管輕輕吹打成細胞懸液，顯微鏡下用細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞。將腫瘤細胞接種于無菌的96孔培養(yǎng)板，每孔加腫瘤細胞懸液100ul。將細胞置于37度、體積百分比為5％的CO₂培養(yǎng)箱中24小時后，棄去上清液，然后加入0.5mM鹽酸青藤堿溶液及同等濃度含5mM 3MA的鹽酸青藤堿溶液。在37度、體積百分比5％的CO₂培養(yǎng)箱中孵育48小時，轉(zhuǎn)移上清液，在每孔中加入10微升CCK8，同等條件孵育1小時，在酶標儀上以波長為450nm，測定各孔吸光度。

實驗結(jié)果請參見圖5A和圖5B所示。結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿能夠降低人膠質(zhì)瘤U87和SF767細胞的存活率，與自噬抑制劑3MA共同作用后，其細胞存活率顯著提高。表明，鹽酸青藤堿能夠誘導人膠質(zhì)瘤細胞自噬性死亡。

實施例6、鹽酸青藤堿對U87MG細胞異種移植瘤裸鼠的影響

實驗方法：取生長狀態(tài)好的U87MG細胞，制成細胞懸液。于BALB/c裸鼠頸肩背部皮下接種，細胞量為2×10⁶/只。隨機分為三組：對照組，75mg/kg鹽酸青藤堿組，150mg/kg鹽酸青藤堿組(n＝7)。接種后次日，腹腔注射連續(xù)給藥14天，使用游標卡尺每兩日測量腫瘤直徑L(mm)和寬徑W(mm)，按照下列公式計算腫瘤體積，V＝(L×W²)/2，同時每日稱量荷瘤裸鼠體重(g)。并于最后一日，處死荷瘤裸鼠，小心取出腫瘤組織，使用電子天平稱量記錄腫瘤重量(g)。

實驗結(jié)果請參見圖6A至圖6D所示。圖6A為取材后的瘤組織，圖6B為鹽酸青藤堿對裸鼠瘤重的影響，圖6C為鹽酸青藤堿對裸鼠瘤體積的影響，圖6D為鹽酸青藤堿對裸鼠體重的影響。結(jié)果表明，鹽酸青藤堿能夠明顯抑制U87MG細胞異種移植瘤生長，降低瘤體積及瘤重，且對裸鼠體重無影響。

上述結(jié)果表明，鹽酸青藤堿對人膠質(zhì)瘤細胞株U87和SF767具有抑制效果，并隨劑量的遞增而提高，其作用機制與誘導細胞自噬性死亡有關(guān)。此結(jié)果表明，鹽酸青藤堿是一種很有潛力的新型、有效的抗人膠質(zhì)瘤新藥，可用于制備治療腦部腫瘤藥物，為腦部腫瘤的內(nèi)科治療開辟一條新途徑，也拓寬了鹽酸青藤堿的醫(yī)藥應用。