本發(fā)明涉及一種雙重修飾聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒，含有所述納米粒的載藥體系，所述納米粒用于制備載藥體系的用途，以及制備所述納米粒和載藥體系的方法。本發(fā)明還涉及含有所述載藥體系的藥物組合物，以及所述納米粒或載藥體系在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

背景技術(shù)：

目前，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年增高，已經(jīng)成為影響人口健康水平和生活質(zhì)量的重大社會(huì)問題。血腦屏障(blood-brainbarrier,bbb)通透性差是用于診斷或治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物存在的重要問題之一。大部分上述藥物在全身給藥后，難以透過bbb達(dá)到腦內(nèi)有效治療濃度，影響了藥物的診斷或治療效果。如何提高藥物的bbb通透性，同時(shí)確保其在體內(nèi)的安全有效，是目前急需解決的問題。

bbb主要由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)合而成，是存在于血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的屏障結(jié)構(gòu)。一方面，bbb起到保護(hù)神經(jīng)的作用，能夠保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)較少被外來(lái)物質(zhì)侵?jǐn)_；然而，bbb的致密結(jié)構(gòu)也阻礙了用于診斷或治療腦部疾病的藥物通過非侵入性的給藥方式進(jìn)入腦內(nèi)，限制了藥物對(duì)腦內(nèi)疾病的有效診斷或治療。據(jù)報(bào)道，100％的大分子藥物和98％的小分子藥物都難以透過bbb到達(dá)腦組織。

聚氰基丙烯酸正丁酯(pbca)納米粒具有良好的降解性和生物相容性，無(wú)免疫原性，可以運(yùn)載不同的藥物。但是，普通pbca納米粒的bbb通透性并不顯著。有文獻(xiàn)報(bào)道，將表面活性劑tween-80修飾在pbca納米粒表面，以增加pbca納米粒的bbb通透性。但是，這種方法存在以下弊端：在藥物安全性方面，tween-80靜脈給藥后可能引起溶血；利用tween-80提高納米粒的bbb通透性，可能造成腦內(nèi)tween-80的暴露量增加，從而引起毒性；此外，tween-80單獨(dú)修飾的納米粒經(jīng)靜脈給藥后，在體內(nèi)容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞識(shí)別吞噬，造成納米粒的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間過短，腦靶向效果不理想。

聚乙二醇(peg)是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最為廣泛的納米粒表面修飾材料，其能夠阻止蛋白質(zhì)的吸附，同時(shí)使納米粒躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕捉，從而延長(zhǎng)納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，提高納米粒的緩釋性。但是，peg具有較強(qiáng)的親水性，單獨(dú)用其對(duì)納米粒進(jìn)行修飾，不利于納米粒透過脂類性質(zhì)的血腦屏障，使得納米粒在體內(nèi)的腦靶向性較差，bbb通透性不明顯，無(wú)法作為良好的腦靶向性載體使用。

因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)具有更高bbb通透性、更加安全、并具有良好緩釋性的藥物載體，用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、預(yù)防和/或治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所涉及的實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“聚氰基丙烯酸正丁酯”是指以氰基丙烯酸正丁酯為單體，經(jīng)過聚合反應(yīng)得到的聚合物，所述氰基丙烯酸正丁酯具有如下結(jié)構(gòu)：

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“納米?！笔侵噶皆诩{米級(jí)的粒子，例如粒徑不大于1000nm粒子，例如粒徑在50～800nm之間的粒子。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“粒徑”即“等效粒徑”，是指當(dāng)被測(cè)粒子的某種物理特性或物理行為與某一直徑的同質(zhì)球體(或組合)最相近時(shí)，就把該球體的直徑(或組合)作為被測(cè)粒子的等效粒徑(或粒度分布)。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“平均粒徑”是指對(duì)于一個(gè)由大小和形狀不相同的粒子組成的實(shí)際粒子群，與一個(gè)由均一的球形粒子組成的假想粒子群相比，如果兩者的粒徑全長(zhǎng)相同，則稱此球形粒子的直徑為實(shí)際粒子群的平均粒徑。平均粒徑的測(cè)量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如光散射法；平均粒徑的測(cè)量?jī)x器包括但不限于光散射粒度儀。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“乳化聚合”是指單體在介質(zhì)中分散成乳液狀態(tài)下發(fā)生的聚合。通常，單體在機(jī)械攪拌和穩(wěn)定劑的作用下分散成單體液滴，并通過聚合反應(yīng)形成聚合物粒子，所述聚合物粒子的粒徑可以是微米級(jí)或納米級(jí)。例如，本發(fā)明中，氰基丙烯酸正丁酯可以在酸性介質(zhì)(例如鹽酸溶液)中，通過乳化聚合形成聚氰基丙烯酸酯納米粒?？梢酝ㄟ^在聚合反應(yīng)體系中加入修飾物，得到表面帶有修飾物的聚合物粒子。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”是指能夠保持或增強(qiáng)粒子的穩(wěn)定性的物質(zhì)。在乳化聚合中，穩(wěn)定劑可以在單體液滴或聚合物粒子表面形成保護(hù)層，防止凝聚，使乳液穩(wěn)定。所述穩(wěn)定劑包括但不限于環(huán)糊精(例如dex70)、聚乙烯吡咯烷酮(例如pvp-k30)和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆f68)。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“親水性聚合物”是指帶有極性基團(tuán)、對(duì)水有大的親和力的聚合物，其可以吸引水分子和/或溶解于水。所述親水性聚合物包括可以在水中溶解或溶脹的聚合物，例如聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和羧甲基纖維素。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“脂類”是指不溶于水但能溶于非極性有機(jī)溶劑(例如氯仿、乙醚、丙酮或苯等)的有機(jī)化合物，例如磷脂(例如甘油磷酸脂和鞘磷脂)和固醇。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“甘油磷酸脂”是指具有如下結(jié)構(gòu)的一類化合物：

其中，r1和r2為脂肪酸的碳?xì)滏?，x為氫或極性取代基。所述甘油磷酸酯包括但不限于卵磷脂(磷脂酰膽堿)、腦磷脂(磷脂酰乙醇胺)、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“卵磷脂”是指甘油磷酸酯中，x為-ch2ch2n⁺(ch3)3的實(shí)例，并且r1通常為飽和碳?xì)滏?例如含有16-18個(gè)碳原子的飽和碳?xì)滏?，r2通常為不飽和碳?xì)滏?，例如花生四烯酸的碳?xì)滏?ch3(ch2)4(ch＝ch-ch2)4(ch2)2-)。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“固醇”又稱甾醇，是指以環(huán)戊烷多氫菲為基本結(jié)構(gòu)，并含有醇羥基的化合物，包括但不限于動(dòng)物性固醇(例如膽固醇)、植物性固醇和菌類固醇。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“膽固醇”是指具有如下結(jié)構(gòu)的化合物：

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指含有氨基的羧酸，包括但不限于：脂肪族氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸，例如苯丙氨酸和酪氨酸；雜環(huán)氨基酸，例如組氨酸和色氨酸；以及雜環(huán)亞氨基酸，例如脯氨酸。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“聚乙二醇(peg)”是指以-ch2ch2o-為重復(fù)單元的聚合物，其數(shù)均分子質(zhì)量為200以上，例如200～20000。所述聚乙二醇分子鏈的兩個(gè)端基可以均為羥基，或者一個(gè)端基為羥基，另一個(gè)端基為甲氧基(即甲氧基聚乙二醇，mpeg)。數(shù)均分子量為100000～1000000的聚乙二醇又被稱為聚氧化乙烯(peo)。本發(fā)明中，聚乙二醇和聚氧化乙烯具有相同的含義。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“聚乙烯醇(pva)”是指以-ch2ch(oh)-為重復(fù)單元的聚合物。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“聚乙烯吡咯烷酮(pvp)”是指具有如下重復(fù)單元的聚合物：

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“香豆素-6”是指具有如下結(jié)構(gòu)的化合物：

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“包封率”用來(lái)表征載藥體系對(duì)藥物的包封程度。本發(fā)明中，包封率的計(jì)算公式為：包封在納米粒中的藥物的量/(包封在納米粒中的藥物的量+未包封在納米粒中的藥物的量)×100％。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“載藥量”用來(lái)表征載藥體系中含有的藥物量，本發(fā)明中，載藥量的計(jì)算公式為：載藥納米粒中藥物的質(zhì)量/(載藥納米粒中藥物的質(zhì)量+載藥納米粒的質(zhì)量)×100％。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“室溫”是指25±5℃。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“約”應(yīng)該被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，并將隨其所用之處的上下文而有一定程度的變化。如果根據(jù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)用的上下文，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，其使用不是清楚的，那么“約”的意思是不超過所述特定數(shù)值或范圍的正負(fù)10％。

本發(fā)明人通過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了雙重修飾的聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒，以及含有所述納米粒的載藥體系。所述納米粒可用作藥物的腦靶向遞送載體，具有良好的安全性、緩釋性和bbb通透性，可以有效提高藥物進(jìn)入腦內(nèi)的濃度，并使藥物緩慢釋放，延長(zhǎng)其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，由此提供了下述發(fā)明：

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種納米粒，其包含聚氰基丙烯酸正丁酯，或主要由聚氰基丙烯酸正丁酯構(gòu)成，所述納米粒表面修飾有第一修飾物和第二修飾物，所述第一修飾物為親水性聚合物，所述第二修飾物為氨基酸和/或脂類。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸為l-氨基酸。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸為天冬氨酸和亮氨酸。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂類選自磷脂(例如卵磷脂)和固醇(例如膽固醇)。

在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述氨基酸和脂類是天然存在于受試者(例如哺乳動(dòng)物；例如?？苿?dòng)物、馬科動(dòng)物、羊科動(dòng)物、豬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物；例如，人)體內(nèi)的氨基酸和脂類。但是，本發(fā)明不限制所述氨基酸和脂類的來(lái)源，其可以從受試者體內(nèi)提取得到，或者可以通過人工合成得到。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親水性聚合物選自聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，優(yōu)選為聚乙二醇。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親水性聚合物的數(shù)均分子質(zhì)量為2000～20000，例如2000～5000、5000～10000、10000～15000或15000～20000，例如2000、5000、10000、15000或20000。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒的平均粒徑為50～800nm，例如50～100nm、100～400nm、400～600nm或600～800nm。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒的多分散指數(shù)(pdi)為0.100～0.300，例如0.100～0.200或0.200～0.300。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒的zeta電位為-100～0mv，例如-100～-70mv、-80～-40mv、-60～-10mv或-40～0mv。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一修飾物與聚氰基丙烯酸酯的質(zhì)量比為0.5％～5％，例如0.5％～1％、1％～2％、2％～3％、3％～4％或4％～5％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二修飾物與聚氰基丙烯酸酯的質(zhì)量比為0.05％～2％，例如0.05％～0.1％、0.1％～0.5％、0.5％～1％、1％～1.5％或1.5％～2％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒表面的第二修飾物的濃度為5×10^-7ng/納米?！?×10^-6ng/納米粒，例如5×10^-7ng/納米?！?×10^-7ng/納米粒、6×10^-7ng/納米?！?×10^-7ng/納米粒、7×10^-7ng/納米?！?×10^-7ng/納米粒、8×10^-7ng/納米?！?×10^-7ng/納米粒或9×10^-7ng/納米?！?×10^-6ng/納米粒。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒包含聚氰基丙烯酸正丁酯，或主要由聚氰基丙烯酸正丁酯構(gòu)成，所述納米粒表面修飾有第一修飾物和第二修飾物，所述第一修飾物為聚乙二醇，所述第二修飾物選自卵磷脂、膽固醇、天冬氨酸和亮氨酸。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚乙二醇的數(shù)均分子量為10000～20000。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒的平均粒徑為100～400nm。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒的zeta電位為-40～0mv。

任選地，本發(fā)明的納米粒還含有穩(wěn)定劑，例如，所述穩(wěn)定劑選自環(huán)糊精(例如dex70)、聚乙烯吡咯烷酮(例如pvp-k30)和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆f68)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒由包含以下步驟的方法制得：

步驟1：使氰基丙烯酸正丁酯單體在酸性介質(zhì)中發(fā)生聚合反應(yīng)，所述酸性介質(zhì)中含有第一修飾物；優(yōu)選地，所述酸性介質(zhì)中還含有穩(wěn)定劑；

步驟2：向步驟1的反應(yīng)混合物中加入堿至反應(yīng)混合物呈中性，過濾，對(duì)濾液進(jìn)行冷凍干燥；

步驟3：將冷凍干燥的產(chǎn)物分散于緩沖溶液中，加入第二修飾物進(jìn)行孵育；

步驟4：從步驟3的混合物中分離出納米粒；優(yōu)選地，所述分離包括過濾和/或冷凍干燥。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述氰基丙烯酸正丁酯單體與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.05％～1％g/ml，例如0.05％～0.1％g/ml、0.1％～0.5％g/ml、0.1％-0.75％g/ml或0.75％～1％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述第一修飾物與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.5％-5％g/ml，例如0.5％～1％g/ml、0.5％～2％g/ml、1％～3％g/ml或3％～5％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述穩(wěn)定劑與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.05％～5％g/ml，例如0.5％～1％g/ml、0.5％～2％g/ml、1％～3％g/ml或3％～5％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述穩(wěn)定劑選自環(huán)糊精(例如dex70)、聚乙烯吡咯烷酮(例如pvp-k30)和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆f68)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酸性介質(zhì)為鹽酸溶液；優(yōu)選地，所述鹽酸溶液的ph為1.0～3.0。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟1的聚合反應(yīng)進(jìn)行1～10小時(shí)、例如1～5小時(shí)、2～6小時(shí)、3～7小時(shí)、4～8小時(shí)或5～10小時(shí)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟2中，所述堿為氫氧化鈉。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟2中，使用濾膜進(jìn)行過濾，優(yōu)選地，使用孔徑為0.45μm的濾膜進(jìn)行過濾。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟3中，所述第二修飾物與緩沖溶液的質(zhì)量/體積比為0.05％～2％g/ml，例如0.05％～0.1％g/ml、0.1％～0.5％g/ml、0.5％～1％g/ml或1％～2％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中，孵育的時(shí)間為0.5～5小時(shí)，例如0.5～1小時(shí)、1～2小時(shí)、2～3小時(shí)、3～4小時(shí)或4～5小時(shí)。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備如上所述的納米粒的方法，其包含以下步驟：

步驟1：使氰基丙烯酸正丁酯單體在酸性介質(zhì)中發(fā)生聚合反應(yīng)，所述酸性介質(zhì)中含有第一修飾物；優(yōu)選地，所述酸性介質(zhì)中還含有穩(wěn)定劑；

步驟2：向步驟1的反應(yīng)混合物中加入堿至反應(yīng)混合物呈中性，過濾，對(duì)濾液進(jìn)行冷凍干燥；

步驟3：將冷凍干燥的產(chǎn)物分散于緩沖溶液中，加入第二修飾物進(jìn)行孵育；

步驟4：從步驟3的混合物中分離出納米粒；優(yōu)選地，所述分離包括過濾和/或冷凍干燥。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述氰基丙烯酸正丁酯單體與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.05％～1％g/ml，例如0.05％～0.1％g/ml、0.1％～0.5％g/ml、0.1％-0.75％g/ml或0.75％～1％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述第一修飾物與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.5％-5％g/ml，例如0.5％～1％g/ml、0.5％～2％g/ml、1％～3％g/ml或3％～5％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述穩(wěn)定劑與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.05％～5％g/ml，例如0.5％～1％g/ml、0.5％～2％g/ml、1％～3％g/ml或3％～5％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述穩(wěn)定劑選自環(huán)糊精(例如dex70)、聚乙烯吡咯烷酮(例如pvp-k30)和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆f68)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酸性介質(zhì)為鹽酸溶液；優(yōu)選地，所述鹽酸溶液的ph為1.0～3.0。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟1的聚合反應(yīng)進(jìn)行1～10小時(shí)、例如1～5小時(shí)、2～6小時(shí)、3～7小時(shí)、4～8小時(shí)或5～10小時(shí)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟2中，所述堿為氫氧化鈉。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟2中，使用濾膜進(jìn)行過濾，優(yōu)選地，使用孔徑為0.45μm的濾膜進(jìn)行過濾。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟3中，所述第二修飾物與緩沖溶液的質(zhì)量體積比為0.05％～2％g/ml，例如0.05％～0.1％g/ml、0.1％～0.5％g/ml、0.5％～1％g/ml或1％～2％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中，孵育的時(shí)間為0.5～5小時(shí)，例如0.5～1小時(shí)、1～2小時(shí)、2～3小時(shí)、3～4小時(shí)或4～5小時(shí)。

本發(fā)明的納米粒的表面被兩種修飾物所修飾，任選地，所述修飾物的分子與聚氰基丙烯酸正丁酯的分子鏈相互纏結(jié)，從而固定在納米粒表面；或者通過例如氫鍵、分子間作用力或疏水作用吸附在納米粒表面；或者通過化學(xué)鍵連接在納米粒表面。

本發(fā)明的納米?？梢杂糜谪?fù)載藥物，以提高藥物的bbb通透性，并使藥物具有緩釋性。所述藥物可以包裹于納米粒的內(nèi)部，或者通過化學(xué)鍵連接于納米粒的表面。優(yōu)選地，所述藥物包裹于納米粒的內(nèi)部，以保證藥物被穩(wěn)定、有效地遞送。

因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種載藥體系，其含有如上所述的納米粒，所述納米粒負(fù)載有藥物。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物為紫杉醇類藥物(例如紫杉醇、多西紫杉醇、卡巴他賽或萊龍?zhí)┧兀瑑?yōu)選為多西紫杉醇)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物為熒光物質(zhì)(例如香豆素及其衍生物，例如香豆素-6)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物包裹于所述納米粒中。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載藥體系中，納米粒對(duì)藥物的包封率為80％～100％，例如80％～85％、85％～90％、90％～95％或95％～100％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載藥體系的載藥量為1％～10％，例如1％～3％、3％～5％、5％～7％或7％～10％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載藥體系由包含以下步驟的方法制得：

步驟1：使氰基丙烯酸正丁酯單體在酸性介質(zhì)中發(fā)生聚合反應(yīng)，所述酸性介質(zhì)中含有第一修飾物；優(yōu)選地，所述酸性介質(zhì)中還含有穩(wěn)定劑；

步驟2：向反應(yīng)混合物中加入藥物，之后繼續(xù)進(jìn)行聚合反應(yīng)；

步驟3：向反應(yīng)混合物中加入堿至反應(yīng)混合物呈中性，過濾，對(duì)濾液進(jìn)行冷凍干燥；

步驟4：將冷凍干燥的產(chǎn)物分散于緩沖溶液中，加入第二修飾物進(jìn)行孵育；

步驟5：從步驟4的混合物中分離出納米粒；優(yōu)選地，所述分離包括過濾和/或冷凍干燥。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述氰基丙烯酸正丁酯單體與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.05％～1％g/ml，例如0.05％～0.1％g/ml、0.1％～0.5％g/ml、0.1％-0.75％g/ml或0.75％～1％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述第一修飾物與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.5％-5％g/ml，例如0.5％～1％g/ml、0.5％～2％g/ml、1％～3％g/ml或3％～5％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述穩(wěn)定劑與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.05％～5％g/ml，例如0.5％～1％g/ml、0.5％～2％g/ml、1％～3％g/ml或3％～5％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述穩(wěn)定劑選自環(huán)糊精(例如dex70)、聚乙烯吡咯烷酮(例如pvp-k30)和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆f68)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酸性介質(zhì)為鹽酸溶液；優(yōu)選地，所述鹽酸溶液的ph為1.0～3.0。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟1的聚合反應(yīng)進(jìn)行1～10小時(shí)、例如1～5小時(shí)、2～6小時(shí)、3～7小時(shí)、4～8小時(shí)或5～10小時(shí)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物與氰基丙烯酸酯單體的質(zhì)量比為1～20:1、例如1～5:1、3～10:1、5～15:1或15～20:1。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟2中在加入藥物之后，聚合反應(yīng)進(jìn)行0.5～5小時(shí)，例如0.5～1小時(shí)、1～2小時(shí)、2～3小時(shí)、3～4小時(shí)或4～5小時(shí)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中，所述堿為氫氧化鈉。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中，使用濾膜進(jìn)行過濾，優(yōu)選地，使用孔徑為0.45μm的濾膜進(jìn)行過濾。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟4中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟4中，所述第二修飾物與緩沖溶液的質(zhì)量體積比為0.05％～2％g/ml，例如0.05％～0.1％g/ml、0.1％～0.5％g/ml、0.5％～1％g/ml或1％～2％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟4中，孵育的時(shí)間為0.5～5小時(shí)，例如0.5～1小時(shí)、1～2小時(shí)、2～3小時(shí)、3～4小時(shí)或4～5小時(shí)。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備如上所述的載藥體系的方法，其包含以下步驟：

步驟1：使氰基丙烯酸正丁酯單體在酸性介質(zhì)中發(fā)生聚合反應(yīng)，所述酸性介質(zhì)中含有第一修飾物；優(yōu)選地，所述酸性介質(zhì)中還含有穩(wěn)定劑；

步驟2：向反應(yīng)混合物中加入藥物，之后繼續(xù)進(jìn)行聚合反應(yīng)；

步驟3：向反應(yīng)混合物中加入堿至反應(yīng)混合物呈中性，過濾，對(duì)濾液進(jìn)行冷凍干燥；

步驟4：將冷凍干燥的產(chǎn)物分散于緩沖溶液中，加入第二修飾物進(jìn)行孵育；

步驟5：從步驟4的混合物中分離出納米粒；優(yōu)選地，所述分離包括過濾和/或冷凍干燥。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述氰基丙烯酸正丁酯單體與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.05％～1％g/ml，例如0.05％～0.1％g/ml、0.1％～0.5％g/ml、0.1％-0.75％g/ml或0.75％～1％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述第一修飾物與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.5％-5％g/ml，例如0.5％～1％g/ml、0.5％～2％g/ml、1％～3％g/ml或3％～5％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述穩(wěn)定劑與酸性介質(zhì)的質(zhì)量/體積比為0.05％～5％g/ml，例如0.5％～1％g/ml、0.5％～2％g/ml、1％～3％g/ml或3％～5％g/ml。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1中，所述穩(wěn)定劑選自環(huán)糊精(例如dex70)、聚乙烯吡咯烷酮(例如pvp-k30)和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆f68)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酸性介質(zhì)為鹽酸溶液；優(yōu)選地，所述鹽酸溶液的ph為1.0～3.0。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟1的聚合反應(yīng)進(jìn)行1～10小時(shí)、例如1～5小時(shí)、2～6小時(shí)、3～7小時(shí)、4～8小時(shí)或5～10小時(shí)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物與氰基丙烯酸酯單體的質(zhì)量比為1～20:1、例如1～5:1、3～10:1、5～15:1或15～20:1。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟2中在加入藥物之后，聚合反應(yīng)進(jìn)行0.5～5小時(shí)，例如0.5～1小時(shí)、1～2小時(shí)、2～3小時(shí)、3～4小時(shí)或4～5小時(shí)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中，所述堿為氫氧化鈉。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中，使用濾膜進(jìn)行過濾，優(yōu)選地，使用孔徑為0.45μm的濾膜進(jìn)行過濾。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟4中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟4中，所述第二修飾物與緩沖溶液的質(zhì)量體積比為0.05％～2％g/ml，例如0.05％～0.1％g/ml、0.1％～0.5％g/ml、0.5％～1％g/ml或1％～2％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟4中，孵育的時(shí)間為0.5～5小時(shí)，例如0.5～1小時(shí)、1～2小時(shí)、2～3小時(shí)、3～4小時(shí)或4～5小時(shí)。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上所述的納米粒用于制備載藥體系的用途，所述載藥體系含有負(fù)載了藥物的所述納米粒。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物為紫杉醇類藥物(例如紫杉醇、多西紫杉醇、卡巴他賽或萊龍?zhí)┧兀瑑?yōu)選為多西紫杉醇)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物為熒光物質(zhì)(例如香豆素及其衍生物，例如香豆素-6)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物包裹于所述納米粒中。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載藥體系中，納米粒對(duì)藥物的包封率為80％～100％，例如80％～85％、85％～90％、90％～95％或95％～100％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載藥體系的載藥量為1％～10％，例如1％～3％、3％～5％、5％～7％或7％～10％。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其含有如上所述的載藥體系。優(yōu)選地，藥物組合物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上所述的納米?；蜉d藥體系在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

本發(fā)明中，任選地，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的輔料(例如載體和/或賦形劑)。優(yōu)選地，所述載體和/或賦形劑選自:離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白(例如人血清蛋白)，甘油，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蜂蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物和羊毛脂。

本發(fā)明中，所述藥物組合物可以制成藥學(xué)上可接受的任一劑型。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以配制為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、注射劑(包括液體注射劑、注射用粉劑或注射用片劑)、栓劑、吸入劑或噴霧劑。

此外，本發(fā)明的所述藥物組合物還可以以任何合適的給藥方式，例如口服、胃腸外、直腸、經(jīng)肺或局部給藥等方式施用于受試者。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物適用于口服、胃腸外(靜脈內(nèi)、肌肉或皮下)，經(jīng)皮、經(jīng)舌或呼吸給藥。

當(dāng)用于口服給藥時(shí)，所述藥物組合物可制成口服制劑，例如口服固體制劑，如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑等；或，口服液體制劑，如口服溶液劑、口服混懸劑、糖漿劑等。當(dāng)制成口服制劑時(shí)，所述藥物組合物還可包含適宜的填充劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑等。當(dāng)用于腸胃外給藥時(shí)，所述藥物組合物可制成注射劑，包括包括液體注射劑、注射用粉劑或注射用片劑。當(dāng)制成注射劑時(shí)，所述藥物組合物可采用現(xiàn)有制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。當(dāng)配制注射劑時(shí)，所述藥物組合物中可以不加入附加劑，也可根據(jù)藥物的性質(zhì)加入適宜的附加劑。當(dāng)用于直腸給藥時(shí)，所述藥物組合物可制成栓劑等。用于經(jīng)肺給藥時(shí)，所述藥物組合物可制成吸入劑或噴霧劑等。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的納米?；蜉d藥體系以單位劑量的形式存在于藥物組合物或藥物中。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予受試者有效量的所述藥物組合物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預(yù)防疾病(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病)有效量是指，足以預(yù)防，阻止，或延遲疾病(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病)的發(fā)生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發(fā)癥的量。測(cè)定這樣的有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，對(duì)于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴(yán)重度、患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時(shí)施用的其他治療等等。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，包括給受試者施用如上所述的載藥體系或藥物組合物。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種提高藥物透過受試者血腦屏障的能力的方法，包括使用如上所述的納米粒負(fù)載藥物。優(yōu)選地，所述藥物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)藥物透過受試者血腦屏障的方法，包括使用如上所述的納米粒負(fù)載藥物，并將藥物施用于受試者體內(nèi)。優(yōu)選地，所述藥物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

例如，本發(fā)明實(shí)施例中，使用雙重修飾的納米粒負(fù)載藥物，可以提高藥物透過大鼠血腦屏障的能力，使藥物在大鼠腦組織中的含量得到提高。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上所述的納米粒的用途，所述納米粒用于提高藥物透過受試者血腦屏障的能力。優(yōu)選地，所述藥物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上所述的納米粒的用途，所述納米粒用于促進(jìn)藥物透過受試者的血腦屏障。優(yōu)選地，所述藥物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上所述的納米粒，所述納米粒用于提高藥物透過受試者血腦屏障的能力。優(yōu)選地，所述藥物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上所述的納米粒，所述納米粒用于促進(jìn)藥物透過受試者的血腦屏障。優(yōu)選地，所述藥物用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上所述的載藥體系，所述載藥體系用于診斷、預(yù)防和/或治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自腦腫瘤、腦卒中、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脫髓鞘病、多發(fā)性硬化、精神分裂癥、抑郁癥和中樞神經(jīng)損傷。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述受試者為哺乳動(dòng)物；例如?？苿?dòng)物、馬科動(dòng)物、羊科動(dòng)物、豬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物；例如，人。

有益效果

本發(fā)明提供的雙重修飾的pbca納米粒，相比于使用吐溫-80等表面活性劑修飾的pbca納米粒，更加安全有效。本發(fā)明的納米粒可以透過bbb到達(dá)腦部，具有明顯的血腦屏障通透性并在腦組織內(nèi)有效富集。

將藥物負(fù)載在本發(fā)明的納米粒中，可以有效提高藥物的腦內(nèi)濃度和腦靶向性，并使藥物具有良好的緩釋性，可以在體內(nèi)長(zhǎng)效、穩(wěn)定地釋放。本發(fā)明的納米粒和載藥體系可以提高藥物的bbb通透性，促進(jìn)藥物進(jìn)入腦部，從而更有利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、預(yù)防和/或治療。

下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說將變得顯然。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中，負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的粒徑測(cè)量結(jié)果(a)和zeta電位測(cè)量結(jié)果(b)，由圖中可以看出，所述納米粒具有窄的粒徑分布，平均粒徑為185.4nm，zeta電位為-0.66mv。

圖2為實(shí)施例2中，負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾pbca納米粒(圖2(a))及負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒(圖2(b))的tem圖。由圖中可以看出，膽固醇單修飾pbca納米粒及peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒，納米粒大小均勻，粒徑在200nm左右，而且分散性較好，沒有大規(guī)模團(tuán)聚現(xiàn)象，同時(shí)兩種納米粒形貌差異不大，說明peg20000-膽固醇雙重修飾對(duì)于納米粒的形態(tài)影響不大。

圖3為實(shí)施例2中，負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果。其中，圖3(a)-3(c)分別為mpeg20000、膽固醇和香豆素-6的dsc譜圖。由圖中可以看出，mpeg20000、膽固醇和香豆素-6的熔融峰分別位于68.21℃、149.98℃和208.29℃。圖3(d)為負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的dsc圖譜。圖中，mpeg20000和膽固醇的熔融峰依然存在，說明peg20000和膽固醇沒有進(jìn)入納米粒內(nèi)部，而是修飾于納米粒表面；香豆素-6的熔融峰消失，說明香豆素-6被包裹在納米粒內(nèi)部。

圖4(a)比較了實(shí)施例4中，負(fù)載香豆素-6的普通納米粒、負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒和負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的體外釋放曲線(n＝6，n為平行測(cè)試的次數(shù)，以下n的含義相同)。如圖所示，與普通納米粒和膽固醇單修飾納米粒相比，peg20000-膽固醇雙重修飾的納米粒具有明顯的緩釋性和改善的釋放穩(wěn)定性。

圖4(b)比較了實(shí)施例4中，負(fù)載香豆素-6的普通納米粒、負(fù)載香豆素-6的peg20000單修飾納米粒和負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒的體外釋放曲線(n＝6)。如圖所示，與未經(jīng)修飾的納米粒及peg20000單修飾納米粒相比，peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒具有更顯著的緩釋特性。

圖5為實(shí)施例5中，香豆素-6溶液(原藥)、負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒和負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的血藥濃度-時(shí)間曲線(n＝6)。如圖所示，peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在體內(nèi)能夠持續(xù)釋放12小時(shí)，與原藥溶液和膽固醇單修飾納米粒相比，具有更長(zhǎng)的釋放時(shí)間，并且同一時(shí)間內(nèi)具有更高的血藥濃度。

圖6(a)為實(shí)施例6中，大鼠在分別靜脈注射香豆素-6溶液(原藥)、負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒和負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒后，不同時(shí)間點(diǎn)的腦組織中香豆素-6的含量(n＝3)。圖中，peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒相對(duì)于原藥溶液和膽固醇單修飾納米粒，p均小于0.01。如圖所示，負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾納米?？梢允勾笫竽X組織中的香豆素-6的含量明顯提高，明顯高于注射香豆素-6溶液(原藥)和負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒，并且具有緩慢釋放的過程。

圖6(b)為實(shí)施例6中，注射了不同樣品的大鼠腦組織中的香豆素-6的含量，從左到右依次為注射原藥溶液、注射普通納米粒、注射peg20000單修飾pbca納米粒和注射peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的大鼠的腦組織中的香豆素-6的含量。圖中，**：p<0.05vs原藥溶液組；##：p<0.05vs普通納米粒組；&&:p<0.05vspeg單修飾納米粒組。如圖所示，peg20000單修飾pbca納米粒與原藥溶液及普通pbca納米粒相比，腦組織中的香豆素-6的含量顯著增高(p<0.01)。而本發(fā)明的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒可以使腦組織中的香豆素-6的含量相比peg20000單修飾pbca納米粒顯著增高(p<0.01)。結(jié)果表明，peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒具有良好的bbb透過性，可以顯著促進(jìn)藥物通過血腦屏障。

圖7顯示了實(shí)施例7中，不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠組織中香豆素-6的濃度。由圖中可以看出，相比于膽固醇單修飾納米粒，peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒在各組織臟器中沒有顯著的蓄積，并且在肝、脾中的含量明顯低于單修飾納米粒。上述結(jié)果說明，負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒體內(nèi)安全性更好。

圖8顯示了實(shí)施例8中，分別給予(a)膽固醇、(b)peg20000、(c)pbca、(d)空白peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒、(e)負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒后，bend.3細(xì)胞的細(xì)胞存活率，圖中，橫坐標(biāo)軸為給藥濃度，縱坐標(biāo)軸為細(xì)胞存活率。如圖所示，膽固醇、peg20000、pbca、空白納米粒以及載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)bend.3細(xì)胞均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性(細(xì)胞存活率>80％)。上述結(jié)果說明，空白載體及peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒體外安全性良好。

圖9為實(shí)施例9中，分別靜脈給予大鼠多西紫杉醇原藥溶液和負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒后，血藥濃度-時(shí)間曲線(n＝6)，如圖所示，負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在體內(nèi)具有更長(zhǎng)的釋放時(shí)間和更高的血藥濃度。

圖10為實(shí)施例10中，分別靜脈給予大鼠多西紫杉醇溶液(原藥)和負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒后，大鼠腦組織中多西紫杉醇的含量(n＝3)。如圖所示，多西紫杉醇原藥基本不能透過血腦屏障，在腦中未能檢出；而負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米?？梢酝高^血腦屏障，并且可以使藥物在腦中緩慢釋放。

圖11為實(shí)施例11中，分別給予多西紫杉醇(原藥)和負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒后，小鼠乳腺癌4t1細(xì)胞的細(xì)胞存活率，圖中，橫坐標(biāo)軸為給藥濃度(以多西紫杉醇的濃度計(jì)量)，縱坐標(biāo)軸為細(xì)胞存活率；n＝5；peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒相對(duì)于原藥溶液，p小于0.01。圖(a)和圖(b)分別為給藥后培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后的結(jié)果。如圖所示，與多西紫杉醇原藥相比，在給藥濃度和培養(yǎng)時(shí)間相同的情況下，負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值具有更強(qiáng)的抑制作用，并且顯示出一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。

圖12為實(shí)施例13中，負(fù)載香豆素-6的peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒，以及負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca納米粒的體外釋放曲線(n＝6)。如圖所示，與未經(jīng)修飾的納米粒相比，peg20000-亮氨酸雙重修飾納米粒具有更顯著的緩釋特性。

圖13為實(shí)施例15中，負(fù)載香豆素-6的peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒，以及負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca納米粒的體外釋放曲線(n＝6)。如圖所示，與未經(jīng)修飾的納米粒相比，peg20000-天冬氨酸雙重修飾納米粒具有更顯著的緩釋特性。

圖14為實(shí)施例17中，負(fù)載香豆素-6的peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒，以及負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca納米粒的體外釋放曲線(n＝6)。如圖所示，與未經(jīng)修飾的納米粒相比，peg20000-卵磷脂雙重修飾納米粒具有更顯著的緩釋特性。

圖15為實(shí)施例18中，注射了不同樣品的大鼠腦組織中的香豆素-6的含量，從左到右依次為注射原藥溶液、注射普通納米粒、注射peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒、注射peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒和注射peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒的大鼠的腦組織中的香豆素-6的含量。三種雙重修飾納米粒相對(duì)于原藥溶液和普通納米粒，p均小于0.01。如圖所示，與原藥溶液及普通pbca納米粒相比，本發(fā)明的上述三種雙重修飾納米?？梢允鼓X組織中的香豆素-6的含量顯著增高，增加藥物的bbb通透性。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1.負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的制備及評(píng)價(jià)

(1)負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的制備方法：將穩(wěn)定劑dex70(1％，w/v)與數(shù)均分子質(zhì)量為20000的甲氧基聚乙二醇(mpeg20000)(1.5％，w/v)溶于ph1.0的鹽酸介質(zhì)中，在室溫和磁力攪拌的條件下逐滴緩慢加入bca單體(1％，v/v)，以500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌4h后，加入香豆素-6(1％，w/v)，以750rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2.5h，之后用naoh中和體系ph至6-7，繼續(xù)攪拌lh使得bca單體充分聚合，即得peg-pbca納米粒。

得到的peg-pbca納米粒通過0.45μm濾膜過濾后，冷凍干燥，之后復(fù)溶于pbs，混勻30min。加入膽固醇(l％，w/v)，孵育0.5h，過濾，以20000rpm的速率離心30min，去除上清液，用適量雙蒸水重懸沉淀后，冷凍干燥，即得負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒，將其保存在干燥器中。

負(fù)載香豆素-6的peg20000單修飾pbca納米粒的制備方法：將穩(wěn)定劑dex70(1％，w/v)與mpeg20000(1.5％，w/v)溶于ph1.0的鹽酸介質(zhì)中，然后在室溫、磁力攪拌下逐滴緩慢加入bca單體(1％，v/v)，以500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌4h后，加入香豆素-6(1％，w/v)，以750rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2.5h，之后用naoh中和體系ph至6-7，繼續(xù)攪拌lh使得bca單體充分聚合，即得負(fù)載香豆素-6的peg20000單修飾pbca納米粒。得到的納米粒通過0.45μm濾膜過濾后，冷凍干燥，將其保存在干燥器中，用作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

按照上述方法制備包含香豆素-6的、未經(jīng)修飾的pbca普通納米粒，以及負(fù)載香豆素-6的、膽固醇單修飾納米粒，作為對(duì)照。

(2)粒徑和電位的測(cè)定及結(jié)果：將負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，超聲30min，使溶液充分混勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液于25℃下測(cè)定粒徑和電位，結(jié)果見圖1。圖1(a)為納米粒的粒徑測(cè)量結(jié)果，圖1(b)為納米粒的zeta電位測(cè)量結(jié)果。由圖中可以看出，負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒具有窄的粒徑分布，平均粒徑為185.4nm，pdi為0.133，zeta電位為-0.66mv。

按照上述方法測(cè)定負(fù)載香豆素-6的peg20000單修飾pbca納米粒的粒徑和zeta電位，其平均粒徑為194.3nm，pdi為0.159，zeta電位為-8.04mv。

(3)包封率及載藥量的測(cè)定及結(jié)果：取負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米?；鞈乙?00μl于vivaspin超濾離心管(mwco：2000，德國(guó)sartorius公司)，以4000rpm的速率離心20min，將未包裹入進(jìn)納米粒的游離藥物分離至超濾離心管下層，取下層溶液，使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定香豆素-6的濃度，計(jì)算包封率。

取負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒混懸液20μl，加入1980μl乙腈，震蕩30s，破壞納米粒結(jié)構(gòu)，使藥物釋放出來(lái)，使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定香豆素-6的濃度，計(jì)算載藥量。

結(jié)果：負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒包封率為97.8％，載藥量為2.07％。

按照上述方法測(cè)定負(fù)載香豆素-6的peg20000單修飾pbca納米粒的包封率及載藥量，分別為98.6％和2.03％

實(shí)施例2.負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的形貌和結(jié)構(gòu)表征

(1)形貌表征

方法：采用透射電鏡(transmissionelectronmicroscope，tem)對(duì)負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾pbca納米粒及負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒進(jìn)行形貌表征。稱取一定量冷凍干燥后的納米粒，用純水稀釋至納米粒濃度0.5mg/ml，振搖100次充分搖勻，吸取5μl滴在銅網(wǎng)formvar膜上，至快干時(shí)滴加1滴1％(w/v)的磷鎢酸水溶液，染色2min，小心吸去大量液體，剩一層液膜，待液膜完全干燥后，用tem觀察。

結(jié)果：上述兩個(gè)樣品的tem圖見圖2。圖2(a)和(b)分別為負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾pbca納米粒及負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的tem圖。由圖中可以看出，膽固醇單修飾pbca納米粒及peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒，納米粒大小均勻，粒徑在200nm左右，而且分散性較好，沒有大規(guī)模團(tuán)聚現(xiàn)象，同時(shí)兩種納米粒形貌差異不大，說明peg20000-膽固醇雙重修飾對(duì)于納米粒的形態(tài)影響不大。

(2)結(jié)構(gòu)表征

方法：采用差示掃描量熱法(differentialscanningcalorimetry,dsc)對(duì)負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。分別稱取香豆素-6、mpeg20000、膽固醇和負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒各約5mg置于tzero鋁盤(美國(guó)waters公司)，加密封蓋，參比盤為空白tzero鋁盤，降溫至0℃，在0℃等溫5min后以10℃/min的速率升溫。

結(jié)果：上述四個(gè)樣品的dsc譜圖見圖3。

圖3(a)-(c)分別為mpeg20000、膽固醇和香豆素-6的dsc譜圖。由圖中可以看出，mpeg20000、膽固醇和香豆素-6的熔融峰分別位于68.21℃、149.98℃和208.29℃。

圖3(d)為負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的dsc圖譜。圖中，mpeg20000和膽固醇的熔融峰依然存在，說明peg20000和膽固醇沒有進(jìn)入納米粒內(nèi)部，而是修飾于納米粒表面；香豆素-6的熔融峰消失，說明香豆素-6被包裹在納米粒內(nèi)部。此外，從圖中可以看出，聚氰基丙烯酸正丁酯從約300℃開始發(fā)生交聯(lián)，316.45℃處有一明顯的吸熱峰。

實(shí)施例3測(cè)量負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒表面的膽固醇的濃度

(1)方法：使用膽固醇定量試劑盒(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa))測(cè)量納米粒表面的膽固醇的質(zhì)量。納米粒的平均個(gè)數(shù)(n)由下式計(jì)算得到(olivieretal.,2002):

其中，w為納米粒的質(zhì)量，d為通過納米粒的平均粒徑算得的納米粒的個(gè)數(shù)，ρ為密度，即單位體積的納米粒的質(zhì)量，為1.1g/cm³。

按照下式計(jì)算納米粒表面的膽固醇濃度：

納米粒表面的膽固醇濃度＝納米粒表面的膽固醇的質(zhì)量/納米粒的平均個(gè)數(shù)。

(2)結(jié)果：計(jì)算得到負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒表面的膽固醇的濃度為(8.5±0.4)×10^-7ng/納米粒。

實(shí)施例4.負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的體外釋放研究

(1)方法：取負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米?；鞈乙?ml，置于透析袋(mwco：20000，usa)內(nèi)，將透析袋放入200mlph7.4的磷酸鹽緩沖液(pbs)中，37℃恒溫水浴及避光條件下，以100rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，分別于不同時(shí)間點(diǎn)吸取200μl釋放液并補(bǔ)液。將取出的釋放介質(zhì)以空白pbs作為對(duì)照，采用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定香豆素-6的濃度，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6份樣品平行測(cè)量。以相同的方法測(cè)量負(fù)載香豆素-6的普通納米粒、膽固醇單修飾納米粒和peg20000單修飾pbca納米粒的體外釋放曲線，作為對(duì)照。(2)結(jié)果：各組樣品的釋放曲線見圖4(a)和4(b)。

圖4(a)比較了負(fù)載香豆素-6的普通納米粒、膽固醇單修飾納米粒和peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒的體外釋放行為。由圖中可以看出，與普通納米粒相比，peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒的體外釋放行為具有顯著差異(f2＝25.89，<50)

(f2方程為評(píng)價(jià)兩種制劑的釋放度行為的常用標(biāo)準(zhǔn)，其公式為：

其中，rt為參比樣品t時(shí)的釋放度；tt為試驗(yàn)樣品t時(shí)的釋放度；n為取樣點(diǎn)的個(gè)數(shù)。

fda規(guī)定，f2值在50～100之間，即可以認(rèn)為兩種制劑在同一釋藥條件中的釋藥行為沒有差別，f2小于50，則認(rèn)為兩者具有顯著差異。)

普通納米粒在24小時(shí)內(nèi)即釋放完畢，并且在短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)較高的釋放度。peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒的釋放時(shí)間在48小時(shí)以上，并且在短時(shí)間內(nèi)沒有突釋現(xiàn)象，一方面表明香豆素-6基本都包封在雙重修飾納米粒內(nèi)部，另一方面表明雙重修飾納米粒具有顯著的緩釋特性。與膽固醇單修飾納米粒相比，peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒在相同時(shí)間內(nèi)的釋放度較低，說明其在體外具有更加穩(wěn)定的釋放行為。

上述結(jié)果表明，與未經(jīng)修飾的普通納米粒或膽固醇單修飾納米粒相比，peg20000-膽固醇雙重修飾的納米粒在體外具有明顯的緩釋性和更好的釋放穩(wěn)定性。

圖4(b)比較了負(fù)載香豆素-6的普通納米粒、peg20000單修飾納米粒和peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒的體外釋放行為。由圖中可以看出，peg20000單修飾納米粒的體外釋放行為與普通納米粒相比具有顯著差異(f2＝29.69，<50)，與peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒相比沒有顯著差異(f2＝73.93，>50)，但12小時(shí)后，雙重修飾納米粒具有更好的體外緩釋特性。上述結(jié)果表明，與未經(jīng)修飾的納米粒及peg20000單修飾納米粒相比，peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒具有更顯著的緩釋特性。

實(shí)施例5.負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的藥代動(dòng)力學(xué)研究

(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯控?fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在動(dòng)物體內(nèi)的緩釋性。

(2)方法：取6-8周齡的雄性wistar大鼠，隨機(jī)分為3組，每組6只，腹腔注射戊巴比妥溶液(40mg/kg)麻醉，進(jìn)行頸靜脈插管手術(shù)，手術(shù)恢復(fù)至少12h后，分別通過尾靜脈注射給予等摩爾量的香豆素-6溶液(原藥)、實(shí)施例1制備的負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒和peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒。于給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)(5min、15min、30min、45min、1h、2h、4h、8h、12h)于頸靜脈插管處取血200μl，處理后測(cè)定血液中香豆素-6的含量。

(3)結(jié)果：圖5顯示了各組樣品的血藥濃度-時(shí)間曲線。圖中，縱坐標(biāo)為血液中香豆素-6的濃度，橫坐標(biāo)為時(shí)間。由圖中可以看出，大鼠靜脈給藥后，不同樣品的血藥濃度-時(shí)間曲線有明顯差異。原藥溶液給藥后僅4h內(nèi)能夠在血液中檢測(cè)到藥物，釋放時(shí)間最短，沒有緩釋效果；膽固醇單修飾納米粒給藥后的釋放時(shí)間與原藥溶液相比較長(zhǎng)，為8h；peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒(cls-pegnps)在體內(nèi)能夠持續(xù)釋放12小時(shí)，與原藥溶液和膽固醇單修飾納米粒(clsnps)相比，具有更長(zhǎng)的釋放時(shí)間，并且同一時(shí)間內(nèi)具有更高的血藥濃度。各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

表1

^*p<0.05,^**p<0.01vs.游離藥物組

上述結(jié)果表明，與原藥溶液和膽固醇單修飾納米粒相比，peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒在動(dòng)物體內(nèi)具有顯著更長(zhǎng)的釋放時(shí)間和更高的血藥濃度，具有更好的釋放行為，并且具有較高的生物利用度。

實(shí)施例6.負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的腦組織分布研究

研究目的：研究peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在動(dòng)物體內(nèi)的腦靶向性。

實(shí)驗(yàn)1

(1)方法：取6-8周齡的雄性wistar大鼠，隨機(jī)分為3組，每組21只，分別通過尾靜脈注射給予等摩爾量的香豆素-6溶液(原藥)、實(shí)施例1制備的負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒和peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒。分別在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)(15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h)處死大鼠，取腦組織，測(cè)定腦內(nèi)香豆素-6的含量。

(2)結(jié)果：圖6(a)顯示了不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織中香豆素-6的濃度。由圖中可以看出，注射了原藥溶液的大鼠的腦組織中的香豆素-6的含量很低，均不超過50ng/g腦組織，且在給藥8h后，腦組織中檢測(cè)不到香豆素-6，這說明香豆素-6原藥的bbb透過性較低，且不具有緩釋性。注射了負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒的大鼠，其腦組織中的香豆素-6的含量明顯高于注射了香豆素-6原藥的大鼠，但在8小時(shí)后，檢測(cè)不到腦中的香豆素-6。注射了負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒的大鼠，其腦組織中香豆素-6的含量比注射膽固醇單修飾納米粒的大鼠有了進(jìn)一步的提高，且在12小時(shí)后仍能腦中檢出香豆素-6。

上述結(jié)果表明，與香豆素-6原藥和負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒相比，負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒具有良好的bbb透過性，可以明顯促進(jìn)藥物通過血腦屏障，并且具有緩慢釋放的過程。

實(shí)驗(yàn)2

(1)方法：取6-8周齡的雄性wistar大鼠，隨機(jī)分為4組，每組3只，分別尾靜脈注射給予等摩爾量的香豆素-6溶液(原藥)、負(fù)載香豆素-6的普通納米粒、負(fù)載香豆素-6的peg20000單修飾pbca納米粒和負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒。分別在給藥后30min處死大鼠，取腦組織，測(cè)定腦內(nèi)香豆素-6的含量。

(2)結(jié)果：圖6(b)顯示了大鼠腦組織中的香豆素-6的含量，從左到右依次為注射原藥溶液、注射普通納米粒、注射peg20000單修飾pbca納米粒和注射peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的大鼠的腦組織中的香豆素-6的含量。

如圖所示，peg20000單修飾pbca納米粒與原藥溶液及普通pbca納米粒相比，腦組織中的香豆素-6的含量顯著增高(p<0.01)。而本發(fā)明的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米?？梢允鼓X組織中的香豆素-6的含量相比peg20000單修飾pbca納米粒顯著增高(p<0.01)。結(jié)果表明，與香豆素-6原藥和負(fù)載香豆素-6的peg20000單修飾納米粒相比，負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒具有良好的bbb透過性，可以顯著促進(jìn)藥物通過血腦屏障。

實(shí)施例7.負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的組織分布研究

(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯縫eg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在動(dòng)物體內(nèi)的組織分布情況，考察其體內(nèi)毒性。

(2)方法：取6-8周齡的雄性wistar大鼠，隨機(jī)分為3組，每組21只，分別通過尾靜脈注射給予等摩爾量的香豆素-6溶液(原藥)、實(shí)施例1制備的負(fù)載香豆素-6的膽固醇單修飾納米粒和peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒。分別在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)(15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h)處死大鼠，取心、肝、脾、肺、腎組織，測(cè)定其中的香豆素-6含量。

(3)結(jié)果：圖7顯示了不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠組織中香豆素-6的濃度。由圖中可以看出，相比于膽固醇單修飾納米粒，peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒在各組織臟器中沒有顯著的蓄積，并且在肝、脾中的含量明顯低于單修飾納米粒。上述結(jié)果說明，負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒體內(nèi)安全性更好。

實(shí)施例8.負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的體外安全性考察

(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模嚎疾靝eg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的細(xì)胞毒性

(2)實(shí)驗(yàn)方法：采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。具體步驟為：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bend.3細(xì)胞(小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞)，消化計(jì)數(shù)后以5×10⁴/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。在5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸棄舊培養(yǎng)基，分別加入含系列濃度(5、10、20、50、100、200、500和1000μg/ml)的膽固醇、peg20000和pbca，以及含系列濃度(1、2、5、10、20、50、100和200μg/ml)的空白peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒和負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的培養(yǎng)基各200μl，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔分別加入含0.5mg/ml的mtt的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄培養(yǎng)液，pbs潤(rùn)洗兩遍，加入200μldmso溶解甲臢結(jié)晶，避光振搖10min；然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm處的od值。以未加藥物的培養(yǎng)細(xì)胞的od值作為對(duì)照(100％)，計(jì)算各給藥組的細(xì)胞存活率，以考察細(xì)胞的存活情況，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖8顯示了分別給予(a)膽固醇、(b)peg20000、(c)pbca、(d)空白peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒、(e)負(fù)載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒后，bend.3細(xì)胞的細(xì)胞存活率，圖中，橫坐標(biāo)軸為給藥濃度，縱坐標(biāo)軸為細(xì)胞存活率。

如圖所示，膽固醇、peg20000、pbca、空白納米粒以及載香豆素-6的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)bend.3細(xì)胞均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性(細(xì)胞存活率>80％)。上述結(jié)果說明，空白載體及peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒體外安全性良好。

實(shí)施例9.負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的藥代動(dòng)力學(xué)研究

(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模憾辔髯仙即紴橹委熑橄侔┖头切〖?xì)胞肺癌的藥品，但是其臨床上多為靜脈滴注給藥，不易透過血腦屏障。

本實(shí)驗(yàn)的目的是以多西紫杉醇為例，將不易透過血腦屏障的藥物負(fù)載到本發(fā)明的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒中，觀察其靜脈注射后的緩釋情況。

(2)方法：按照實(shí)施例1的方法制備負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒，并對(duì)其進(jìn)行表征。負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒具有窄的粒徑分布，平均粒徑為200.7nm，pdi為0.122，zeta電位為-2.11mv；包封率為98.8％，載藥量為2.13％。

取6-8周齡的雄性wistar大鼠進(jìn)行頸靜脈插管手術(shù)，手術(shù)恢復(fù)至少12h后，將大鼠隨機(jī)分為2組，每組6只，分別尾靜脈注射給予多西紫杉醇溶液(原藥)和負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒。于給藥后不同時(shí)間點(diǎn)于頸靜脈插管處取血200μl，處理后用hplc測(cè)定血液中多西紫杉醇的含量。

(3)結(jié)果：圖9顯示了大鼠靜脈給藥后，多西紫杉醇原藥溶液和負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的血藥濃度-時(shí)間曲線，由圖中可以看出，兩者具有明顯差異。負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在體能可以持續(xù)釋放8小時(shí)，而原藥溶液在給藥2小時(shí)后無(wú)法在血液中檢測(cè)到。并且，負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒在體內(nèi)具有更高的血藥濃度。

實(shí)施例10.負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的腦組織分布研究

(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕緦?shí)驗(yàn)的目的是以多西紫杉醇為例，將不易透過bbb的藥物負(fù)載到本發(fā)明的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒中，觀察其靜脈注射后透過bbb進(jìn)入腦組織的情況。如果多西紫杉醇在腦組織中的濃度增高，則表明本發(fā)明的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒具有腦靶向性，能夠?qū)⒉灰淄高^bbb的藥物載入腦組織。

(2)方法：取6-8周齡的雄性wistar大鼠進(jìn)行頸靜脈插管手術(shù)，手術(shù)恢復(fù)至少12h后，將大鼠隨機(jī)分為2組，每組6只，分別尾靜脈注射給予多西紫杉醇溶液(原藥)、以及負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒。分別在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取腦組織，用生理鹽水洗滌并稱重。處理后用hplc測(cè)定腦組織中多西紫杉醇的含量。

(3)結(jié)果：圖10顯示了大鼠靜脈給藥后不同時(shí)間，腦組織中多西紫杉醇的含量。如圖所示，靜脈給藥后，多西紫杉醇原藥基本不能透過血腦屏障，在腦中未能檢出；而負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米?？梢酝高^血腦屏障，使腦組織中多西紫杉醇的含量顯著增高，且8小時(shí)后腦組織中仍能檢測(cè)出藥物。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米?？梢源龠M(jìn)多西紫杉醇透過血腦屏障，并且可以使藥物在腦中緩慢釋放。

實(shí)施例11.負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果

(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕緦?shí)驗(yàn)的目的是以多西紫杉醇為例，觀察藥物負(fù)載到peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒后的藥效作用。

(2)方法：采用mtt法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖情況。具體步驟為：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4t1細(xì)胞(小鼠乳腺癌細(xì)胞)，消化計(jì)數(shù)后以5×10⁴/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。在5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸棄舊培養(yǎng)基，分別加入含系列濃度(0.0001、0.001、0.01、1、10和100nmol/ml)的多西紫杉醇(原藥)和負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒(給藥濃度按照其負(fù)載的多西紫杉醇的量計(jì)算)的培養(yǎng)基各200μl，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔分別加入含0.5mg/ml的mtt的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄培養(yǎng)液，pbs潤(rùn)洗兩遍，加入200μldmso溶解甲臢結(jié)晶，避光振搖10min；然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm處的od值。以未加藥物的培養(yǎng)細(xì)胞的od值作為對(duì)照(100％)，計(jì)算各給藥組的細(xì)胞存活率，以考察腫瘤細(xì)胞的增殖情況，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。

(3)結(jié)果：圖11為分別給予多西紫杉醇(原藥)和負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾pbca納米粒后，小鼠乳腺癌4t1細(xì)胞的細(xì)胞存活率，圖中，橫坐標(biāo)軸為給藥濃度(以多西紫杉醇的濃度計(jì)量)，縱坐標(biāo)軸為細(xì)胞存活率。圖11(a)和圖11(b)分別為給藥后培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后的結(jié)果。

如圖所示，濃度為0.0001nmol/ml的負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒在給藥24小時(shí)后即可使腫瘤細(xì)胞的存活率降至約90％，而給予多西紫杉醇原藥的腫瘤細(xì)胞在給藥24小時(shí)后，細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化。與多西紫杉醇原藥相比，在給藥濃度和培養(yǎng)時(shí)間相同的情況下，負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值具有更強(qiáng)的抑制作用，并且顯示出一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，給藥濃度越高，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增值的抑制作用明顯。

上述結(jié)果表明，與多西紫杉醇原藥相比，負(fù)載多西紫杉醇的peg20000-膽固醇雙重修飾納米?？梢愿玫匾种颇[瘤細(xì)胞的增殖。相比于原藥溶液，藥物負(fù)載于本發(fā)明的雙重修飾pbca納米粒中，不僅未減低原藥的藥效，反而具有更好的治療效果。

實(shí)施例12.負(fù)載香豆素-6的peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒的制備及評(píng)價(jià)

(1)制備方法：將穩(wěn)定劑dex70(1％，w/v)與mpeg20000(1.5％，w/v)溶于ph1.0的鹽酸介質(zhì)中，然后在室溫、磁力攪拌下逐滴緩慢加入bca單體(1％，v/v)，以500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌4h后，加入香豆素-6(1％，w/v)，以750rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2.5h，之后用naoh中和體系ph至6-7，繼續(xù)攪拌lh，使得bca單體充分聚合，即得peg-pbca納米粒。得到的納米粒通過0.45μm濾膜過濾后，冷凍干燥，之后復(fù)溶于pbs，混勻30min。加入亮氨酸(l％，w/v)，孵育0.5h，過濾后冷凍干燥，即得負(fù)載香豆素-6的peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒，將其保存在干燥器中。

按照上述方法制備負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca普通納米粒作為對(duì)照。

(2)粒徑和電位的測(cè)定及結(jié)果：按照實(shí)施例1的方法測(cè)定負(fù)載香豆素-6的peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒的粒徑和zeta電位，平均粒徑為167.3nm，pdi為0.138，zeta電位為-9.63mv。

(3)包封率及載藥量的測(cè)定及結(jié)果：按照實(shí)施例1的方法測(cè)定香豆素-6的包封率及載藥量，分別為98.1％和2.04％。

實(shí)施例13.負(fù)載香豆素-6的peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒的體外釋放研究

(1)方法：取peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒1ml，置于透析袋(mwco：20000，usa)內(nèi)，將透析袋放入200mlph7.4磷酸鹽緩沖液(pbs)中，37℃恒溫水浴、避光條件下，以100rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，24小時(shí)內(nèi)分別于不同時(shí)間點(diǎn)吸取200μl釋放液并補(bǔ)液。將取出的釋放介質(zhì)以空白pbs作為對(duì)照，測(cè)定香豆素-6的濃度，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6份樣品平行測(cè)量。以相同的方法對(duì)負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca納米粒進(jìn)行測(cè)定。

(2)結(jié)果：圖12為負(fù)載香豆素-6的peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒，以及負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca納米粒的體外釋放曲線。由圖中可以看出，peg20000-亮氨酸雙重修飾納米粒的體外釋放行為與普通納米粒相比具有顯著差異(f2＝32.88，<50)。與未經(jīng)修飾的納米粒相比，peg20000-亮氨酸雙重修飾納米粒具有更顯著的緩釋特性，說明其具有更好的穩(wěn)定性，有利于其在體內(nèi)有更好的bbb通透性。

實(shí)施例14.負(fù)載香豆素-6的peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒的制備及評(píng)價(jià)

(1)制備方法：將穩(wěn)定劑dex70(1％，w/v)與mpeg20000(1.5％，w/v)溶于ph1.0的鹽酸介質(zhì)中，然后室溫、磁力攪拌下逐滴緩慢加入bca單體(1％，v/v)，以500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌4h后，加入香豆素-6(1％，w/v)，以750rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2.5h，之后用naoh中和體系ph至6-7，繼續(xù)攪拌lh使得bca單體充分聚合，即得peg-pbca納米粒。得到的納米粒通過0.45μm濾膜過濾后，冷凍干燥，之后復(fù)溶于pbs，混勻30min。加入l-天冬氨酸(l％，w/v)，孵育0.5h，過濾后冷凍干燥，即得peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒，將其保存在干燥器中。

按照上述方法制備負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca普通納米粒，作為對(duì)照。

(2)粒徑和電位的測(cè)定及結(jié)果：按照實(shí)施例1的方法測(cè)定負(fù)載香豆素-6的peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒的粒徑和zeta電位，平均粒徑為146.2nm，pdi為0.119，zeta電位為-6.78mv。

(3)包封率及載藥量的測(cè)定及結(jié)果：按照實(shí)施例1的方法測(cè)定香豆素-6的包封率及載藥量，分別為96.9％和1.98％。

實(shí)施例15.負(fù)載香豆素-6的peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒體外釋放研究

(1)方法：取負(fù)載香豆素-6的peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒1ml，置于透析袋(mwco：20000，usa)內(nèi)，將透析袋放入200mlph7.4磷酸鹽緩沖液(pbs)中，37℃恒溫水浴中、避光、以100rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，24小時(shí)內(nèi)分別于不同時(shí)間點(diǎn)吸取200μl釋放液并補(bǔ)液。將取出的釋放介質(zhì)以空白pbs作為對(duì)照，測(cè)定香豆素-6的濃度，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6份樣品平行測(cè)量。以相同的方法對(duì)負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca納米粒進(jìn)行測(cè)定。

(2)結(jié)果：圖13為負(fù)載香豆素-6的peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒，以及負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca納米粒的體外釋放曲線。由圖中可以看出，peg20000-天冬氨酸雙重修飾納米粒的體外釋放行為與普通納米粒相比具有顯著差異(f2＝34.32，<50)。與未經(jīng)修飾的納米粒相比，peg20000-天冬氨酸雙重修飾納米粒具有更顯著的緩釋特性，說明其具有更好的穩(wěn)定性，有利于其在體內(nèi)有更好的bbb通透性。

實(shí)施例16.負(fù)載香豆素-6的peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒的制備及評(píng)價(jià)

(1)制備方法：將穩(wěn)定劑dex70(1％，w/v)與mpeg20000(1.5％，w/v)溶于ph1.0的鹽酸介質(zhì)中，然后在室溫、磁力攪拌下逐滴緩慢加入bca單體(1％，v/v)，以500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌4h后，加入香豆素-6(1％，w/v)，以750rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2.5h，之后用naoh中和體系ph至6-7，繼續(xù)攪拌lh使得bca單體充分聚合，即得peg-pbca納米粒。得到的納米粒通過0.45μm濾膜過濾后，冷凍干燥，之后復(fù)溶于pbs，混勻30min。加入卵磷脂(l％，w/v)，孵育0.5h，過濾后冷凍干燥，即得負(fù)載香豆素-6的peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒，將其保存在干燥器中。

按照上述方法制備負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca普通納米粒，作為對(duì)照。

(2)粒徑和電位的測(cè)定及結(jié)果：按照實(shí)施例1的方法測(cè)定負(fù)載香豆素-6的peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒的粒徑和zeta電位，其平均粒徑為344.2nm，pdi為0.252，zeta電位為-37.3mv。

(3)包封率及載藥量的測(cè)定及結(jié)果：按照實(shí)施例1的方法測(cè)定香豆素-6的包封率及載藥量，分別為97.4％和1.95％

實(shí)施例17.peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒的體外釋放研究

(1)方法：取負(fù)載香豆素-6的peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒1ml，置于透析袋(mwco：20000，usa)內(nèi)，將透析袋放入200mlph7.4磷酸鹽緩沖液(pbs)中，37℃恒溫水浴避光以100rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，24小時(shí)內(nèi)分別于不同時(shí)間點(diǎn)吸取200μl釋放液并補(bǔ)液。將取出的釋放介質(zhì)以空白pbs作為對(duì)照，測(cè)定香豆素-6的濃度，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6份樣品平行測(cè)量。

(2)結(jié)果：圖14為負(fù)載香豆素-6的peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒，以及負(fù)載香豆素-6的未經(jīng)修飾的pbca納米粒的體外釋放曲線。由圖中可以看出，peg20000-卵磷脂雙重修飾納米粒的體外釋放行為與普通納米粒相比具有顯著差異(f2＝30.98，<50)。與未經(jīng)修飾的納米粒相比，peg20000-卵磷脂雙重修飾納米粒具有更顯著的緩釋特性，說明其具有更好的穩(wěn)定性，有利于其在體內(nèi)有更好的bbb通透性。

實(shí)施例18.具有不同修飾物的雙重修飾pbca納米粒的腦組織分布研究

(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯烤哂胁煌揎椢锏碾p重修飾pbca納米粒在動(dòng)物體內(nèi)的腦靶向性。

(2)方法：取6-8周齡的雄性wistar大鼠，隨機(jī)分為5組，每組3只，分別尾靜脈注射給予等摩爾量的香豆素-6溶液(原藥)、負(fù)載香豆素-6的普通納米粒，負(fù)載香豆素-6的peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒、負(fù)載香豆素-6的peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒和負(fù)載香豆素-6的peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒。分別在給藥后30min處死大鼠，取腦組織，測(cè)定腦內(nèi)香豆素-6的含量。

(3)結(jié)果：圖15顯示了大鼠腦組織中的香豆素-6的含量，從左到右依次為注射原藥溶液、注射普通納米粒、注射peg20000-亮氨酸雙重修飾pbca納米粒、注射peg20000-天冬氨酸雙重修飾pbca納米粒和注射peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒的大鼠的腦組織中的香豆素-6的含量。

如圖所示，與原藥溶液及普通pbca納米粒相比，本發(fā)明的上述三種雙重修飾納米?？梢允鼓X組織中的香豆素-6的含量顯著增高(p<0.01)。結(jié)果表明，上述三種雙重修飾pbca納米粒均具有良好的bbb透過性，可以顯著促進(jìn)藥物通過血腦屏障。

實(shí)施例19.peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒的制備

將穩(wěn)定劑dex70(1％，w/v)與mpeg20000(1.5％，w/v)溶于ph1.0的鹽酸介質(zhì)中，然后在室溫、磁力攪拌下逐滴緩慢加入bca單體(1％，v/v)，以500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌4h后，用naoh中和體系ph至6-7，繼續(xù)攪拌lh使得bca單體充分聚合，即得peg-pbca納米粒。得到的納米粒通過0.45μm濾膜過濾后，冷凍干燥，之后復(fù)溶于pbs，混勻30min。加入卵磷脂(l％，w/v)，孵育0.5h，過濾后冷凍干燥，即得peg20000-卵磷脂雙重修飾pbca納米粒，將其保存在干燥器中。

從以上各實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明的雙重修飾pbca納米粒具有良好的bbb通透性。將不易透過bbb的藥物負(fù)載到本發(fā)明的雙重修飾pbca納米粒中，能夠使藥物在動(dòng)物腦組織中的含量顯著增高，并具有更好的緩釋行為，有利于提高藥物的安全性及藥效作用。包含上述載藥納米粒的載藥體系，可用于制備腦靶向制劑，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括但不限于腦腫瘤)的診斷、預(yù)防和/或治療中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解：根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和變動(dòng)，并且這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。