本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種陽離子納米顆粒及其制備方法以及在漱口水方向上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

口腔生態(tài)菌群失調(diào)成為近年來認(rèn)可的口腔常見疾病發(fā)生的主要病因之一，尤其是厭氧菌群的繁殖與破壞導(dǎo)致牙周炎等疾病的發(fā)生。對于口腔環(huán)境的健康維護(hù)，漱口水以其方便快捷，接受性強(qiáng)等特點成為許多人選擇的熱點。洗必泰及李施德林^?是目前認(rèn)可度和使用度最高的漱口水，其活性成分以抗菌作用為主要治療機(jī)制，并取得良好的效果，得到很好的關(guān)注和拓展研究，但在臨床使用中也不可避免地存在使牙齒變色等副作用及抗菌效力不足的情況，同時，在實際使用過程中，因其含有酒精成分，對口腔黏膜刺激性較強(qiáng)，易引起不適感。

陽離子納米顆粒是指粒度在1-100nm之間的帶有正電荷的粒子，其具有吸附蛋白質(zhì)的能力，可以產(chǎn)生一定的抗菌效果，同時具有良好的生物相容性，在抗菌方面的應(yīng)用有一定的研究潛力。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)由兩種單體即乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、良好的成囊和成膜的性能，無毒，因此，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在美國PLGA通過FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國藥典。

目前在使用納米粒治療疾病的研究中，常見的是將納米粒作為藥物載體，起到控制釋放等方面的應(yīng)用，而將納米顆粒直接作為殺菌抑菌的有效成分來使用的研究尚不多見。

經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前也未見有關(guān)通過制備陽離子納米顆粒來消滅和抑制口腔常見致齲菌的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種陽離子納米顆粒及其制備方法以及在漱口水方向上的應(yīng)用，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)中的漱口水抗菌效果差，含刺激性成分以及使牙齒變色的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種陽離子納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

（1）將十八胺溶于有機(jī)溶劑中，使其濃度為0.4-1mg/mL，有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、正己烷、無水乙醇和甲醇中至少一種；

（2）將PLGA溶于步驟（1）所得溶液中，使其PLGA濃度為10-40mg/mL；

（3）取濃度為0.1-1%的F68水溶液，將其與步驟（2）所得溶液混合，然后進(jìn)行超聲處理，得含有PLGA納米顆粒的乳化溶液；其中F68水溶液與步驟（1）中有機(jī)溶劑的體積比為10-40：1；

（4）使用真空泵和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置，在20-60℃條件下對步驟（3）所得乳化溶液進(jìn)行乳化蒸發(fā)處理，處理時間為10-120min，得陽離子納米顆粒。

進(jìn)一步地，步驟（1）中有機(jī)溶劑為氯仿。

進(jìn)一步地，步驟（1）中十八胺濃度為0.6mg/mL。

進(jìn)一步地，步驟（2）中PLGA濃度為20mg/mL。

進(jìn)一步地，步驟（3）中F68水溶液的濃度為0.5%。

進(jìn)一步地，步驟（3）中F68水溶液與步驟（1）中有機(jī)溶劑的體積比為20：1。

進(jìn)一步地，步驟（3）中超聲處理溫度為20-25℃，每次處理時間為5s，處理次數(shù)為6次，時間間隔為9s。

本發(fā)明提供的一種陽離子納米顆粒及其制備方法以及在漱口水方向上的應(yīng)用，具有以下有益效果：制備方法簡單易操作，制備出的產(chǎn)品不含藥物，僅運用納米粒本身特性實現(xiàn)殺菌抑菌效果，抗菌作用強(qiáng)，刺激性小，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的空白納米粒本身不能直接作為殺菌抑菌的有效成分來使用的問題。

因該產(chǎn)品本身具有很強(qiáng)的抑菌作用，因此，在抑菌方面具有廣泛的應(yīng)用價值，例如可將其制成漱口水，該漱口水與牙齒生物相容性好，不易出現(xiàn)色素沉著進(jìn)而使牙齒變色的現(xiàn)象。

附圖說明

圖1為陽離子納米顆粒形態(tài)圖。

圖2為陽離子納米顆粒粒徑圖。

圖3為陽離子納米顆粒電位圖。

圖4為陽離子納米顆粒熱力學(xué)穩(wěn)定性實驗結(jié)果圖。

圖5為陽離子納米顆粒動力學(xué)穩(wěn)定性實驗結(jié)果圖。

圖6為陽離子納米顆粒對游離菌抑制作用實驗結(jié)果圖；其中，每個對比結(jié)果中，從左至右，每根柱子分別代表對照組、濃度為200μg/mL的實驗組、濃度為100μg/mL的實驗組、濃度為50μg/mL的實驗組、濃度為250μg/mL的實驗組、濃度為12.5μg/mL的實驗組、含0.5%F68水溶液的陰性對照組和不含0.5%F68水溶液的對照組（與陰性對照組不同之處僅為不添加0.5%F68水溶液）。

圖7為陽離子納米顆粒對菌膜形成抑制作用實驗結(jié)果圖。

圖8為陽離子納米顆粒對成熟菌膜抑制作用實驗結(jié)果圖。

圖9為陽離子納米顆粒與細(xì)菌作用力實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1

一種陽離子納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

（1）將十八胺溶于氯仿中，使十八胺濃度為0.6mg/mL；

（2）取步驟（1）所得溶液0.5mL，將20mg PLGA溶于該溶液中，攪拌混勻；

（3）取濃度為0.5%的F68水溶液10mL，將其與步驟（2）所得溶液混合，然后進(jìn)行超聲處理，處理溫度為25℃，處理6次，時間間隔為9s，每次處理時間為5s，得含有PLGA納米顆粒的乳化溶液；

（4）將步驟（3）所得乳化溶液置于40℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min去除氯仿

，得陽離子納米顆粒溶液。

取上述陽離子納米顆粒溶液0.1mL，用蒸餾水稀釋10倍，通過Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)納米測量儀測定平均粒徑，平均粒徑為217.7 nm，PDI為0.118。陽離子納米顆粒形態(tài)圖和粒徑圖分別見圖1和圖2。

取陽離子納米顆粒溶液1mL，通過納米測量儀測其平均電位，平均電位為14.7 mv。陽離子納米顆粒電位圖見圖3。

實施例2

一種陽離子納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

（1）將十八胺溶于二氯甲烷中，使十八胺濃度為0.8mg/mL；

（2）取步驟（1）所得溶液0.5mL，將20mg PLGA溶于該溶液中，攪拌混勻；

（3）取濃度為0.6%的F68水溶液10mL，將其與步驟（2）所得溶液混合，然后進(jìn)行超聲處理，處理溫度為25℃，處理6次，時間間隔為9s，每次處理時間為5s，得含有PLGA納米顆粒的乳化溶液；

（4）將步驟（3）所得乳化溶液置于25℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40min去除氯仿

，得陽離子納米顆粒溶液。

取上述陽離子納米顆粒溶液2mL，置于37℃條件下分別培養(yǎng)4h，8h，24h，48h和72h，然后測量各時間點時的粒徑大小，進(jìn)而分析其熱力學(xué)穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4；并于相同時間點，取0.1mL上清液，測其在550nm處的透射率，進(jìn)而分析動力學(xué)穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5。

熱力學(xué)穩(wěn)定性可通過粒徑的變化來進(jìn)行分析，從結(jié)果中可以看出，以最初（0h）粒徑為1，72h的變化在98.42-104.08%范圍內(nèi)，說明陽離子納米粒的粒徑可在37℃條件下保持至少72h，對于變異鏈球菌有穩(wěn)定的抑制作用。

動力學(xué)穩(wěn)定性可通過沉降率來分析，由結(jié)果可知，8h內(nèi)，納米粒基本保持穩(wěn)定，以0h的透光率為1，24h、48h和72h的透光率分別為128.87%、138.03%和149.22%，表明陽離子納米粒有著輕微的聚合傾向。

實施例3

一種陽離子納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

（1）將十八胺溶于無水乙醇中，使十八胺濃度為1mg/mL；

（2）取步驟（1）所得溶液0.5mL，將15mg PLGA溶于該溶液中，攪拌混勻；

（3）取濃度為0.2%的F68水溶液15mL，將其與步驟（2）所得溶液混合，然后進(jìn)行超聲處理，處理溫度為25℃，處理6次，時間間隔為9s，每次處理時間為5s，得含有PLGA納米顆粒的乳化溶液；

（4）將步驟（3）所得乳化溶液置于37℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)35min去除氯仿，得陽離子納米顆粒溶液。

將變異鏈球菌（UA159）接入BHI液體培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待菌株濃度適中，活力較強(qiáng)時，將其加入96孔板（Costar 3599; Corning Inc., NY），再分別加入濃度為200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL的陽離子納米顆粒溶液，于37℃條件下培養(yǎng)2h、4h、6h、8h、10h和24h，然后使用酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)測量595nm處陽離子納米顆粒對游離菌的抑制作用。

對照組為菌液中加入250μg/mL氨芐青霉素，陰性對照組為菌液中加入表面活性劑0.5%F68水溶液，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，陰性對照組中，細(xì)菌的生長幾乎沒有受到影響，實驗組中，陽離子納米顆粒對細(xì)菌的影響呈現(xiàn)濃度相關(guān)趨勢，當(dāng)陽離子納米顆粒濃度為25、50、100和200μg/mL時，對細(xì)菌的生長有明顯的抑制作用，當(dāng)濃度為12.5μg/mL時，對細(xì)菌的生長沒有抑制作用。

實施例4

一種陽離子納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

（1）將十八胺溶于氯仿中，使十八胺濃度為0.4mg/mL；

（2）取步驟（1）所得溶液0.5mL，將25mg PLGA溶于該溶液中，攪拌混勻；

（3）取濃度為0.5%的F68水溶液5mL，將其與步驟（2）所得溶液混合，然后進(jìn)行超聲處理，處理溫度為25℃，處理6次，時間間隔為9s，每次處理時間為5s，得含有PLGA納米顆粒的乳化溶液；

（4）將步驟（3）所得乳化溶液置于30℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40min去除氯仿，得陽離子納米顆粒溶液。

將變異鏈球菌（UA159）接入BHI液體培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待菌株濃度適中，活力較強(qiáng)時，將其加入48孔板（Costar 3599; Corning Inc., NY），再分別加入濃度為200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL的陽離子納米顆粒溶液，于37℃條件下培養(yǎng)24h，將形成的菌膜轉(zhuǎn)移到離心管中，48孔板使用500μL PBS沖洗兩次，保證粘壁細(xì)胞全部被轉(zhuǎn)移，菌膜經(jīng)過渦旋震動后，將其稀釋至10^-7，然后均勻涂布在BHI瓊脂固體培養(yǎng)基平板上，于37℃條件下培養(yǎng)48h，然后計數(shù)平板上的菌落形成數(shù)量來觀測細(xì)菌濃度，進(jìn)而分析陽離子納米顆粒對菌膜形成的抑制效果。

陰性對照組為菌液中加入表面活性劑0.5%F68水溶液，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，陰性對照組中，細(xì)菌的生長幾乎沒有受到影響，實驗組中，陽離子納米顆粒對細(xì)菌的影響呈現(xiàn)濃度相關(guān)趨勢，當(dāng)陽離子納米顆粒濃度為50μg/mL時，菌落數(shù)量減少33.92%，濃度為100μg/mL時，菌落數(shù)量減少94.79%，濃度為200μg/mL時，菌落數(shù)量減少99.98%。

實施例5

一種陽離子納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

（1）將十八胺溶于乙酸乙酯中，使十八胺濃度為0.6mg/mL；

（2）取步驟（1）所得溶液0.5mL，將20mg PLGA溶于該溶液中，攪拌混勻；

（3）取濃度為1%的F68水溶液10mL，將其與步驟（2）所得溶液混合，然后進(jìn)行超聲處理，處理溫度為20℃，處理6次，時間間隔為9s，每次處理時間為5s，得含有PLGA納米顆粒的乳化溶液；

（4）將步驟（3）所得乳化溶液置于20℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40min去除氯仿，得陽離子納米顆粒溶液。

將BHI液體培養(yǎng)基加入48孔板（Costar 3599; Corning Inc., NY）中，再加入傳代培養(yǎng)后的變異鏈球菌（UA159），于37℃條件下培養(yǎng)24h形成菌膜，然后分別加入濃度為濃度為200μg/mL和100μg/mL的陽離子納米顆粒溶液，于37℃條件下分別培養(yǎng)24h，48h和72h后將菌膜轉(zhuǎn)移到離心管中，48孔板使用500μL PBS沖洗兩次，保證粘壁細(xì)胞全部被轉(zhuǎn)移，菌膜經(jīng)過渦旋震動后，將其稀釋至10^-6，然后均勻涂布在BHI瓊脂固體培養(yǎng)基平板上，于37℃條件下培養(yǎng)48h，然后計數(shù)平板上的菌落形成數(shù)量來觀測細(xì)菌濃度，進(jìn)而分析陽離子納米顆粒對菌膜形成的抑制效果。

陰性對照組為菌液中加入表面活性劑0.5%F68水溶液，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，陰性對照組中，細(xì)菌的生長幾乎沒有受到影響，實驗組中，陽離子納米顆粒對細(xì)菌的影響呈現(xiàn)濃度相關(guān)趨勢，當(dāng)陽離子納米顆粒濃度為100μg/mL時，菌落數(shù)量減少33.3%，濃度為200μg/mL時，菌落數(shù)量減少71.4%。

實施例6

一種陽離子納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

（1）將十八胺溶于丙酮中，使十八胺濃度為1mg/mL；

（2）取步驟（1）所得溶液0.5mL，將30mg PLGA溶于該溶液中，攪拌混勻；

（3）取濃度為0.8%的F68水溶液20mL，將其與步驟（2）所得溶液混合，然后進(jìn)行超聲處理，處理溫度為25℃，處理6次，時間間隔為9s，每次處理時間為5s，得含有PLGA納米顆粒的乳化溶液；

（4）將步驟（3）所得乳化溶液置于38℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40min去除氯仿，得陽離子納米顆粒溶液。

將傳代后的變異鏈球菌（UA159），于37℃條件下培養(yǎng)24h，然后在1500r/min下離心15min，再用PBS溶液沖洗兩次，接著采用AFM探針懸臂(Ultrasharp, μ-Masch, Tallinn, Estonia)于紫外光下消毒5min，之后在顯微操作下，懸臂一半長度于0.01%左旋多聚賴氨酸液滴中浸泡1min，然后在空氣中干燥2min，最后再在菌液中浸泡1min，以在懸臂表面形成細(xì)菌層。將一滴納米顆粒滴在蓋玻片上，于空氣中干燥。通過原子力顯微鏡(AFM,?SPM9600; Shimadzu, Kyoto, Japan)測量細(xì)菌和納米顆粒之間的作用力，共測量納米顆粒液滴的5個位置，每個位置重復(fù)至少10次，結(jié)果見圖9。

圖9中橫坐標(biāo)表示探針與托盤的相對位置，縱坐標(biāo)表示作用力的大小。當(dāng)探針上的細(xì)菌和托盤上的納米粒接近時，會產(chǎn)生相互作用力。A線為0作用力的基準(zhǔn)線，R線為探針在各個位置上測到的作用力的大小。從圖9中得出，在距零點1400nm處，產(chǎn)生最大作用力184nN。

實驗例 陽離子納米顆粒的抑菌實驗

通過實驗來檢測陽離子納米顆粒對口腔主要致齲菌即變異鏈球菌的影響：

實驗共分三組，分別觀測本發(fā)明所述陽離子納米顆粒對游離菌的影響，對成熟菌膜的影響和對菌膜形成的影響。

在第一組實驗中，將游離細(xì)菌培養(yǎng)液與陽離子納米顆粒共同培養(yǎng)一定時間，然后使用酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)觀測?？傻玫郊{米顆粒濃度為50μg/mL的溶液與細(xì)菌作用時，前8小時有明顯的殺菌抑菌效果。當(dāng)濃度增加的200μg/mL時，可基本殺滅所有細(xì)菌，可得最小滅菌濃度（MBC）為200μg/mL（實施例3）。

在第二組實驗中，將尚未形成菌膜的細(xì)菌培養(yǎng)液與陽離子納米顆粒共同培養(yǎng)一定時間，然后將菌液稀釋，在BHI瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，觀測細(xì)菌形成菌落數(shù)來判斷抑菌效果?？傻眉{米顆粒濃度為50μg/mL的溶液與細(xì)菌作用時，與對照組相比較，菌落數(shù)降低33.92%，濃度為100μg/mL和200μg/mL時，菌落數(shù)分別降低94.79%和99.98%（實施例4）。

在第三組實驗中，將已經(jīng)形成菌膜的細(xì)菌培養(yǎng)液與陽離子納米顆粒共同培養(yǎng)一定時間，然后將菌液稀釋，在BHI瓊脂固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，觀測細(xì)菌形成菌落數(shù)來判斷抑菌效果?？傻眉{米顆粒濃度為100μg/mL和200μg/mL時，菌落數(shù)分別降低39.3%和71.4%（實施例5）。

通過上述實驗，可證明本發(fā)明有良好的殺菌和抑菌效果。

本發(fā)明制備的陽離子納米顆?？芍瞥善瑒?、膠囊、混懸劑、粉針劑等。

該產(chǎn)品還可以用于制備漱口水，其與牙齒生物相容性好，不易出現(xiàn)色素沉著進(jìn)而使牙齒變色的現(xiàn)象。