本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，進一步涉及營養(yǎng)物在分子水平上的結(jié)構(gòu)改進，具體涉及一種蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鐵是人和動物體內(nèi)不可或缺的微量元素之一，在維持機體正常代謝中發(fā)揮重要作用。機體缺鐵或鐵的利用障礙，將導(dǎo)致體內(nèi)有關(guān)氧的運輸、氧的利用等多項代謝過程紊亂，對生長發(fā)育造成不利影響，甚至導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)異常。由于鐵缺乏使血紅蛋白合成障礙所引起的缺鐵性貧血仍是世界范圍內(nèi)患病率較高的營養(yǎng)性疾病之一。鐵缺乏造成的貧血在任何年齡段的人群中均有發(fā)生，在育齡期婦女、嬰幼兒及貧窮人群中更為常見，因此，補鐵顯得尤為必要。

目前，應(yīng)用于補鐵的制劑很多，而越來越多的學(xué)者已把注意力從傳統(tǒng)的無機鐵、有機酸鐵的研究轉(zhuǎn)移到氨基酸螯合鐵這一迅速發(fā)展起來的新型鐵制劑上來。蘇氨酸螯合鐵作為新型鐵營養(yǎng)強化劑有諸多優(yōu)點。在動物體內(nèi)，蘇氨酸螯合鐵可通過肽吸收通道在小腸內(nèi)被吸收，避免了通過離子吸收通道運轉(zhuǎn)時與其他礦物元素產(chǎn)生的拮抗作用；蘇氨酸螯合鐵能減輕鐵離子參與的氧化還原反應(yīng)，降低對食品、飼料中脂質(zhì)、維生素等敏感成分的破壞，進而減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損失；它還能在體內(nèi)形成緩沖體系，以減少無機鹽對胃腸道內(nèi)酸堿平衡的不良影響。由于蘇氨酸螯合鐵只有在絡(luò)合形態(tài)下才具有較高的生物學(xué)效價，而胃液的強酸環(huán)境會使部分蘇氨酸螯合鐵嚴重解離。因此，為了充分發(fā)揮蘇氨酸螯合鐵的補鐵效果，有必要采取措施提高其在胃部的強酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性和較高的生物利用率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中鐵元素營養(yǎng)物的補鐵效果不佳的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中蘇氨酸螯合鐵在強酸性環(huán)境下穩(wěn)定性較低。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體，該蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體是通過以下方法制備的：

1)取蛋黃卵磷脂和膽固醇溶解于無水乙醚中，得到有機相，所述有機相中蛋黃卵磷脂和膽固醇的摩爾比為5:1～2:1，所述有機相中蛋黃卵磷脂濃度為5～20mg/ml；

2)配置ph為6.7～6.9的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，而后加入蘇氨酸螯合鐵溶解，得到水相，所述水相中蘇氨酸螯合鐵的濃度為5～10mg/ml；

3)取所述有機相和水相，以二者體積比為3:0.8～3:1.2的比例混合，而后在冰浴狀態(tài)下超聲震蕩5～10min，得到油包水型乳狀液，將其在35～45℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成凝膠狀物后繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20～30min至凝膠塌陷，而后將含有吐溫80的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入其中繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20-30min，得到脂質(zhì)體混懸液；

4)將步驟3)所得的脂質(zhì)體混懸液超聲震蕩10～15min，即得到所述蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體。

作為優(yōu)選，步驟3)所述超聲震蕩的強度為50～90％，每工作2秒間歇1秒。

作為優(yōu)選，步驟3)所述含有吐溫80的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，吐溫80與檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的體積比為1:50～1:200。

作為優(yōu)選，步驟3)所述含有吐溫80的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的加入量，滿足以下條件：體系中蛋黃卵磷脂的含量與所述含有吐溫80的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的加入量之比為1:50～1:150(g:ml)。

作為優(yōu)選，步驟4)所述的超聲震蕩是利用探頭式超聲震蕩器實現(xiàn)的，其超聲震蕩強度為60～100％，每工作2秒間歇1秒。

作為優(yōu)選，所述蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的包封率為60～70％，其平均粒徑小于100nm。

同時，本發(fā)明還提供了上述蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體用于制備動物鐵元素補充強化劑的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述鐵元素補充強化劑是口服制劑。

作為優(yōu)選，所述鐵元素補充強化劑是缺鐵性貧血治療藥物。

作為優(yōu)選，所述鐵元素補充強化劑是保健食品和普通食品、食品添加劑。

作為優(yōu)選，所述鐵元素補充強化劑是飼料添加劑。

在以上技術(shù)方案中，所述探頭式超聲震蕩器是指自身具有超聲波發(fā)生功能、通過插入的方式對所處環(huán)境執(zhí)行超聲震蕩的儀器；因此，凡具有以上功能特征的裝置均屬于本發(fā)明所述探頭式超聲震蕩器所限定的特征范圍。在以上技術(shù)方案中，蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的包封率可采用透析法測定；納米脂質(zhì)體的粒徑分布可采用nano-zs型納米粒度及zeta電位分析儀測定；納米脂質(zhì)體的表征圖像可采用掃描電子顯微鏡(sem)分析。

本發(fā)明提供了一種蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體及其應(yīng)用，該技術(shù)方案以蛋黃卵磷脂和膽固醇為外包膜材，將蘇氨酸螯合鐵作為芯材包埋于其中。由于脂質(zhì)體屬于仿生物膜結(jié)構(gòu)，以蛋黃卵磷脂等兩性物質(zhì)為基礎(chǔ)制劑，具有制備簡單、無免疫原性、對機體無毒性以及良好的生物相容性等優(yōu)點。利用具有納米粒徑的納米脂質(zhì)體作為運載系統(tǒng)，顯著改善了蘇氨酸螯合鐵在胃酸環(huán)境下穩(wěn)定性較低的問題，本發(fā)明所制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體包封率可達60～70％，平均粒徑小于100nm，有效提升了蘇氨酸螯合鐵生物利用率穩(wěn)定性。

動物實驗表明，蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體對ida大鼠的生長性能有明顯的改善作用，能夠顯著提高ida大鼠的體重、血液hb含量，并有利于肝臟、腎臟和脾臟的生長和更新，其作用效果優(yōu)于蘇氨酸螯合鐵，極其優(yōu)于硫酸亞鐵?？梢哉J為作為鐵營養(yǎng)強化添加到食物或制備藥劑時，蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體具有更好的應(yīng)用性能，能保證蘇氨酸螯合鐵生物利用率的最大化發(fā)揮。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1所制備蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的sem電鏡圖；

圖2是本發(fā)明實施例1所制備蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的粒徑分布圖。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。

以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準確數(shù)值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。

除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

以下實施例中所使用的蘇氨酸螯合鐵，可以是通過復(fù)分解合成法制備，具體步驟如下：在裝有磁力攪拌的反應(yīng)瓶中，加入水和適量氫氧化鈣，攪拌加熱后呈白色懸浮液，加入適量蘇氨酸后，體系呈半透明液，在一定溫度下反應(yīng)，加入適量檸檬酸。然后，加入七水合硫酸亞鐵的水溶液，排除反應(yīng)體系中的氧氣并充入高純氮，并調(diào)節(jié)體系ph值，于一定溫度下攪拌反應(yīng)，降至室溫，過濾，用少量水洗滌硫酸鈣濾餅，濾液加入有機試劑萃取，再次過濾，將所得沉淀真空干燥，得墨綠色蘇氨酸螯合鐵產(chǎn)品。

實施例1

稱取蛋黃卵磷脂3g和膽固醇0.5g完全溶解于180ml無水乙醚中得有機相。再將0.5g蘇氨酸螯合鐵溶解于60mlph＝6.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中得水相。將有機相和水相按3:1的體積比均勻混合后于冰浴中超聲10min，超聲強度70％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(w/o)型乳狀液。將形成的乳狀液移入250ml圓底燒瓶中，于45℃水浴中進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去有機溶劑，10min后形成凝膠狀物，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min至凝膠塌陷。再將含有3gtween80的200ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入體系中于45℃繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min，以充分水合并除去殘留的有機溶劑，得到脂質(zhì)體混懸液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲10min，超聲強度80％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。

對所制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體，先后利用透析法測定其包封率；利用nano-zs型納米粒度及zeta電位分析儀測定其粒徑分布情況；掃描電子顯微鏡(sem)觀察其微觀圖像。結(jié)果顯示，以上所制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體，其包封率為64.5％；平均粒徑在100nm以下，粒徑分布情況如圖2所示；其微觀形態(tài)如圖1所示。

實施例2

稱取蛋黃卵磷脂500mg和膽固醇50mg完全溶解于24ml無水乙醚中得有機相。再將80mg蘇氨酸螯合鐵溶解于8mlph＝6.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中得水相。將有機相和水相按3:1的體積比均勻混合后于冰浴中超聲5min，超聲強度60％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(w/o)型乳狀液。將形成的乳狀液移入250ml圓底燒瓶中，于45℃水浴中進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去有機溶劑，8min后形成凝膠狀物，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min至凝膠塌陷。再將含有300mgtween80的30ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入體系中于40℃繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min，以充分水合并除去殘留的有機溶劑，得到脂質(zhì)體混懸液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲10min，超聲強度70％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。經(jīng)測包封率為62.4％，平均粒徑在100nm以下。

實施例3

稱取蛋黃卵磷脂1g和膽固醇200mg完全溶解于60ml無水乙醚中得有機相。再將150mg蘇氨酸螯合鐵溶解于20mlph＝6.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中得水相。將有機相和水相按3:1的體積比均勻混合后于冰浴中超聲10min，超聲強度80％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(w/o)型乳狀液。將形成的乳狀液移入250ml圓底燒瓶中，于45℃水浴中進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去有機溶劑，10min后形成凝膠狀物，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)25min至凝膠塌陷。再將含有500mgtween80的100ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入體系中于35℃繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min，以充分水合并除去殘留的有機溶劑，得到脂質(zhì)體混懸液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲15min，超聲強度90％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。經(jīng)測包封率為66.2％，平均粒徑在100nm以下。

實施例4

稱取蛋黃卵磷脂3g和膽固醇1.2g完全溶解于180ml無水乙醚中得有機相。再將0.5g蘇氨酸螯合鐵溶解于60mlph＝6.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中得水相。將有機相和水相按3:1的體積比均勻混合后于冰浴中短時超聲10min，超聲強度80％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(w/o)型乳狀液。將形成的乳狀液移入250ml圓底燒瓶中，于40℃水浴中進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去有機溶劑，10min后形成凝膠態(tài)物質(zhì)，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min至凝膠塌陷成膜。再將含有3gtween80的200ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入體系中于45℃繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min，以充分水合并除去殘留的有機溶劑，得到脂質(zhì)體混懸液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲10min，超聲強度100％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。經(jīng)測包封率為41.5％，平均粒徑在100nm以下。

實施例5

本實施例以實施例1所得蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體為對象，利用實驗方法評價其對動物缺鐵性貧血的改善作用。

1、試驗方法

1.1缺鐵性貧血(ida)大鼠模型的建立

選用健康初斷乳sd大鼠，在實驗條件下飼予低鐵飼料(鐵含量<10mg/kg，以fe計)。第5周時，發(fā)現(xiàn)多數(shù)大鼠均達到恢復(fù)試驗要求(即hb<100mg/ml)，認為建模成功，此時測定全部大鼠hb并稱重。

1.2實驗動物分組及給藥方法

選取hb<100g/l的大鼠30只作為實驗動物，并將當(dāng)天記為恢復(fù)試驗第1d。根據(jù)貧血大鼠hb水平及體重將其隨機分為蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體組、蘇氨酸螯合鐵組、陽性對照組和低鐵對照組，每組6只，各組均繼續(xù)給予低鐵飼料；空白對照組6只，一直給予普通飼料。(鐵含量為260mg/kg，以fe計)。試驗期間各組實驗動物連續(xù)灌胃，兩個實驗組和陽性對照組分別給32mg/kg·bwfe的相應(yīng)鐵補充劑，低鐵對照組和空白對照組給予相應(yīng)溶劑，每天灌胃一次，容積為1.0ml/100g·bw，受試樣品給予時間為21d，每周測定兩次體重及hb等指標(biāo)。根據(jù)體重重新調(diào)整灌胃的容積。

1.3測定指標(biāo)

采用雙抗體夾心法測定ida大鼠血液的hb水平。恢復(fù)試驗結(jié)束后，在血液樣品采集后斷頸處死各組大鼠，取出各只動物肝臟、腎臟、脾臟并稱重。按照下列公式計算各只動物的各個臟器指數(shù)：

肝臟指數(shù)(％)＝(肝臟重量/動物體重)×100

腎臟指數(shù)(％)＝(腎臟重量/動物體重)×100

脾臟指數(shù)(％)＝(脾臟重量/動物體重)×100

2、實驗結(jié)果

2.1蘇氨酸鐵納米脂質(zhì)體對實驗動物一般狀況及體重的影響

在sd大鼠ida模型建立期間，ida模型組與空白對照組大鼠相比采食量下降，體重增加緩慢，活動能力降低，ida模型組部分大鼠出現(xiàn)毛發(fā)成片脫落的現(xiàn)象，但精神狀態(tài)良好。

由實驗結(jié)果可知，ida模型建立之前(第0d)，蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體組、蘇氨酸螯合鐵組、陽性對照組、低鐵對照組和空白對照組的大鼠的體重比較，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。ida恢復(fù)試驗之初(第1d)，各ida模型組與空白對照組實驗大鼠的體重差異極顯著(p＜0.01)，而ida模型組之間大鼠的體重?zé)o差異(p＞0.05)。ida恢復(fù)試驗過程中，各ida模型組間實驗大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，與空白對照組相比，差異極顯著(p＜0.01)。恢復(fù)試驗結(jié)束時(第21d)，蘇氨酸螯合鐵(thr-fe)納米脂質(zhì)體組和thr-fe劑量組大鼠體重與低鐵對照組相比，差異顯著(p＜0.05)。

計算各組試驗大鼠在恢復(fù)試驗期間的體重增量發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠體重增量最高；ida模型組中thr-fe納米脂質(zhì)體組增量略高于thr-fe組，且與陽性對照組和低鐵對照組相比，體重增量的差異極顯著(p＜0.01)，與空白對照組相比差異不顯著(p＞0.05)。

表1不同實驗組ida大鼠體重情況表(n＝5,g)

注：同列肩標(biāo)中，@表示與陽性對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)，@@表示與陽性對照組相比有極顯著性差異(p＜0.01)；#表示與低鐵對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)，##表示與低鐵對照組相比有極顯著性差異(p＜0.01)；*表示與空白對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)，**表示與空白對照組相比有極顯著性差異(p＜0.01)，下表同。

4.2蘇氨酸鐵納米脂質(zhì)體對實驗動物血紅蛋白含量的影響

實驗動物在恢復(fù)試驗期間血紅蛋白含量變化見表2。

表2不同實驗組ida大鼠血紅蛋白含量表(n＝5,mg/ml)

ida模型建立之后(第1d)，各ida模型組大鼠的hb水平和空白對照組相比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且差異極顯著(p＜0.01)；而各ida模型組大鼠之間相比，hb含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，說明ida模型建立成功。由實驗結(jié)果可知，thr-fe納米脂質(zhì)體組、thr-fe組和陽性對照組大鼠的hb含量隨著恢復(fù)試驗的進行均呈上升趨勢，第21d時，這三個模型恢復(fù)組大鼠hb水平與低鐵對照組相比分別增高了83.16％、56.88％和39.79％(p＜0.01)。thr-fe納米脂質(zhì)體組和thr-fe組大鼠的hb含量于恢復(fù)試驗第21d與空白對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，且前者的hb恢復(fù)含量高于后者。說明thr-fe納米脂質(zhì)體和thr-fe均具有提高ida大鼠血紅蛋白含量的能力，且thr-fe納米脂質(zhì)體的效果強于thr-fe。

4.3蘇氨酸鐵納米脂質(zhì)體對實驗動物臟器指數(shù)的影響

各組實驗動物的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)見表3。

表3不同實驗組ida大鼠各臟器指數(shù)表(n＝5,g)

由表3可見，與陽性對照組和空白對照組相比，thr-fe納米脂質(zhì)體組、thr-fe組的各臟器指數(shù)均無明顯差異(p＞0.05)。而與低鐵對照組相比，thr-fe納米脂質(zhì)體組、thr-fe組的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)顯著增高(p<0.05)，thr-fe納米脂質(zhì)體組的脾臟指數(shù)也顯著增高(p<0.05)。從各個臟器指數(shù)的均值來看，臟器指數(shù)均為：thr-fe納米脂質(zhì)體組＞thr-fe組＞陽性對照組，說明相比硫酸亞鐵和蘇氨酸螯合鐵，蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體具有更好的改善ida大鼠肝臟、腎臟和脾臟的能力。

綜上所述，蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體對ida大鼠的生長性能有明顯的改善作用，能夠顯著提高ida大鼠的體重、血液hb含量，并有利于肝臟、腎臟和脾臟的生長和更新，其作用效果優(yōu)于蘇氨酸螯合鐵，極其優(yōu)于硫酸亞鐵?？梢哉J為作為鐵營養(yǎng)強化添加到食物或制備藥劑時，蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體具有更好的應(yīng)用性能，能保證蘇氨酸螯合鐵生物利用率的最大化發(fā)揮。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。