本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地，涉及一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法。

背景技術(shù)：

為了應(yīng)對(duì)生物醫(yī)藥領(lǐng)域中活性物質(zhì)可控釋放和靶向傳遞的挑戰(zhàn)，需要提供高效能、耐久性的藥物裝載方法。傳統(tǒng)的藥物裝載方法因低溶解性、高毒性、與其他物質(zhì)易發(fā)生相互作用越來越不適應(yīng)于現(xiàn)有臨床藥物的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)膠囊是一種外部為微米或納米大小的聚合物殼，內(nèi)部包裹著活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其使用蛋白質(zhì)作為前體物質(zhì)可以得到具有低免疫原性的傳遞材料，并且可以特異性的傳遞藥物至疾病組織而不影響健康組織，是目前最具前景的可控釋放的載體工具之一。

微乳液制備方法是蛋白質(zhì)膠囊應(yīng)用最廣泛的制備方法。這種方法使用兩種不混溶的液體，一般來說是一種油相和一種水相?；钚晕镔|(zhì)通常溶于油相之中作為被包裹相，水相通常包含蛋白質(zhì)前體分子用于形成殼體。兩種不混溶相形成的微乳液作為模板用于在相界面處合成膠囊。

煙草花葉病毒是一種棒狀植物病毒，作為最早被發(fā)現(xiàn)及研究的一種植物病毒，其各方面的特性都已經(jīng)被非常深入的研究。然而，目前為止并沒有煙草花葉病毒衣殼蛋白在乳液界面組裝制備蛋白膠囊方面的研究報(bào)道。因此，提供一種制備煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種以煙草花葉病毒衣殼蛋白作為材料制備蛋白膠囊的方法。該制備方法步驟簡單、制備周期短，控制煙草花葉病毒衣殼蛋白組裝為棒狀結(jié)構(gòu)作為蛋白膠囊的組成基元，以獲得較為堅(jiān)固的蛋白膠囊結(jié)構(gòu)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法，包括以下步驟：

1)煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液的制備

在煙草花葉病毒溶液中加入乙酸，混勻后靜置，離心去除RNA沉淀；將上清液過脫鹽柱分離，去除乙酸，將所得到的溶液在去離子水中透析12-24h，離心，將所得的沉淀用磷酸緩沖溶液復(fù)溶，得到煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液；

2)煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液的制備

在煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液中，加入油相，充分混合，得到煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液；

3)煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備

在煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液中滴加稀鹽酸調(diào)節(jié)酸堿度，之后在體系中加入交聯(lián)劑，在4℃的條件下反應(yīng)6h使煙草花葉病毒衣殼蛋白在油水界面處交聯(lián)得到煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊。

優(yōu)選地，步驟1)中，所述煙草花葉病毒溶液的濃度為5-20mg/ml，與乙酸的體積比為1:2，混勻后靜置30-40min；在該條件下煙草花葉病毒衣殼蛋白能夠充分的被解離出來而又保持其生理活性；

優(yōu)選地，步驟1)中，所述磷酸緩沖溶液為20-200mM的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液；更優(yōu)選的，為100mM的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液，在該條件下煙草花葉病毒衣殼蛋白能夠最好的保持其生理活性；

優(yōu)選地，步驟1)中，所述離心為在4℃條件下以8000-10000rpm離心8-12min；

優(yōu)選地，步驟2)中，所述煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液為含有20mM pH＝8.0的磷酸緩沖溶液的濃度為0.1-1mg/ml的煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液的；更優(yōu)選地，濃度為0.5mg/ml，在此濃度下煙草花葉病毒衣殼蛋白在油水界面的組裝密度較為合適，便于之后的交聯(lián)制備蛋白膠囊結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，步驟2)中，所述油相為全氟萘烷，油水相的比例控制在1:8-1:12，以保證所制備的乳液的穩(wěn)定性。

優(yōu)選地，步驟3)中，所述酸堿度被調(diào)節(jié)至5.3-5.7；此酸堿度條件下煙草花葉病毒衣殼蛋白能夠組裝成棒狀結(jié)構(gòu)，以獲得較為堅(jiān)固的蛋白膠囊結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，步驟3)中，所述交聯(lián)劑為戊二醛，體系中戊二醛的終濃度為2-3％；更優(yōu)選的，終濃度為2.5％，此濃度下交聯(lián)效果較好且不影響衣殼蛋白的生理活性。

本發(fā)明中在煙草花葉病毒衣殼蛋白在界面組裝的過程中，通過調(diào)節(jié)體系的酸堿度，使其能夠以棒狀組裝形態(tài)高效地在油水界面進(jìn)行組裝；使用戊二醛作為交聯(lián)劑在油水界面進(jìn)行交聯(lián)，以獲得以棒狀蛋白為基本組裝單元的較為堅(jiān)固的煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊結(jié)構(gòu)，克服了煙草花葉病毒衣殼蛋白制備蛋白膠囊存在膠囊表面包覆率低，膠囊堅(jiān)硬性差的缺點(diǎn)和不足。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明首次將煙草花葉病毒衣殼蛋白作為制備蛋白膠囊的材料，制備方法簡單、周期短，制備得到的蛋白膠囊表面的衣殼蛋白包覆率高，膠囊結(jié)構(gòu)堅(jiān)固且均一，與其他結(jié)構(gòu)相比，在生物催化、識(shí)別與傳遞等領(lǐng)域有著更廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出本發(fā)明制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法的流程示意圖。

圖2示出本發(fā)明實(shí)施例1-3所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液在顯微鏡下觀察的圖片。

圖3示出本發(fā)明實(shí)施例1-3所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液在調(diào)節(jié)酸堿度后所得到的乳液液滴的透射電鏡圖。

圖4示出本發(fā)明實(shí)施例1-3所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的掃描電鏡圖。

圖5示出本發(fā)明對(duì)比例1所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液在調(diào)節(jié)酸堿度后所得到的乳液液滴的透射電鏡圖。

圖6示出本發(fā)明對(duì)比例1所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的掃描電鏡圖。

圖7示出本發(fā)明對(duì)比例2所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液在調(diào)節(jié)酸堿度后所得到的乳液液滴的透射電鏡圖。

圖8示出本發(fā)明對(duì)比例2所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的掃描電鏡圖。

圖9示出本發(fā)明對(duì)比例3所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液在調(diào)節(jié)酸堿度后所得到的乳液液滴的透射電鏡圖。

圖10示出本發(fā)明對(duì)比例3所制備的煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的掃描電鏡圖。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法

一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法，包括以下步驟(其流程示意圖如圖1所示)：

(1)煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液的制備

取0.6ml濃度在10mg/ml的煙草花葉病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，將離心管顛倒5次以充分混勻后在4℃冰箱中靜置30min。在4℃下以9500rpm離心10min以去除RNA沉淀。將上清液過脫鹽柱分離，去除乙酸部分。將所得到的溶液在去離子水中透析18h，之后在4℃下以9000rpm離心10min。將所得的沉淀加入100mM的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液復(fù)溶，獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液。

(2)煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液的制備

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸緩沖溶液的0.5mg/ml的煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液1.8ml。加入0.2ml全氟萘烷作為油相，經(jīng)過以獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液。取一滴所制備的乳液，將其滴在玻璃片上，使用顯微鏡觀察，可以觀察到圓形的乳液液滴，如圖2所示。

(3)煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備

在所得乳液體系中滴加稀鹽酸，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至5.5。保持震蕩4h，使用透射電鏡觀察乳液液滴結(jié)構(gòu)，可以看到在乳液液滴表面密集堆積的棒狀煙草花葉病毒衣殼蛋白，如圖3所示。之后在體系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在體系中的終濃度為2.5％，在4℃的條件下反應(yīng)6h，以制備煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊。將產(chǎn)物滴在硅片上干燥，之后通過掃描電鏡觀察。在掃描電鏡下觀察到堅(jiān)固且均一的膠囊結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

實(shí)施例2一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法

一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法，包括以下步驟：

(1)煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液的制備

取0.6ml濃度在20mg/ml的煙草花葉病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，將離心管顛倒5次以充分混勻后在4℃冰箱中靜置40min。在4℃下以10000rpm離心8min以去除RNA沉淀。將上清液過脫鹽柱分離，去除乙酸部分。將所得到的溶液在去離子水中透析12h，之后在4℃下以8000rpm離心12min。將所得的沉淀加入200mM的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液復(fù)溶，獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液。

(2)煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液的制備

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸緩沖溶液的1mg/ml的煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液2.2ml。加入0.2ml全氟萘烷作為油相，經(jīng)過以獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液。取一滴所制備的乳液，將其滴在玻璃片上，使用顯微鏡觀察，可以觀察到圓形的乳液液滴，如圖2所示。

(3)煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備

在所得乳液體系中滴加稀鹽酸，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至5.7。保持震蕩4h，使用透射電鏡觀察乳液液滴結(jié)構(gòu)，如圖3所示，可以看到在乳液液滴表面分布著較多的棒狀煙草花葉病毒衣殼蛋白。之后在體系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在體系中的終濃度為3％，在4℃的條件下反應(yīng)6h，以制備煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊。將產(chǎn)物滴在硅片上干燥，之后通過掃描電鏡觀察。在掃描電鏡下觀察到堅(jiān)固且均一的膠囊結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

實(shí)施例3一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法

一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法，包括以下步驟：

(1)煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液的制備

取0.6ml濃度在5mg/ml的煙草花葉病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，將離心管顛倒5次以充分混勻后在4℃冰箱中靜置30min。在4℃下以8000rpm離心10min以去除RNA沉淀。將上清液過脫鹽柱分離，去除乙酸部分。將所得到的溶液在去離子水中透析24h，之后在4℃下以9000rpm離心10min。將所得的沉淀加入20mM的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液復(fù)溶，獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液。

(2)煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液的制備

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸緩沖溶液的0.1mg/ml的煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液1.6ml。加入0.2ml全氟萘烷作為油相，經(jīng)過以獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液。取一滴所制備的乳液，將其滴在玻璃片上，使用顯微鏡觀察，可以觀察到圓形的乳液液滴，如圖2所示。

(3)煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備

在所得乳液體系中滴加稀鹽酸，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至5.3。保持震蕩4h，使用透射電鏡觀察乳液液滴結(jié)構(gòu)，如圖3所示，可以看到在乳液液滴表面分布著較多的棒狀煙草花葉病毒衣殼蛋白。之后在體系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在體系中的終濃度為2％，在4℃的條件下反應(yīng)6h，以制備煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊。將產(chǎn)物滴在硅片上干燥，之后通過掃描電鏡觀察。在掃描電鏡下觀察到堅(jiān)固且均一的膠囊結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

對(duì)比例1一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法

一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法，包括以下步驟：

(1)煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液的制備

取0.6ml濃度在5-20mg/ml的煙草花葉病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，將離心管顛倒5次以充分混勻后在4℃冰箱中靜置30min。在4℃以9500rpm離心10min以去除RNA沉淀。將上清液過脫鹽柱分離，去除乙酸部分。將所得到的溶液在去離子水中透析18h，之后在4℃下以9000rpm離心10min。將所得的沉淀加入100mM的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液復(fù)溶，獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液。

(2)煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液的制備

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸緩沖溶液的0.5mg/ml的煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液1.8ml。加入0.2ml全氟萘烷作為油相，經(jīng)過以獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液。取一滴所制備的乳液，將其滴在玻璃片上，使用顯微鏡觀察，可以觀察到圓形的乳液液滴。

(3)煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備

在所得乳液體系中滴加稀鹽酸，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至6.0。保持震蕩4h，使用透射電鏡觀察乳液液滴結(jié)構(gòu)，如圖5所示，可以看到在乳液液滴表面分布著較多的棒狀煙草花葉病毒衣殼蛋白。之后在體系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在體系中的終濃度為2.5％，在4℃的條件下反應(yīng)6h，以制備煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊。將產(chǎn)物滴在硅片上干燥，之后通過掃描電鏡觀察。在掃描電鏡下觀察到破碎的膠囊結(jié)構(gòu)，如圖6所示。

對(duì)比例2一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法

一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法，包括以下步驟：

(1)煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液的制備

取0.6ml濃度在10mg/ml的煙草花葉病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，將離心管顛倒5次以充分混勻后在4℃冰箱中靜置30min。在4℃下以9500rpm離心10min以去除RNA沉淀。將上清液過脫鹽柱分離，去除乙酸部分。將所得到的溶液在去離子水中透析18h，之后在4℃下以9000rpm離心10min。將所得的沉淀加入100mM的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液復(fù)溶，獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液。

(2)煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液的制備

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸緩沖溶液的0.5mg/ml的煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液1.8ml。加入0.2ml全氟萘烷作為油相，經(jīng)過以獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液。取一滴所制備的乳液，將其滴在玻璃片上，使用顯微鏡觀察，可以觀察到圓形的乳液液滴。

(3)煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備

在所得乳液體系中滴加稀鹽酸，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至7.0。保持震蕩4h，使用透射電鏡觀察乳液液滴結(jié)構(gòu)，如圖7所示，可以看到在乳液液滴表面分布著形態(tài)不規(guī)則煙草花葉病毒衣殼蛋白。之后在體系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在體系中的終濃度為2.5％，在4℃的條件下反應(yīng)6h，以制備煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊。將產(chǎn)物滴在硅片上干燥，之后通過掃描電鏡觀察。在掃描電鏡下觀察到膠囊結(jié)構(gòu)完全破碎后所留下的輪廓結(jié)構(gòu)，如圖8所示。

對(duì)比例3一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法

一種煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備方法，包括以下步驟：

(1)煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液的制備

取0.6ml濃度在10mg/ml的煙草花葉病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，將離心管顛倒5次以充分混勻后在4℃冰箱中靜置30min。在4℃下以9500rpm離心10min以去除RNA沉淀。將上清液過脫鹽柱分離，去除乙酸部分。將所得到的溶液在去離子水中透析18h，之后在4℃下以9000rpm離心10min。將所得的沉淀加入100mM的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液復(fù)溶，獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液。

(2)煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液的制備

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸緩沖溶液的0.5mg/ml的煙草花葉病毒衣殼蛋白溶液1.8ml。加入0.2ml全氟萘烷作為油相，經(jīng)過以獲得煙草花葉病毒衣殼蛋白乳液。取一滴所制備的乳液，將其滴在玻璃片上，使用顯微鏡觀察，可以觀察到圓形的乳液液滴。

(3)煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊的制備

在所得乳液體系的酸堿度為至8.0。保持震蕩4h，使用透射電鏡觀察乳液液滴結(jié)構(gòu)，如圖9所示，可以看到在乳液液滴表面分布著形態(tài)不規(guī)則煙草花葉病毒衣殼蛋白。之后在體系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在體系中的終濃度為2.5％，在4℃的條件下反應(yīng)6h，以制備煙草花葉病毒衣殼蛋白膠囊。將產(chǎn)物滴在硅片上干燥，之后通過掃描電鏡觀察。在掃描電鏡下觀察到膠囊結(jié)構(gòu)完全破碎后所留下的輪廓結(jié)構(gòu)，如圖10所示。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。