本發(fā)明屬于抗凝血材料技術領域，尤其涉及一種陽離子化絲素蛋白材料、其制備方法及應用。
背景技術：
我國每年心腦血管疾病死亡人數(shù)有數(shù)百萬，并在逐年增加，因此，血液接觸材料是目前臨床上最為緊缺的生物材料(醫(yī)療器械)，尤其是人工血管移植，即便是得到臨床應用的中、大口徑人工血管，在我國產(chǎn)品也非常稀少，國產(chǎn)產(chǎn)品每年的使用比例只有20％左右，而小口徑人工血管的移植還是臨床空白，其最大的問題就是容易形成血栓，遠期通暢率較差。
目前醫(yī)學上應用的人工血管產(chǎn)品主要是由滌綸、膨體聚四氟乙烯等合成材料制成的，在大中口徑人工血管方面有臨床應用，但這些合成材料細胞相容性差，不利于內(nèi)皮化，容易形成血栓，影響組織愈合。家蠶蠶絲是由家蠶合成與分泌的天然動物蛋白，來源廣泛，其絲素蛋白具有良好的生物相容性，由20種人體可吸收的氨基酸組成，最終降解產(chǎn)物為氨基酸或小肽，易被細胞吸收或吞噬，不會引起明顯的免疫反應。已有大量的文獻研究表明絲素蛋白材料能夠支持多種細胞的生長，在組織工程材料研究方面越來越深入，并取得了突破性的進展，近來，應用于血管組織工程上也越來越受到關注。
雖然絲素蛋白材料本身具有細胞相容性和組織相容性的優(yōu)勢，但作為外源材料，在與血液接觸時都會刺激凝血系統(tǒng)，誘發(fā)溶血或凝血。為了提高絲素材料的抗凝血性能，國內(nèi)外一些研究人員也關注到了改善絲素蛋白材料的抗凝血性能研究。
目前，對絲素蛋白的抗凝血改性主要報導了接枝具有抗凝作用的高分子及硫酸化或肝素化方法。如She等將肝素在溫和的條件下加入絲素/殼聚糖支架中，增強了抗凝性(Polymer International,2010,59(1):55-61)；Liu等利用靜電紡絲技術將氯磺酸處理過的絲素蛋白制成絲素納米支架，硫酸化納米絲素支架的抗凝血性顯著增強(Biomaterials,2011,32(15):3784-3793)；Wang等利用靜電紡絲技術制備了肝素改性絲素納米材料，體外凝血測試結(jié)果表明改性后絲素納米材料的抗凝血性遠高于純絲素(International Journal of Biological Macromolecules，2011，48(2):345-353)；用氯磺酸制備的硫酸化絲素蛋白的抗凝血活性要比硫酸制備的硫酸化絲素大大提高(Biomaterials,2004,25(3)：377-383)，但遠遠不及肝素。肝素改性絲素蛋白材料抗凝血性研究已存在知識產(chǎn)權(如抗凝血真皮支架的制備，申請?zhí)枮镃N200910223207.4的中國專利；納米纖維人工血管及制備方法，申請?zhí)枮镃N200910228843.6的中國專利)，所以引入肝素是目前絲素材料抗凝血性改性的主要方法，但肝素屬于一種凝血酶間接抑制劑，抗凝作用要依賴抗凝血酶和特定的輔因子，所以即使材料中共混或鍵合的肝素不一定能或都能發(fā)揮抗凝作用。
水蛭素是一種凝血酶特異性抑制劑，可以直接抑制血栓形成，還可以對已形成的血栓有一定的溶栓作用。我們已經(jīng)研究開發(fā)了一種水蛭素/絲素蛋白抗凝血材料(一種抗凝血絲素材料及其制備方法，申請?zhí)枮閆L201310250951.X的中國專利；一種抗凝血絲素膜及其制備方法，申請?zhí)枮閆L201310251819.0的中國專利；Journal of Biomedical Materials Research Part B,2015:103B:556–562)，但深入研究發(fā)現(xiàn)，將研究結(jié)果與水蛭素抑制凝血酶活性的機理結(jié)合起來分析，采用共價鍵結(jié)合的改性方法會降低水蛭素的活性。
技術實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種陽離子化絲素蛋白材料、其制備方法及其應用，該方法制備的陽離子化絲素蛋白材料可制備具有高效抑制凝血酶活性、持續(xù)具有抗凝血功能的抗凝血材料。
本發(fā)明提供了一種陽離子化絲素蛋白材料的制備方法，包括以下步驟：
將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應后透析，得到陽離子化絲素蛋白材料。
優(yōu)選的，所述絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度為3％～20％。
優(yōu)選的，所述聚乙二醇二胺的質(zhì)量與絲素蛋白溶液中絲素蛋白的質(zhì)量比為A，0＜A≤0.5。
優(yōu)選的，所述交聯(lián)劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、2-嗎啉乙磺酸、碳化二亞胺、京尼平與聚乙二醇甘油醚中的一種或多種。
優(yōu)選的，所述交聯(lián)劑的質(zhì)量為絲素蛋白溶液中絲素蛋白質(zhì)量的B％，B≥20。
優(yōu)選的，所述反應的時間為10～30min；所述透析的時間為12～48h。
本發(fā)明還提供了一種陽離子化絲素蛋白材料，包括經(jīng)聚乙二醇二胺陽離子化的絲素蛋白。
本發(fā)明還提供了上述陽離子化絲素蛋白材料在抗凝血材料中的應用。
優(yōu)選的，所述抗凝血材料按照以下步驟制備：
將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應后透析，得到陽離子化絲素蛋白溶液，然后加入水蛭素，得到抗凝血材料。
優(yōu)選的，所述水蛭素加入量為使反應液中水蛭素的濃度為C U/ml，0＜C≤500。
本發(fā)明提供了一種陽離子化絲素蛋白材料的制備方法，包括以下步驟：將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應后透析，得到陽離子化絲素蛋白材料。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明制備的陽離子化絲素蛋白材料可與水蛭素制備抗凝血材料，保護了與凝血酶結(jié)合區(qū)域的官能團(-COOH、-NH2、-OH)不因被反應而影響與凝血酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、又能使水蛭素以較強結(jié)合力的離子鍵結(jié)合于聚乙二醇雙胺陽離子化的絲素蛋白上，達到穩(wěn)定發(fā)揮抗凝的作用，從而使得到的抗凝血材料具有顯著抑制凝血酶活性的功能。
本發(fā)明還提供了上述陽離子化絲素蛋白材料在抗凝血材料中的應用，所述抗凝血材料按照以下步驟制備：將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應后透析，得到陽離子化絲素蛋白溶液，然后加入水蛭素，得到抗凝血材料。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明制備的抗凝血材料保護了與凝血酶結(jié)合區(qū)域的官能團(-COOH、-NH2、-OH)不因被反應而影響與凝血酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、又能使水蛭素以較強結(jié)合力的離子鍵結(jié)合于聚乙二醇雙胺陽離子化的絲素蛋白上，部分水蛭素包裹于絲素蛋白內(nèi)部，隨著絲素蛋白的降解而逐漸釋放，從而使得到的抗凝血材料具有顯著抑制凝血酶活性的功能的同時也達到穩(wěn)定并長期發(fā)揮抗凝的作用。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
本發(fā)明提供了一種陽離子化絲素蛋白材料，包括經(jīng)聚乙二醇二胺陽離子化的絲素蛋白。
其中，所述聚乙二醇二胺與絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為A，0＜A≤0.5，更優(yōu)選為0.01～0.5，再優(yōu)選為0.01～0.2，最優(yōu)選為0.05～0.1；在本發(fā)明提供的一些實施例中，所述聚乙二醇二胺與絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為0.05；在本發(fā)明提供的一些實施例中，所述聚乙二醇二胺與絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為0.01；在本發(fā)明提供的另一些實施例中，所述聚乙二醇二胺與絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為0.1。
在本發(fā)明中，優(yōu)選還包括交聯(lián)劑；所述交聯(lián)劑為本領域技術人員熟知的交聯(lián)劑即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、2-嗎啉乙磺酸、碳化二亞胺、京尼平與聚乙二醇甘油醚中的一種或多種；所述交聯(lián)劑的質(zhì)量優(yōu)選為絲素蛋白質(zhì)量的B％，B≥20，更優(yōu)選為20％～50％。
本發(fā)明提供的陽離子化絲素蛋白材料可用于制備抗凝血材料。
本發(fā)明還提供了一種上述陽離子化絲素蛋白材料的制備方法，包括以下步驟：將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應后透析，得到陽離子化絲素蛋白材料。
本發(fā)明對所有原料的來源并沒有特殊的限制，為市售或自制均可。
其中，所述絲素蛋白溶液中絲素蛋白的質(zhì)量濃度優(yōu)選為3％～20％；所述絲素蛋白為本領域技術人員熟知的絲素蛋白即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為家蠶絲素蛋白；所述絲素蛋白溶液優(yōu)選按照以下方法制備：將蠶絲或蠶殼進行脫膠、溶解后，灌注于透析袋內(nèi)，用去離子水透析，得到絲素蛋白溶液。
其中，所述脫膠的方法為本領域技術人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選將蠶絲或蠶殼在碳酸鈉水溶液中加熱處理，水洗，拉松后，得到脫膠的絲素纖維；所述碳酸鈉水溶液為本領域技術人員熟知的水溶液即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為濃度0.1％～1％的碳酸鈉水溶液，更優(yōu)選為0.1％～0.5％，再優(yōu)選為0.2％～0.3％；所述蠶絲或蠶殼與碳酸鈉水溶液的比例優(yōu)選為(0.1～10)g：50ml，更優(yōu)選為(0.5～5)g：50ml，再優(yōu)選為(0.5～2)g：50ml，最優(yōu)選為1g：50ml；所述加熱處理的溫度優(yōu)選為98℃～100℃；所述加熱處理的時間優(yōu)選為20～40min；所述加熱處理的次數(shù)優(yōu)選為2～4次。
將脫膠的絲素纖維溶解，得到絲素溶解液；所述溶解的方法為本領域技術人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為將脫膠的絲素纖維與于氯化鈣-乙醇的水溶液混合，加熱溶解后，得到絲素溶解液；所述脫膠的絲素纖維與氯化鈣-乙醇的水溶液的比例優(yōu)選為(0.1～5)g：10ml，更優(yōu)選為(0.5～3)g：10ml，再優(yōu)選為(1～2)g：10ml；所述氯化鈣與乙醇的摩爾比優(yōu)選為1：2；所述加熱溶解的溫度優(yōu)選為60℃～80℃，更優(yōu)選為65℃～75℃，最優(yōu)選為70℃；所述加熱溶解的時間優(yōu)選為1～3h，更優(yōu)選為2～3h。
將絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，用去離子水透析，得到絲素蛋白溶液；所述透析袋為半透膜，其截留分子量優(yōu)選為12.0～16.0kDa；透析時優(yōu)選每隔1～3h，更優(yōu)選每隔2h用新的去離子水或純凈水更換透析所用的去離子水；所述透析的時間優(yōu)選為3天。
將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，優(yōu)選先將絲素蛋白溶液與聚乙二醇二胺混合后，再加入交聯(lián)劑；所述聚乙二醇二胺的質(zhì)量與絲素蛋白溶液中絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為A，0＜A≤0.5，更優(yōu)選為0.01～0.5，再優(yōu)選為0.01～0.2，最優(yōu)選為0.05～0.1；所述交聯(lián)劑為本領域技術人員熟知的交聯(lián)劑即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、2-嗎啉乙磺酸、碳化二亞胺、京尼平與聚乙二醇甘油醚中的一種或多種，更優(yōu)選為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺與2-嗎啉乙磺酸；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺與2-嗎啉乙磺酸的質(zhì)量比優(yōu)選為2:1:2；所述交聯(lián)劑的質(zhì)量優(yōu)選為絲素蛋白溶液中絲素蛋白質(zhì)量的B％，B≥20，更優(yōu)選為20％～50％。
然后進行反應；所述反應的時間優(yōu)選為10min～1h，更優(yōu)選為15～45min，再優(yōu)選為20min。
反應后進行透析；所述透析的時間優(yōu)選為12～48h，得到陽離子化絲素蛋白材料。其可通過烘干或冷凍干燥成型。
本發(fā)明制備的陽離子化絲素蛋白材料可與水蛭素制備抗凝血材料，保護了與凝血酶結(jié)合區(qū)域的官能團(-COOH、-NH2、-OH)不因被反應而影響與凝血酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、又能使水蛭素以較強結(jié)合力的離子鍵結(jié)合于聚乙二醇雙胺陽離子化的絲素蛋白上，達到穩(wěn)定發(fā)揮抗凝的作用，從而使得到的抗凝血材料具有顯著抑制凝血酶活性的功能。
本發(fā)明還提供了一種上述制備的陽離子化絲素蛋白材料在抗凝血材料中的應用。
按照本發(fā)明，所述抗凝血材料優(yōu)選按照以下步驟制備：將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應后透析，得到陽離子化絲素蛋白溶液，然后加入水蛭素，得到抗凝血材料。
其中，所述陽離子化絲素蛋白材料的制備同上所述，在此不再贅述。
透析后加入水蛭素；所述水蛭素的加入量優(yōu)選為使反應液中水蛭素的濃度為C U/ml，0＜C≤500，更優(yōu)選為10～500U/ml，再優(yōu)選為10～300U/ml，再優(yōu)選為10～200U/ml，再優(yōu)選為10～100U/ml，再優(yōu)選為10～50U/ml。
加入水蛭素后，優(yōu)選攪拌均勻，然后室溫風干或冷凍干燥后，得到抗凝血材料。在本發(fā)明中，優(yōu)選倒入一定面積的器皿中室溫風干或冷凍干燥，更優(yōu)選平板內(nèi)，再優(yōu)選倒入聚苯乙烯板內(nèi)室溫風干或冷凍干燥。
本發(fā)明提供的制備方法保護了與凝血酶結(jié)合區(qū)域的官能團(-COOH、-NH2、-OH)不因被反應而影響與凝血酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、又能使水蛭素以較強結(jié)合力的離子鍵結(jié)合于聚乙二醇雙胺陽離子化的絲素蛋白上，而且部分水蛭素包裹于絲素蛋白內(nèi)部，隨著絲素蛋白的降解而逐漸釋放，從而使得到的抗凝血材料具有顯著抑制凝血酶活性的功能的同時也達到穩(wěn)定并長期發(fā)揮抗凝的作用。
為了進一步說明本發(fā)明，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種陽離子化絲素蛋白材料、其制備方法及其應用進行詳細描述。
以下實施例中所用的試劑均為市售。
實施例1
1.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
1.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
1.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
1.4按質(zhì)量比100:1配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時，得到陽離子化絲素蛋白溶液，然后倒入一平整的聚苯乙烯板內(nèi)室溫風干得到陽離子化絲素蛋白材料。
利用Zeta電位儀對實施例1中得到的陽離子化絲素蛋白材料進行分析，測得其表面電荷為正電荷，Zeta電位>11。
實施例2
2.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
2.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
2.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
2.4按質(zhì)量比100:5配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時，得到陽離子化絲素蛋白溶液，然后倒入一平整的聚苯乙烯板內(nèi)室溫風干得到陽離子化絲素蛋白材料。
利用Zeta電位儀對實施例2中得到的陽離子化絲素蛋白材料進行分析，測得其表面電荷為正電荷，Zeta電位>15。
實施例3
3.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
3.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
3.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
3.4按質(zhì)量比100:5配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時，得到陽離子化絲素蛋白溶液。
3.5向陽離子化絲素蛋白溶液中加入水蛭素，使溶液中水蛭素的濃度為10U/mL，攪拌均勻后倒入一定面積的聚苯乙烯板內(nèi)室溫風干，得到抗凝血材料。
將實施例3中得到的抗凝血絲素蛋白材料進行抗凝血酶活性測試，檢測450nm處凝血酶活性的吸光度值OD450值比純凝血酶活性的吸光度值下降65％，即抗凝血材料能夠顯著地抑制凝血酶的活性。
實施例4
4.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
4.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
4.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
4.4按質(zhì)量比100:1配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時，得到陽離子化絲素蛋白溶液。
4.5向陽離子化絲素蛋白溶液中加入水蛭素，使溶液中水蛭素的濃度為20U/mL，攪拌均勻后倒入一定面積的聚苯乙烯板內(nèi)室溫風干，得到抗凝血材料。
將實施例4中得到的抗凝材料進行抗凝血酶活性測試，檢測450nm處凝血酶活性的吸光度值OD450值比純凝血酶活性的吸光度值下降25％，即抗凝血材料具有一定的抑制凝血酶活性的能力。
實施例5
5.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
5.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
5.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
5.4按質(zhì)量比100:5配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時，得到陽離子化絲素蛋白溶液。
5.5向陽離子化絲素蛋白溶液中加入水蛭素，使溶液中水蛭素的濃度為20U/mL，攪拌均勻后冷凍干燥，得到抗凝血材料。
將實施例5中得到的抗凝血材料進行抗凝血酶活性測試，檢測450nm處凝血酶活性的吸光度值OD450值比純凝血酶活性的吸光度值下降80％，即抗凝血材料能夠顯著地抑制凝血酶的活性。
實施例6
6.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
6.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
6.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
6.4按質(zhì)量比100:10配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時，得到陽離子化絲素蛋白溶液。
6.5向陽離子化絲素蛋白溶液中加入水蛭素，使溶液中水蛭素的濃度為40U/mL，攪拌均勻后冷凍干燥，得到抗凝血材料。
將實施例6中得到的抗凝血材料進行抗凝血酶活性測試，檢測450nm處凝血酶活性的吸光度值OD450值比純凝血酶活性的吸光度值下降90％以上，即抗凝血材料能夠顯著地抑制凝血酶的活性。
比較例1
1.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
1.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
1.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
1.4向絲素蛋白水溶液中加入質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時，然后倒入一平整的聚苯乙烯板內(nèi)室溫風干得再生絲素材料。
利用Zeta電位儀對比較例1中得到的再生絲素材料進行分析，測得其表面電荷為負電荷。
比較例2
2.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
2.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
2.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
2.4向絲素蛋白水溶液中加入質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時；然后加入水蛭素使溶液中水蛭素的濃度為10U/mL，攪拌均勻后倒入一定面積的聚苯乙烯板內(nèi)室溫風干或冷凍干燥，得到抗凝血絲素蛋白材料。
將比較例2中得到的抗凝血絲素蛋白材料進行抗凝血酶活性測試，檢測450nm處凝血酶活性的吸光度值OD450比純凝血酶活性的吸光度值下降6％，材料抑制凝血酶活性的能力很小，結(jié)合比較例2說明水蛭素沒有能穩(wěn)固地加載到絲素蛋白材料上。
比較例3
3.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
3.2稱取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時得家蠶絲素溶解液。
3.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
3.4向絲素蛋白水溶液中加入質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，反應20分鐘后用去離子水透析12～48小時，然后倒入一定面積的聚苯乙烯板內(nèi)室溫風干，得到純絲素蛋白膜。
將比較例3中得到的純絲素蛋白膜進行抗凝血酶活性測試，檢測450nm處凝血酶活性的吸光度值OD450值比純凝血酶活性的吸光度值下降2％，說明純絲素蛋白材料沒有抑制凝血酶活性的能力。