本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種治療脂多糖/D-氨基半乳糖胺(LPS/GalN)誘導(dǎo)肝損傷的藥物。

背景技術(shù)：

肝功能衰竭時(shí)往往發(fā)生內(nèi)毒素血癥和膿毒癥幾率要明顯增高，并且常常因有效藥物缺乏導(dǎo)致高死亡率。因此，迫切需要對(duì)肝損傷開發(fā)有靶向性的且明確有效的藥物療法。脂多糖和D-氨基半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠是一種廣泛使用的肝損傷模型。它多年來已被用于潛在治療藥物的初步藥理學(xué)研究。半乳糖胺是肝毒性試劑，肝毒性主要是通過抑制肝細(xì)胞RNA和蛋白合成。脂多糖是可以誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的內(nèi)毒素。這些促炎介質(zhì)能夠?qū)е赂谓M織損傷。連翹(作為中國最著名的中藥材之一)已被廣泛用于治療各種感染性疾病，如腎炎，潰瘍、丹毒。連翹是傳統(tǒng)的中成藥雙黃連的主要成分。連翹酯苷A是從連翹果實(shí)風(fēng)干后提取的一種活性成分，已報(bào)告其有多個(gè)藥理活性，包括抗炎，抗氧化活性。以往的研究表明，連翹酯苷A可以保護(hù)防止過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激。此外，連翹酯苷A被發(fā)現(xiàn)在抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷和抑制LPS誘導(dǎo)的雞法氏囊炎癥反應(yīng)。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A對(duì)衰老加速小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用。LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷是目前公認(rèn)的肝損傷模型，本發(fā)明采用連翹酯苷A治療LPS/GalN誘導(dǎo)肝損傷，并進(jìn)一步研究其起效的機(jī)制，為肝損傷的治療探討新的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療脂多糖/D-氨基半乳糖胺誘導(dǎo)肝損傷的藥物，旨在解決連翹酯苷A對(duì)脂多糖/氨基半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷的影響仍不清楚的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種治療脂多糖/D-氨基半乳糖胺誘導(dǎo)肝損傷的藥物，所述治療脂多糖/D-氨基半乳糖胺誘導(dǎo)肝損傷的藥物為連翹酯苷A。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種驗(yàn)證所述治療脂多糖/D-氨基半乳糖胺誘導(dǎo)肝損傷的藥物的動(dòng)物模型，所述動(dòng)物模型為：D-氨基半乳糖胺(GalN)800毫克/千克和LPS 50微克/千克(溶解在PBS中)腹腔注射誘導(dǎo)肝損傷模型。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：

步驟一，七十五個(gè)小鼠隨機(jī)分成五組，每組含有15只小鼠；

步驟二，I組:正常對(duì)照組，小鼠接受等量的PBS；II組:模型對(duì)照組，小鼠接受GalN 800毫克/千克和LPS50微克/千克；III-V組:連翹酯苷A治療組，給予小鼠腹腔注射連翹酯苷A，劑量分別為15毫克/千克，30毫克/千克，60毫克/千克，給藥時(shí)間為LPS/半乳糖胺處理前1小時(shí)；

步驟三，收集用于后續(xù)分析的血液和肝臟組織。

進(jìn)一步，所述連翹酯苷A減輕LPS/GalN誘導(dǎo)的肝臟病理損傷、丙二醛含量以及血清ALT，AST水平；連翹酯苷A抑制LPS/GalN導(dǎo)致的NF-κB激活、血清TNF-α、肝臟TNF-α水平；連翹酯苷A上調(diào)Nrf2和血紅素加氧酶1的表達(dá)；連翹酯苷A對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用是通過激活Nrf2和抑制NF-κB激活而實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明提供的治療LPS/GalN誘導(dǎo)肝損傷的藥物，連翹酯苷A是從連翹果實(shí)風(fēng)干后提取的一種活性成分，已報(bào)告其有多個(gè)藥理活性，包括抗炎，抗氧化活性。本發(fā)明為了明確連翹酯苷A對(duì)LPS/GalN所致的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，LPS(50微克/千克)/GalN(800毫克/千克)誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型。小鼠給藥LPS/GalN后1小時(shí)再給藥連翹酯苷A。結(jié)果表明，連翹酯苷A可以減輕LPS/GalN誘導(dǎo)的肝臟病理損傷、丙二醛(MDA)含量以及血清ALT，AST水平。此外，連翹酯苷A抑制LPS/GalN導(dǎo)致的NF-κB激活、血清TNF-α、肝臟TNF-α水平。此外，發(fā)現(xiàn)，連翹酯苷A上調(diào)Nrf2和血紅素加氧酶1的表達(dá)。結(jié)果表明，連翹酯苷A對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用是通過激活Nrf2和抑制NF-κB激活而實(shí)現(xiàn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的驗(yàn)證治療LPS/GalN誘導(dǎo)肝損傷的藥物的模型構(gòu)建方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的各組小鼠血清ALT、AST水平示意圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的HE染色(200×)示意圖；

圖中：A:正常對(duì)照組；B：LPS/GalN組；C：LPS/GalN+連翹酯苷A(15mg/kg)組；D：LPS/GalN+連翹酯苷A(30mg/kg)組；E組：LPS/GalN+連翹酯苷A(60mg/kg)組。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的各組血清和肝臟組織TNF-α水平示意圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的各組肝臟組織MDA檢測(cè)結(jié)果示意圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的連翹酯苷A能夠抑制被LPS/GalN誘導(dǎo)的NF-κB激活狀態(tài)示意圖。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的連翹酯苷A對(duì)Nrf2和HO-1的表達(dá)的影響示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的驗(yàn)證治療脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)肝損傷的藥物的模型構(gòu)建方法包括以下步驟：

S101：七十五個(gè)小鼠隨機(jī)分成五組，每組含有15只小鼠；

S102：I組，正常對(duì)照組，小鼠接受等量的PBS；II組，模型對(duì)照組，小鼠接受GalN 800毫克/千克和LPS50微克/千克；III-V組，連翹酯苷A治療組，給予小鼠腹腔注射連翹酯苷A，劑量分別為15毫克/千克，30毫克/千克，60毫克/千克，給藥時(shí)間為LPS/GalN處理前1小時(shí)；

S103：收集用于后續(xù)分析的血液和肝臟組織。

下面結(jié)合試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

1.材料與方法

1.1.材料

連翹酯苷A購自中國藥品生物制品檢定所(中國北京)。小鼠TNF-αELISA試劑盒購自R&DSystems公司(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯)。LPS(大腸桿菌，O55：B5)和D-氨基半乳糖胺均購自Sigma公司(圣路易斯，密蘇里州，美國)購買的?？筆NF-kB p65亞基、抗NF-κB p65亞基、抗HO-1、抗Nrf2和抗β肌動(dòng)蛋白的單克隆抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz公司，加利福尼亞，美國)。丙二醛(MDA)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所(南京，江蘇，中國)提供。其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2.動(dòng)物

雄性BALB/c小鼠，體重約18～22g，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國鄭州)購買。將小鼠圈養(yǎng)在環(huán)境受控的房間(24±1℃，40％-80％的濕度)。他們被允許自由獲得食物和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程按照美國國立衛(wèi)生研究院公布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷與使用指南》進(jìn)行。

1.3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

D-半乳糖胺800毫克/千克和LPS 50微克/千克(溶解在PBS中)腹腔注射誘導(dǎo)肝損傷模型。探討連翹酯苷A對(duì)LPS/氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用。七十五個(gè)小鼠隨機(jī)分成五組，每組含有15只小鼠：I組，正常對(duì)照組，小鼠接受等量的PBS；II組，模型對(duì)照組，小鼠接受D-半乳糖胺800毫克/千克和LPS50微克/千克；III-V組，連翹酯苷A治療組，給予小鼠腹腔注射連翹酯苷A，劑量分別為15毫克/千克，30毫克/千克，60毫克/千克，給藥時(shí)間為LPS/半乳糖胺處理前1小時(shí)。

收集用于后續(xù)分析的血液和肝臟組織。

1.4.細(xì)胞因子測(cè)定

LPS/GalN給藥2小時(shí)后，收集動(dòng)物血清和肝組織，檢測(cè)TNF-α水平。血清和肝組織TNF-α的水平檢測(cè)，根據(jù)制造商提供的ELISA試劑盒(R&D)說明進(jìn)行。

1.5.肝酶的分析

肝細(xì)胞的損害是通過檢測(cè)ALT和AST水平進(jìn)行評(píng)估。血清ALT及AST的檢測(cè)是在LPS/GalN給藥8小時(shí)后進(jìn)行。ALT和AST檢測(cè)按照南京建成生物工程研究所購買的測(cè)試試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.MDA含量測(cè)定

丙二醛(脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物)，是用來評(píng)估在肝臟脂質(zhì)過氧化。肝組織MDA含量檢測(cè)是在LPS/GalN給藥8小時(shí)后進(jìn)行，按MDA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行。

1.7.組織病理學(xué)評(píng)估

肝組織固定，用10％緩沖的福爾馬林，包埋在石蠟中，切片。經(jīng)過HE染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.8.Western blot分析

根據(jù)T-PER組織蛋白提取試劑盒(Thermo公司)說明書提取蛋白。核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取根據(jù)NE-PER核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒(Thermo公司)進(jìn)行。蛋白濃度通過BCA蛋白測(cè)定試劑盒來確定。12％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白。然后蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜用5％脫脂牛奶在室溫下2小時(shí)，隨后一抗(1：1000)4℃孵育過夜。接著，將膜用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)志的二抗孵育。通過使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的免疫活性蛋白。

1.9.統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(±S)表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)的平均值之間的差異是使用單因素方差分析(Dunnett法)。P<0.05時(shí)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01時(shí)組間顯著差異。

2.結(jié)果

2.1.連翹酯苷A能夠降低LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷模型的血清ALT、AST水平。

如圖2，LPS/GalN模型組ALT和AST水平較正常組顯著增加。連翹酯苷A治療組較模型組下降。

2.2.連翹酯苷A對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷模型病理改變的保護(hù)作用

病理變化

為了觀察連翹酯苷A對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用，觀察到一個(gè)光鏡下肝組織病理學(xué)改變。如圖3，正常對(duì)照組的肝臟切片顯示正常肝小葉結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從LPS/GalN模型組獲得的肝臟切片顯示顯著病理變化，包括門靜脈炎癥，細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤廣泛。然而，連翹酯苷A治療組肝損傷顯著減輕。

2.3.連翹酯苷A對(duì)TNF-α產(chǎn)生的影響

用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α在血清和肝臟樣品的水平。結(jié)果表明，LPS/GalN模型組血清和肝臟組織的TNF-α水平較正常對(duì)照組顯著增加。連翹酯苷A能夠抑制LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷導(dǎo)致的的TNF-α上升，具有劑量依賴性(圖4)。

2.4.連翹酯苷A影響脂質(zhì)過氧化作用

丙二醛(MDA)，脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，被稱為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。如圖5，LPS/GalN模型組肝臟組織丙二醛含量較正常組增加顯著。然而，連翹酯苷A治療組MDA水平較損傷模型組顯著降低。

2.5.連翹酯苷A對(duì)NF-κB激活的影響

NF-κB是主導(dǎo)炎癥的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。脂多糖可以促進(jìn)NF-κB的活化并誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，LPS/GalN模型組小鼠肝臟組織NF-κB p65亞基細(xì)胞核中表達(dá)增加，細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)降低；而連翹酯苷A治療組小鼠肝臟組織的NF-κB p65亞基較模型組，細(xì)胞核中表達(dá)減少，細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)升高(圖6)。

2.6.連翹酯苷促進(jìn)Nrf2的和HO-1的表達(dá)

NRF-2在組織細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A對(duì)Nrf2的和HO-1表達(dá)的影響是積極的。結(jié)果表明，LPS/GalN模型組肝組織胞核內(nèi)Nrf2和胞漿HO-1的表達(dá)被上調(diào)。連翹酯苷A組的Nrf2和HO-1的表達(dá)較模型組進(jìn)一步增強(qiáng)(圖7)。

連翹，活性成分從連翹風(fēng)干水果中分離，已報(bào)道具有抗炎，抗氧化，和抗氧化活性。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A對(duì)脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/GalN)誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果表明，連翹酯苷A可以減輕LPS/GalN誘導(dǎo)的肝臟病理損傷，MDA含量，血清ALT，AST和水平。此外，連翹酯苷A抑制NF-κB活性，可以降低LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠血清和肝組織TNF-α水平。此外，連翹酯苷A可以上調(diào)肝臟Nrf2和血紅素加氧酶-1的表達(dá)。連翹酯苷A可能是一個(gè)有希望的治療急性肝損傷的潛在治療劑。血清ALT和AST用作肝損傷的生化指標(biāo)。在本發(fā)明中，血清ALT，AST和肝組織的組織學(xué)分析被用來評(píng)估連翹酯苷A對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，連翹酯苷A顯著降低血清ALT和AST水平。同時(shí)，組織學(xué)分析表明，連翹酯苷A可以減輕細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤，顯著減輕肝損傷。這些結(jié)果表明，連翹酯苷A對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用。TNF-α已被證明在肝損傷的發(fā)病中起重要作用。它可引起肝細(xì)胞壞死和器官功能衰竭并有助于肝損傷的嚴(yán)重程度。同時(shí)，TNF-α可以誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子增強(qiáng)和延續(xù)了炎癥反應(yīng)。此外，以往的報(bào)告表明，抑制TNF-α可以減輕肝損傷。因此，在本發(fā)明中對(duì)血清和肝臟中TNF-α的水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，連翹酯苷A大幅抑制血清和肝臟中TNF-α水平。丙二醛，是脂質(zhì)過氧化的最后產(chǎn)物，被用作氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。結(jié)果表明，連翹酯苷A顯著抑制降低LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠肝MDA水平。結(jié)果表明，連翹酯苷A通過減少炎癥和氧化應(yīng)激來減輕LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷。NF-κB是各種參與炎癥反應(yīng)基因的多效性調(diào)節(jié)劑。通常情況下，NF-κB被一類稱為NF-κB抑制劑(IκBs)家族的抑制蛋白隔離在細(xì)胞質(zhì)中。一旦用LPS刺激，IκBs被磷酸化和降解，導(dǎo)致游離NF-κB的釋放。然后NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。通過觀察連翹酯苷A對(duì)NF-κB活性及IκB-α降解的影響，可以明確連翹酯苷A對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制效果。結(jié)果表明，連翹酯苷A可以抑制NF-κB活化，并具有劑量依賴性。Nrf2是通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，在細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中起重要作用的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2的控制重要的抗氧化和解毒基因，如HO-1的協(xié)同表達(dá)。已經(jīng)報(bào)道，HO-1在機(jī)體分布廣泛，是一種具有抗氧化活性和氧化還原敏感性的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白。結(jié)果表明，在LPS/GalN注射1小時(shí)后，肝組織細(xì)胞核中的Nrf2和細(xì)胞質(zhì)中HO-1的表達(dá)均上調(diào)。然而，連翹酯苷A的Nrf2和HO-1表達(dá)進(jìn)一步增加。結(jié)果表明，連翹酯苷A可以通過誘導(dǎo)氧化防御系統(tǒng)能力增強(qiáng)來降低LPS/GalN誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。同時(shí)，先前的研究提示有Nrf2的和NF-κB之間具有相互作用。Nrf2的激活能抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑；Nrf2的缺陷的小鼠增加LPS刺激可導(dǎo)致NF-κB活化的增加。因此，連翹酯A中抑制NF-κB活化的機(jī)制可能是由于其增強(qiáng)Nrf2的活化。

總之，本發(fā)明的結(jié)果表明，連翹酯苷A對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用。達(dá)到這種保護(hù)作用的機(jī)制可能與其抑制NF-κB激活和激活Nrf2的作用有關(guān)。連翹酯苷A是可以預(yù)防和治療LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷的藥物。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。