本發(fā)明屬于醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
厭氧菌(anaerobic bacteria)是一類在無氧條件下比在有氧環(huán)境中生長好，而不能在空氣(18％氧氣)和(或)10％二氧化碳濃度下的固體培養(yǎng)基表面生長的細(xì)菌。這類細(xì)菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無氧發(fā)酵的方式進(jìn)行。
厭氧菌包括以下幾類：
1、革蘭氏陽性厭氧球菌(Gram-positive anaerobic cocci，GPAC)
包括消化鏈球菌(Peptostreptococcus)，微單胞菌(Finegoldia)，厭氧球菌(Anaerococcus)，嗜胨菌(Peptoniphilus)，韋永氏球菌(Veillonella)等，是人口腔、上呼吸道、胃腸道和女性生殖泌尿系統(tǒng)微生物菌群的一部分，為條件致病菌，可造成非人體各部分不同程度的感染(占全部厭氧菌感染的25-30％)，包括輕微皮膚化膿或嚴(yán)重的腦及硬膜外膿腫，菌血癥，心內(nèi)膜炎，壞死性肺炎和濃毒性流產(chǎn)。GPAC造成的的胸膜/肺部感染達(dá)40％，在其造成的嚴(yán)重傷口感染中，死亡率可高達(dá)75％。GAPC還可造成眼、五官及頭，頸感染，腦膜炎，心周炎，股和關(guān)節(jié)(包括人工關(guān)節(jié))感染，乳房膿腫，尿道感染等。
2、革蘭氏陰性厭氧球菌(Gram-negative anaerobic cocci，GNPC)
GNPC是人口腔，生殖泌尿道，呼吸道及腸道正常菌群之一，臨床樣本中比重很低，但有增加趨勢(shì)。
3、非孢子形成革蘭氏陽性厭氧桿菌(Non-spore-forming anaerobic Gram-positive rods)
包括丙酸桿菌(Propionibacterium)，乳酸桿菌(Lactobacillus)，放線菌(Actinomyces)，真細(xì)菌(Eubacterium)，埃格特菌(Eggerthella)，阿托波菌(Atopobium)，雙歧桿菌(Bifidobactrium)，動(dòng)彎桿菌(Mobiluncus)等。多為與粘膜相關(guān)的復(fù)合型感染，口腔和糞便是主要感染源。術(shù)后死亡率和發(fā)病率的重要原因。
4、革蘭氏陰性厭氧桿菌(Anaerobic Gram-negative rods)
包括擬桿菌(Bacteroides)，卟啉單胞菌(Porphyromonas)，普雷沃菌(Prevotella)，梭形桿菌(Fusobacterium)等，主要寄生于人口腔、胃腸道及陰道粘膜，感染一般由于粘膜受損引起，例如陰道炎和牙周炎。
5、孢子形成革蘭氏陽性厭氧桿菌(Spore-forming Gram-positive rods)
包括梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)，可造成梭狀芽胞桿菌菌血癥，食物中毒，壞死性腸炎，醫(yī)源性腹瀉(CDI)，抗菌素相關(guān)偽膜性結(jié)腸炎，皮膚及軟組織感染等。
細(xì)菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)是育齡期女性常見的下生殖道感染性疾病，是由于正常陰道微生態(tài)菌群構(gòu)成發(fā)生變化引起的一種無陰道粘膜炎癥表現(xiàn)的綜合征。全世界每年約有數(shù)百萬女性罹患細(xì)菌性陰道病，嚴(yán)重影響了女性生殖健康。BV可引發(fā)不良妊娠結(jié)局，如自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、羊水感染、產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎和剖腹產(chǎn)切口感染及圍產(chǎn)兒并發(fā)癥等。此外，BV的復(fù)發(fā)和持續(xù)感染還能增加滴蟲陰道炎、外陰陰道假絲酵母菌病、宮頸癌和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的風(fēng)險(xiǎn)。
陰道加德納菌(Gardnerella Vaginalis，GV)是BV的主要致病原因之一，甲硝唑仍是目前BV臨床常規(guī)治療的一線用藥，雖然對(duì)BV的短期治愈率可以到達(dá)70％～80％，而3個(gè)月內(nèi)的復(fù)發(fā)率卻可高達(dá)58％。GV的甲硝唑耐藥菌株的存在和生物膜的形成可能是BV復(fù)發(fā)與治療失敗的重要原因。有研究表明生物膜中的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的反應(yīng)與其浮游生長方式存在顯著差異，可能與細(xì)菌在生物膜中的生長狀態(tài)和生物膜降低了抗菌藥物的穿透力有關(guān)。因此，加德納菌生成的生物膜結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)是BV復(fù)發(fā)與耐藥研究的新熱點(diǎn)。
目前，中國專利ZL200580031655.4“治療微生物感染的利福霉素衍生物”公開了化合物(R)-3-[(4-{1-[1-(3-羧基-1-環(huán)丙基-7-氟-9-甲基-4-氧代-4H-喹嗪-8-基)-吡咯烷-3-基-環(huán)丙基]-甲氨基}-哌啶-1-基亞氨基)-亞甲基]-利福霉素SV，該化合物對(duì)革蘭氏陽性菌和大腸埃希桿菌等多種細(xì)菌具有抗微生物活性，但并沒有文獻(xiàn)記載其對(duì)厭氧菌群具有抗菌活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子的新應(yīng)用，能夠有效抑制厭氧菌群，能夠用于治療細(xì)菌性陰道病。
本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：
一種式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子在抑制厭氧菌中的應(yīng)用；
式Ⅰ。
優(yōu)選的，上述的應(yīng)用中，所述厭氧菌群包括內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii)、普氏厭氧球菌(Anaerococcus prevotii)、阿托波陰道菌(Atopobium vaginae)、脆弱類擬桿菌(Bacteroides fragilis)(包括甲硝唑耐藥型)、多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)(包括甲硝唑耐藥型)、纖維擬桿菌(Bacteroides gracilis)、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis)、普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)、卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)(包括甲硝唑耐藥型)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌(Clostridium sporogenes)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridium perfringens)(包括甲硝唑耐藥型)、直腸真桿菌(Eubacterium rectale)、核粒梭形桿菌(Fusobacterium nucleatum)、陰道加德納菌(Gardnerella vaginalis)、卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)、柯氏動(dòng)彎桿菌(Mobiluncus(curtisii subsp.curtisii))、羞怯動(dòng)彎桿菌(Mobiluncus mulieris)、消化球菌(Peptococcus)、不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)(包括甲硝唑耐藥型)、大消化鏈球菌(Peptostreptococcus)、厭氧消化鏈球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、二路普雷沃菌(Prevotella bivia)(包括甲硝唑耐藥型)、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)、中間普雷沃菌(Prevotella intermedia)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)和小韋永氏球菌(Veionella parvula)中的一種或多種的組合。
本發(fā)明還提供上述的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子在作為制備治療由厭氧菌群失調(diào)引起的細(xì)菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)的藥物中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，上述的應(yīng)用中，所述利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子的人體有效劑量為每天10毫克至10克，治療周期為1-15天。
優(yōu)選的，上述的應(yīng)用中，所述應(yīng)用采用的給藥方式包括注射給藥、口服給藥、腔內(nèi)給藥、腸內(nèi)給藥和透皮吸收中的一種或幾種的組合。
優(yōu)選的，上述的應(yīng)用中，所述應(yīng)用所采用的給藥劑型包括注射劑、栓劑、片劑、膠囊劑、貼劑和緩釋劑中的一種或幾種的組合。
本發(fā)明的突出效果為：本發(fā)明式Ⅰ的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子具有廣譜抗菌活性，包括對(duì)絕大多數(shù)陰道致病菌在內(nèi)的厭氧菌具有活性，其體外抗菌活性強(qiáng)于甲硝唑和克林霉素等一線抗BV藥物，對(duì)厭氧菌引起的細(xì)菌性陰道病及其他相關(guān)疾病的預(yù)防與治療方面具有很好的應(yīng)用前景。
以下便結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子在抑制厭氧菌中的應(yīng)用；
其中，厭氧菌包括內(nèi)氏放線菌、普氏厭氧球菌、阿托波陰道菌、脆弱類擬桿菌(包括甲硝唑耐藥型)、多形擬桿菌(包括甲硝唑耐藥型)、纖維擬桿菌、單形擬桿菌、普通擬桿菌、卵形擬桿菌(包括甲硝唑耐藥型)、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(包括甲硝唑耐藥型)、直腸真桿菌、核粒梭形桿菌、陰道加德納菌、卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌、柯氏動(dòng)彎桿菌、羞怯動(dòng)彎桿菌、消化球菌(尼日爾)、不解糖嗜胨菌(包括甲硝唑耐藥型)、大消化鏈球菌、厭氧消化鏈球菌、二路普雷沃菌(包括甲硝唑耐藥型)、解糖胨普雷沃菌、中間普雷沃菌、齒垢密螺旋體和小韋永氏球菌中的一種或多種的組合。
本實(shí)施例中，式Ⅰ所示的的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子對(duì)細(xì)菌性陰道病相關(guān)的病原菌做了檢測實(shí)驗(yàn)，病原菌包括上述的厭氧菌。測試均使用與臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI；1-3)的指南一致的瓊脂稀釋法。測試均在無氧條件下進(jìn)行。對(duì)照組化合物為甲硝唑，利褔平和克林霉素。
材料和方法
測試化合物
由丹諾醫(yī)藥有限公司提供，檢測前在-20攝氏度保存。三種對(duì)照藥物由Sigma提供。所有母液在自動(dòng)除菌前均放置至少1小時(shí)。
測試菌株
檢測的臨床分離株或?yàn)閬碜悦绹鴺?biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)的參照菌。收到菌株后，將它們分別接種與合適的瓊脂板上并置于優(yōu)化的條件下生長。將長出的克隆在含有冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)液中制成細(xì)菌懸浮液，分裝后在-80攝氏度冷凍保存。測試前，將冷凍的細(xì)菌接種到合適的瓊脂皿并培養(yǎng)生長。厭氧菌于在測試前于Bactron II無氧柜(Shel Lab，Cornelius，OR)中35攝氏度生長48小時(shí)。
測試培養(yǎng)基
用于厭氧瓊脂稀釋法藥敏檢測的培養(yǎng)基是補(bǔ)充Brucella瓊脂(SBA)，由含有5微克/毫升的血晶素(BD/BBL；貨號(hào)：5300551)，1微克/毫升的維生素K1(Sigma，St.Louis，MO；貨號(hào)SLBC4685V)和5％的色淀綿羊血(Cleveland Scientific，Bath，OH，貨號(hào)291958)的Brucella瓊脂。
以上所有培養(yǎng)基的制備和儲(chǔ)存均按照CLSI(1-3)進(jìn)行。
瓊脂稀釋法測定最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentrations,MIC)
應(yīng)用CLSI中的瓊脂稀釋法(1-2)確定除嗜血桿菌屬外的所有微生物的MIC值。按照CLSI指南(1-2)手工進(jìn)行藥物稀釋和制備含藥物的瓊脂板。為使瓊脂表面干燥，將多孔板在室溫放置1小時(shí)。將用于厭氧條件下測試的瓊脂板在無氧柜中預(yù)置約1小時(shí)。用比濁計(jì)(Dade Behring MicroScan，Wet Sacramento，CA)把每一分離株在合適的培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)至0.5麥克法蘭氏濁度標(biāo)準(zhǔn)。然后用不銹鋼復(fù)制器將每個(gè)細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)移到檢測板的孔中。大約含10(5)/1-2微升的細(xì)菌接種到每孔的瓊脂表面，干燥后將藥物板和無藥對(duì)照板放入無氧柜中厭氧環(huán)境35攝氏度哺育42-48小時(shí)。培養(yǎng)后按照CLSI指南確定MIC(1-2)。
測試結(jié)果如下表1所示。
表1
由上述測試結(jié)果可見，利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子(式Ⅰ)除對(duì)少數(shù)菌株外，對(duì)絕大部分厭氧菌的體外抑菌活性(MIC)高于甲硝唑，對(duì)一些菌株抗菌活性高達(dá)甲硝唑的100倍以上。對(duì)于常見BV優(yōu)勢(shì)菌如陰道加德納菌，普雷沃菌，動(dòng)彎桿菌，阿托波陰道菌和消化鏈球菌具有相同或更強(qiáng)的的抑菌活性。從利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子(式Ⅰ)的廣譜抗厭氧菌活性可以預(yù)測其對(duì)顯示活性的其它種細(xì)菌造成的感染也會(huì)有好的治療作用。
根據(jù)利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子(式Ⅰ)的體外抗菌活性推測，其有效劑量為甲硝唑有效劑量的1/100，相當(dāng)于10毫克，為了進(jìn)一步改進(jìn)療效，可以進(jìn)一步增加劑量至10克，以達(dá)到其最高有效劑量。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子的一種快速釋放口服制劑的處方和制備方法。
按上述處方量稱取式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子和輔料。將聚維酮K30(PVP K30)和十二烷基硫酸鈉(SDS)，溶解于純化水中，攪拌1小時(shí)，作為黏合劑備用；將式Ⅰ所示化合物、甘露醇和羧甲淀粉鈉(DST)過30目篩，加入制粒機(jī)中，預(yù)混，葉輪攪拌速度700rpm，時(shí)間約15分鐘。再用蠕動(dòng)泵以固定的速度(145-165g/分鐘)加適量的純化水和黏合劑到制粒機(jī)混合物中，制粒機(jī)葉輪攪拌速度400rpm，時(shí)間約1～2分鐘，黏合劑加入完畢后，繼續(xù)混合0.5～1分鐘；采用流化床對(duì)濕顆粒進(jìn)行干燥，設(shè)進(jìn)風(fēng)溫度為60℃，進(jìn)風(fēng)量40m3/h；根據(jù)干燥后的干顆粒物料的重量計(jì)算應(yīng)添加二氧化硅和硬脂酸鎂，先將二氧化硅與干顆粒置料斗混合器中進(jìn)行混合，混合時(shí)間15分鐘；轉(zhuǎn)速20rpm；再加入硬脂酸鎂，混合時(shí)間6分鐘，混合速度為20rpm，取總混后的物料測采用膠囊灌裝機(jī)充填0號(hào)膠囊，即得式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子硬膠囊劑。
將總混后的物料采用壓片機(jī)壓片，即得式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子片劑。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子的一種注射劑制備方法。
在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將甘露醇、乙醛次硫酸鈉、吐溫-80加入適量注射用水中，加入式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子，中速攪拌10-15分鐘，濕潤式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子，1N NaOH緩慢滴加，耗時(shí)約175分鐘(前快后慢)，至式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子全部溶解，0.45+0.22μm兩道微孔濾膜過濾，濾液灌裝至10mL玻璃瓶中，每瓶裝3.5mL，玻璃瓶轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)中進(jìn)行凍干，扎蓋后即得式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子的凍干粉針劑。
實(shí)施例4
本實(shí)施例提供式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子的一種外用凝膠劑制備方法。
將卡波姆用適量乙醇潤濕，攪拌下用純化水稀釋到大約1600mL，煮沸，繼續(xù)攪拌使其呈透明狀凝膠液，放涼。再取式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子、天然冰片和香精，用乙醇溶解與表面活性劑一起加入凝膠透明液中，再用純化水定容至2000mL，攪拌均勻，放置12小時(shí)以上，常壓脫泡，經(jīng)檢驗(yàn)后分裝即得式Ⅰ所示的利福霉素-喹嗪酮雙靶標(biāo)分子外用凝膠劑。