本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及纖維化疾病防治領(lǐng)域，具體涉及多肽及其衍生物在制備預(yù)防和/或治療纖維化疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是機(jī)體的物質(zhì)基礎(chǔ)、生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，涉及生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、新陳代謝等生理過程。蛋白質(zhì)及其參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是疾病的發(fā)生和發(fā)展的根本原因，利用機(jī)體自身調(diào)控來進(jìn)行疾病防治是生物醫(yī)藥的本質(zhì)思想，因此，蛋白質(zhì)既是藥物靶點(diǎn)的來源，也是生物醫(yī)藥的重要類別，而蛋白質(zhì)功能片段則為精準(zhǔn)用藥提供了保障。多肽就是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的活性片段，當(dāng)研究發(fā)現(xiàn)多肽片段活性與疾病發(fā)生相關(guān)聯(lián)時(shí)，這些活性多肽便可用于開發(fā)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的藥物。對(duì)蛋白質(zhì)功能片段的研究為疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)，也為基于蛋白質(zhì)功能片段的多肽藥物研發(fā)提供了更廣闊的發(fā)展空間。

多肽藥物在藥物研發(fā)領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)勢(shì)：與一般有機(jī)小分子藥物相比，多肽藥物具有活性高、用藥劑量小、毒副作用低等突出優(yōu)點(diǎn)；而與蛋白質(zhì)藥物相比，較小的多肽免疫原性相對(duì)較小，可化學(xué)合成，產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控。目前的多肽藥物多數(shù)源于或模擬內(nèi)源性肽或其他天然肽，其結(jié)構(gòu)清楚，作用機(jī)制明確，代謝產(chǎn)物氨基酸為機(jī)體基本組分，不會(huì)蓄積體內(nèi)，毒副作用低。目前隨著多肽合成技術(shù)的發(fā)展，多肽的生產(chǎn)、工藝和純度問題已有效解決，另外可通過進(jìn)一步研究活性多肽的構(gòu)效關(guān)系，發(fā)掘多肽發(fā)揮生物活性所必需的最短片段，以便以更短的多肽來代替；或者使用氨基酸替換提高其生物活性或改變其臨床不良反應(yīng)，使得小片段多肽具有更好的生物相容性，減少臨床不良反應(yīng)，可通過替換肽鏈中易酶解的氨基酸來延緩酶降解速度，使多肽藥物的半衰期有效延長(zhǎng)。

但多肽本身仍存在一些缺點(diǎn)，如多肽易被酶解，半衰期短，生物利用度低等。為解決多肽在制備藥物應(yīng)用中的問題，除了改變多肽藥物給藥途徑，化學(xué)修飾成為多肽藥物研發(fā)中非常重要的研究方向，是延長(zhǎng)蛋白質(zhì)多肽類分子半衰期、實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效化的重要技術(shù)手段之一。根據(jù)多肽藥物的特點(diǎn)，運(yùn)用多種手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和化學(xué)修飾，對(duì)多肽藥物本身的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，利用合適的修飾方法和修飾劑對(duì)蛋白質(zhì)多肽類藥物的主鏈結(jié)構(gòu)或?qū)?cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，可改變其分子大小，電荷和受體結(jié)合能力，提高脂溶性，同時(shí)通過修飾基團(tuán)形成的空間位阻保護(hù)易受蛋白水解酶進(jìn)攻的區(qū)域，延緩活性蛋白的降解，提高藥物的穩(wěn)定性，最終改變多肽的理化性質(zhì)和藥代動(dòng)力學(xué)，充分發(fā)揮多肽藥物的優(yōu)點(diǎn)，克服甚至避免其缺點(diǎn)。

目前已知的多肽修飾方法包括乙?；揎棧０坊揎?，糖基化修飾，聚乙二醇（PEG）修飾，脂肪酸修飾，磷酸化修飾等。多肽類藥物常用主鏈末端修飾方法是氨基（N）端乙?；汪然–）端的酰胺化修飾，分別對(duì)肽鏈兩端氨基和羧基進(jìn)行保護(hù)，其基本原理都是增加多肽分子的相對(duì)分子量和空間位阻，延續(xù)或抑制多肽水解酶的作用，提高多肽藥物穩(wěn)定性，減少腎小球的濾過作用。糖基化修飾是將單糖、寡糖或多糖結(jié)構(gòu)與多肽鏈中某些特殊氨基酸側(cè)鏈上的功能團(tuán)以共價(jià)鍵形式相連，如N-糖基化是通過天冬酰胺使側(cè)鏈的酰胺氮進(jìn)行連接，O-糖基化是與絲氨酸或蘇氨酸殘基上的氧相連。糖基化能夠增加側(cè)鏈空間位阻，提高多肽對(duì)酶的穩(wěn)定性。如用于治療慢性腎功能衰竭及貧血的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素（EPO），糖基化修飾后的EPO使用頻率可由每周2-3次，降低至每周1次或每2周1次。PEG修飾是利用不同的PEG修飾劑與多肽主鏈或側(cè)鏈的氨基、羧基，側(cè)鏈的咪唑基、巰基或羥基等功能基團(tuán)共價(jià)連接得到修飾產(chǎn)物。PEG本身是由環(huán)氧乙烷聚合的大分子聚合物，有不同的結(jié)構(gòu)和不同的分子量，可以在體內(nèi)降解，無毒、無抗原性，并有較高的親水性和生物相容性、寬泛的相對(duì)分子選擇范圍等優(yōu)點(diǎn)。PEG修飾后的多肽藥物溶解度顯著增高，體內(nèi)釋放緩慢，半衰期延長(zhǎng)，并且能夠形成空間位阻，降低免疫反應(yīng)，抑制蛋白酶解。PEG是目前最常用的修飾劑，在研或上市的PEG修飾蛋白或多肽藥物種類較其它修飾方法更多，世界上第1個(gè)PEG修飾的蛋白藥物PEG-腺苷脫氨酶在1991年獲FDA批準(zhǔn)上市，另外還有PEG修飾的天冬酰胺酶、集落刺激生長(zhǎng)因子、干擾素α等。脂肪酸修飾是將脂肪酸結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)多肽分子中的某些特殊官能團(tuán)以共價(jià)連接，包括氨基、羧基、巰基和羥基等的修飾。脂肪酸是構(gòu)成胞膜磷脂及人體脂肪與類脂的成分，因此脂肪酸修飾能夠有效提高多肽藥物脂溶性與吸收，封閉多肽分子易受酶降解的區(qū)域，延緩或抑制蛋白酶解；脂肪酸還能夠增強(qiáng)多肽藥物與血漿白蛋白的結(jié)合，形成較大的復(fù)合物，以延長(zhǎng)藥物的在體內(nèi)滯留時(shí)間。上市的脂肪酸修飾多肽藥物如用于治療2型糖尿病的利拉魯肽（Liraglutide，諾和諾德），利拉魯肽將人GLP-1第34位的賴氨酸（Lys）替換為精氨酸（Arg），并在26位Lys上又引入一個(gè)由谷氨酸（Glu）介導(dǎo)的16碳棕櫚酸側(cè)鏈，使GLP-1的不良反應(yīng)顯著減少，但完全保留了其生物活性。

在實(shí)際的臨床應(yīng)用中，通過以上所述化學(xué)修飾的多肽藥物已經(jīng)顯示具有明顯良好的優(yōu)勢(shì)，能夠顯著延長(zhǎng)多肽藥物的半衰期，提高藥物療效，降低給藥頻率，從而帶來良好的治療依從性。未來多肽修飾種類和修飾方法仍會(huì)不斷發(fā)展和成熟，其最終目的都是使多肽藥物能夠從實(shí)驗(yàn)室研究走向安全有效的臨床應(yīng)用。

本發(fā)明基于生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的多肽藥物技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)機(jī)制復(fù)雜、治療困難的纖維化疾病，提供了一類經(jīng)化學(xué)修飾后的多肽衍生物在制備預(yù)防和治療纖維化疾病藥物中的應(yīng)用。

纖維化是在損傷部位或炎癥病灶及周邊，由膠原和粘連蛋白等胞外基質(zhì)增加所導(dǎo)致的纖維結(jié)締組織過度沉積和重塑紊亂，會(huì)造成永久性瘢痕、器官功能障礙甚至死亡。纖維化與多種疾病發(fā)生密切相關(guān)，這種臨床常見的病理改變，是普遍的慢性炎癥疾病的最終病理結(jié)局，也是慢性自身免疫病的主要病理癥狀，同時(shí)能夠影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和慢性移植物排斥反應(yīng)。纖維化可發(fā)生于多種組織器官，尤其是重要功能臟器（肝，肺，腎和心臟等），常常呈不可逆地進(jìn)行性加重，嚴(yán)重破壞器官結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致器官功能減退及至衰竭，進(jìn)而極大降低病患生活質(zhì)量，嚴(yán)重威脅人類生命健康。統(tǒng)計(jì)資料顯示，因各類疾病死亡的人群中，45%可歸于纖維化。

盡管纖維化疾病發(fā)病率和死亡率居高不下，但目前針對(duì)纖維化疾病大多集中在預(yù)防、器官移植等非藥物治療，其它藥物輔助治療，甚至姑息治療，纖維化疾病可選擇的特效治療藥物極少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床上真正有效和安全的需求。如：馬凡綜合征（Marfan syndrome），一種由常染色體上編碼糖蛋白微纖蛋白（FBN1）基因突變引起的遺傳性結(jié)締組織疾病，患者四肢細(xì)長(zhǎng)不均勻，并伴有心血管系統(tǒng)異常，同時(shí)累及骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚和眼部等重要組織器官，多數(shù)病人死于主動(dòng)脈瘤破裂和心力衰竭，只能存活至中年，但目前全球范圍內(nèi)尚無可用于治療馬凡綜合征的藥物。

另外一種臨床上以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征，并累及心、肺、腎、消化道等內(nèi)臟器官的結(jié)締組織病，被稱作系統(tǒng)性硬化癥（Systemic scleroderma，SSc）。據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，全球大約有200萬例系統(tǒng)性硬化癥患者，常呈緩慢發(fā)展，預(yù)后不良，高達(dá)90%患者可能有不同程度的肺部疤痕，約占死亡病例的35%。目前全球范圍內(nèi)僅有一個(gè)治療藥物：尼達(dá)尼布（Nintedanib，勃林格殷格翰），該藥物于2016年通過歐盟委員會(huì)和美國(guó)FDA的孤兒藥認(rèn)證的快速通道獲批，只對(duì)癥治療系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)間質(zhì)性肺病（SSc-ILD），其上市后的臨床治療效果還有待評(píng)價(jià)。而系統(tǒng)性硬化癥是尼達(dá)尼布發(fā)展的新適應(yīng)癥，最初尼達(dá)尼布是用于治療一種最為嚴(yán)重的肺部纖維化疾病：特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的藥物。

特發(fā)性肺纖維化，是一種未知原因的慢性、進(jìn)行性、纖維化性的間質(zhì)性肺疾病，被稱為類腫瘤疾病，并常常伴有急性加重，診斷后的平均生存期僅2.8年，死亡率高于除肺癌之外的全部腫瘤疾病。目前全球范圍內(nèi)治療特發(fā)性肺纖維化的藥物只有吡非尼酮（Pirfenidone，羅氏）和尼達(dá)尼布，是2014年FDA經(jīng)快速審批通道進(jìn)入市場(chǎng)的孤兒藥，也是2015年美國(guó)胸科協(xié)會(huì)/歐洲呼吸協(xié)會(huì)/日本胸科協(xié)會(huì)/拉丁美洲胸科協(xié)會(huì)聯(lián)合發(fā)布的《特發(fā)性肺纖維化臨床治療推薦指南》中推薦等級(jí)最高（條件推薦）的兩大藥物。其中吡非尼酮是一個(gè)抗纖維化、抗炎和抗氧化性的化合物，其確切的作用機(jī)制尚未完全清楚。尼達(dá)尼布是一種多重酪氨酸激酶抑制劑，作用于調(diào)控纖維化信號(hào)通路中的三個(gè)重要細(xì)胞因子受體：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）、血小板源生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR），尼達(dá)尼布能夠與受體上的ATP結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，阻止受體的磷酸化激活，從而阻斷其介導(dǎo)的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。吡非尼酮和尼達(dá)尼布的出現(xiàn)填補(bǔ)了肺纖維化治療領(lǐng)域的空白，但是Global Data分析（2016年）認(rèn)為，這兩個(gè)藥物僅用于延緩病患肺功能下降的速度，不是有效中止肺部病變進(jìn)程的藥物，臨床研究結(jié)果也顯示對(duì)死亡率并沒有很好的改善，遠(yuǎn)不滿足肺纖維化治療的需求。另外，由于兩個(gè)藥物均是小分子化合物，不適于孕婦或伴有肝臟問題的患者群體使用，需要較大口服劑量才能實(shí)現(xiàn)有效的肺部藥物濃度，并有明顯的不良胃腸道反應(yīng)，吡非尼酮還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的光敏反應(yīng)和皮疹，在臨床使用時(shí)，病人用藥依從性較差。

除上述三種適應(yīng)癥，纖維化疾病還涉及其它重要器官如肝，腎，心和眼部等，纖維化疾病患者往往出現(xiàn)器官組織受累，在無有效延緩或阻斷纖維化病變進(jìn)程的藥物時(shí)，最終治療選項(xiàng)局限于供體困難且風(fēng)險(xiǎn)較高的器官移植，治療昂貴，也帶來極重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而已有藥物的臨床治療效果和安全性無法滿足治療需求，未來纖維化疾病確診病例仍會(huì)增加，因此，亟需深入研究纖維化疾病發(fā)生機(jī)制，充分結(jié)合創(chuàng)新的醫(yī)藥發(fā)展趨勢(shì)，開發(fā)新的能夠有效阻斷纖維化疾病且臨床使用安全的治療藥物。

纖維化是由反復(fù)損傷或較大損傷導(dǎo)致炎癥而逐漸向纖維化發(fā)展的病理過程，發(fā)病機(jī)制可大致分為三個(gè)階段：第一階段是損傷期和止血期，由感染、毒素、藥物、外傷等引起上皮或內(nèi)皮細(xì)胞損傷，觸發(fā)凝血反應(yīng)，循環(huán)血液中的血小板接觸損傷血管暴露的膠原纖維而被激活，釋放血小板因子，形成纖維蛋白凝塊確保快速止血；激活的血小板同時(shí)釋放多種細(xì)胞因子，如血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF），趨化因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）。第二階段為炎癥和增殖期，即再生階段，在趨化因子介導(dǎo)下炎性細(xì)胞向損傷部位趨化并聚集，骨髓干細(xì)胞活化為巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞因子（如IL-13、IL-17、TGF-β等）促進(jìn)免疫修復(fù)和炎癥反應(yīng)；上皮和先天免疫細(xì)胞來源的細(xì)胞因子能夠激活特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥和免疫修復(fù)。炎癥和免疫介質(zhì)（細(xì)胞因子、趨化因子、自由基等）激活靜止的成纖維細(xì)胞，刺激胞外基質(zhì)的膠原合成，促進(jìn)其分化為肌成纖維細(xì)胞。第三階段為成熟期，即組織重構(gòu)或纖維化，正常情況是最終血管生成，創(chuàng)口收縮，組織再生，但當(dāng)有害刺激持續(xù)存在，炎癥反應(yīng)和慢性愈合反應(yīng)加劇，反復(fù)進(jìn)行組織損傷—修復(fù)—再生反應(yīng)，肌成纖維細(xì)胞持續(xù)被激活，分泌更多胞外基質(zhì)并發(fā)生沉積，最終導(dǎo)致組織增厚和重塑紊亂，形成纖維化。

纖維化發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答和纖維化發(fā)生相關(guān)的多種細(xì)胞因子及其介導(dǎo)的信號(hào)通路。發(fā)揮主要功能的細(xì)胞因子包括IL-1β，TNF-α，IL-13，PDGF和TGF-β等。其中，IL-1β能夠通過與胞外基質(zhì)結(jié)合激活TGF-β前體而間接促進(jìn)或直接調(diào)控胞外膠原合成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，還可通過FAK/rac1/NOX/ROS信號(hào)通路調(diào)控成纖維細(xì)胞中胞外基質(zhì)合成，與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CCN2結(jié)合促進(jìn)纖維化發(fā)生。TNF-α和IL-1β都是促進(jìn)炎癥調(diào)控因子，能夠加劇實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷，通過TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肌成纖維細(xì)胞激活。TNF-α和IL-1β也能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞中的自分泌生長(zhǎng)因子IL-6的活性。IL-13是2型輔助性T細(xì)胞（Th2細(xì)胞）分泌的細(xì)胞因子，能夠通過整合素β1，IL-6和趨化因子MCP-1促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，表達(dá)IL-13的Th2細(xì)胞還會(huì)刺激巨噬細(xì)胞分泌TGF-β前體，IL-13再通過金屬基質(zhì)蛋白酶和組織蛋白酶等相關(guān)蛋白酶水解途徑激活TGF-β。PDGF是成纖維細(xì)胞的有絲分裂原，通過刺激成纖維細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)變產(chǎn)生更多的肌成纖維細(xì)胞，同時(shí)刺激膠原合成。TGF-β能夠直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)膠原表達(dá)和沉積，而分泌胞外基質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞是所有纖維化疾病的最終結(jié)果。

以上所述細(xì)胞因子可由多種類型細(xì)胞分泌，或通過炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答間接調(diào)控，或直接激活TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)纖維化發(fā)生。因此，TGF-β被認(rèn)為是纖維化調(diào)控中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。已有大量報(bào)道證實(shí)纖維化疾病與細(xì)胞因子TGF-β及其下游信號(hào)通路的異常調(diào)控緊密相關(guān)，公開報(bào)道的與TGF-β信號(hào)通路相關(guān)的纖維化疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，肺纖維化，肝纖維化，肝硬化，腎纖維化，骨髓纖維化，囊性纖維化，心肌纖維化，硬皮病，結(jié)節(jié)病，瘢痕疙瘩，燒傷致增生性瘢痕，增生性視網(wǎng)膜病變，青光眼，白內(nèi)障，晶狀體后囊混濁，血管成形術(shù)、血管手術(shù)或血管損傷后血管再狹窄，馬凡綜合癥等。研究表明，在多種疾病動(dòng)物模型中，對(duì)TGF-β信號(hào)通路的抑制均能延緩纖維化進(jìn)程。

隨著近30年來對(duì)纖維化疾病相關(guān)機(jī)制的深入研究，基于纖維化發(fā)生涉及的多個(gè)細(xì)胞因子及其激活的胞內(nèi)信號(hào)通路的分子機(jī)制，這些通路中各主要節(jié)點(diǎn)成為目前全球范圍內(nèi)的在研防治纖維化藥物的主要靶點(diǎn)。由于纖維化涉及細(xì)胞因子眾多，尋找最有效的靶標(biāo)因子是治療纖維化疾病的關(guān)鍵，鑒于TGF-β信號(hào)通路在纖維化疾病中的重要作用，以TGF-β信號(hào)通路作為藥物靶點(diǎn)有望成為阻斷纖維化疾病的理想藥物。

哺乳動(dòng)物TGF-β包括三種亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是組織中含量最高，分布最廣的亞型，也是最主要促進(jìn)組織纖維化的因子。TGF-β1 在體內(nèi)是以無活性的前體蛋白（Pre-pro-TGF-β1）形式產(chǎn)生，只有經(jīng)過一系列酶解和構(gòu)象變化，才可釋放具有生物活性的TGF-β1，主要通過激活Smad家族蛋白的下游信號(hào)通路而促進(jìn)纖維化發(fā)生?；谄湫盘?hào)激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，應(yīng)用多肽合成技術(shù)制備或模擬TGF-β1發(fā)揮功能所需的關(guān)鍵序列，阻斷TGF-β1分泌、活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠從關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上阻抑最關(guān)鍵的纖維化調(diào)控信號(hào)通路，從而有效地抑制纖維化病理過程的發(fā)生發(fā)展。

已有研究表明實(shí)驗(yàn)條件下，多肽KRFK，CSVTCG，YRVRFLAKENVTQDAEDN和CNLAVAAASHIYQNQFVQ能夠抑制TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而延緩纖維化進(jìn)程。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，多肽存在溶解度低和穩(wěn)定性差的問題，極大影響多肽成藥性，在制備防治纖維化疾病藥物的應(yīng)用方面還需要在其理化性質(zhì)方面有較高的提升。本發(fā)明基于此，在其中一種多肽序列基礎(chǔ)上，進(jìn)行氨基酸刪除、替換、添加以發(fā)掘最有效的活性片段，并在此基礎(chǔ)上經(jīng)過化學(xué)修飾，提高多肽溶解度，增加多肽穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期，提高生物活性，降低毒副作用，以增強(qiáng)多肽藥物的成藥性，最終應(yīng)用于制備臨床安全有效的預(yù)防和治療纖維化疾病的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明針對(duì)目前缺乏臨床使用有效且安全的預(yù)防和治療纖維化疾病藥物的現(xiàn)狀，提供一類多肽片段，一類多肽片段的衍生物，一類多肽衍生物，及上述片段及其衍生物經(jīng)化學(xué)修飾改造后的多肽衍生物的在制備預(yù)防或治療纖維化疾病中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的多肽是指由氨基酸通過肽鍵相連構(gòu)成的一類化合物，是不限于氨基酸數(shù)目的產(chǎn)物。

本發(fā)明所述的多肽SEQ ID NO：1能夠抑制TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成降低，從而抑制炎癥和纖維化反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防和治療纖維化疾病的目的。

本發(fā)明所述的對(duì)多肽SEQ ID NO：1的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸缺失、添加、替換或修飾的目的是為了使其適于不偏離本發(fā)明在制備預(yù)防或治療纖維化疾病中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一類多肽片段是多肽SEQ ID NO：1的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸缺失后得到的多肽片段，其可以是在多肽SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基端、羧基端或者氨基酸序列內(nèi)部，分別進(jìn)行氨基酸缺失；也可以是在多肽SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基端和羧基端，同時(shí)進(jìn)行氨基酸缺失；也可以是在多肽SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基端和序列內(nèi)部，進(jìn)行氨基酸缺失；也可以是在多肽SEQ ID NO：1的氨基酸序列的羧基端和序列內(nèi)部，進(jìn)行氨基酸缺失；也可以是在多肽SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基端、羧基端和序列內(nèi)部，同時(shí)進(jìn)行氨基酸缺失。本發(fā)明所述的氨基酸缺失的數(shù)目在12個(gè)氨基酸以內(nèi)，包括12個(gè)氨基酸，多肽片段的氨基酸數(shù)目可以是6個(gè)至17個(gè)之內(nèi)的任一種，包括6個(gè)和17個(gè)。

本發(fā)明所述的一類多肽片段的衍生物是針對(duì)SEQ ID NO：1的多肽片段的氨基酸序列，進(jìn)行氨基酸替換或/和添加后產(chǎn)生的衍生物。本發(fā)明所述的一類多肽的衍生物是針對(duì)SEQ ID NO：1的氨基酸序列，進(jìn)行氨基酸替換或/和添加后產(chǎn)生的衍生物。

本發(fā)明所述的氨基酸替換是指使用其它構(gòu)象或其它種類的氨基酸取代SEQ ID NO：1的多肽片段或者SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的某個(gè)氨基酸。

本發(fā)明所述的氨基酸添加是指在SEQ ID NO：1的多肽片段或者SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的任意氨基酸位置加入氨基酸。

本發(fā)明所述的氨基酸替換和氨基酸添加可以分別進(jìn)行，也可以同時(shí)進(jìn)行，可以在同一氨基酸位置進(jìn)行，也可以在不同氨基酸位置進(jìn)行。

本發(fā)明所述的氨基酸位置是指在多肽的氨基酸序列中，由氨基端向羧基端依次排列的氨基酸所在的位置數(shù)，但氨基酸位置是相對(duì)的，當(dāng)氨基酸序列中進(jìn)行氨基酸缺失或添加時(shí)，氨基酸的位置可能發(fā)生變化，這種變化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

本發(fā)明所述的用于替換或/和添加的氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸，其中，天然氨基酸指自然界存在的氨基酸，非天然氨基酸包括D型氨基酸及其它人工合成的氨基酸。

本發(fā)明所述的一類多肽片段的衍生物中，其中進(jìn)行氨基酸替換得到的衍生物，可以替換的氨基酸數(shù)目是6個(gè)以內(nèi)，包括6個(gè)，其中進(jìn)行氨基酸添加得到的衍生物，可以添加的氨基酸數(shù)目是6個(gè)以內(nèi)，包括6個(gè)。

本發(fā)明提供的衍生物是指多肽的一種變型，在本發(fā)明中可以是對(duì)多肽序列進(jìn)行氨基酸替換或添加后的產(chǎn)物，也可以是在多肽分子主鏈或側(cè)鏈末端的氨基、羧基、巰基、酚羥基、咪唑基、胍基、吲哚基、甲硫基等作為修飾位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾后的產(chǎn)物。

本發(fā)明所述的化學(xué)修飾是在多肽水平上，使用合適的修飾方法和修飾劑對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾，使修飾后的多肽類藥物的溶解度提高，穩(wěn)定性增加，半衰期延長(zhǎng)，具體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)方式確定。所述的化學(xué)修飾能夠改變肽鏈的主鏈結(jié)構(gòu)或側(cè)鏈基團(tuán)，包括乙?；Ⅴ０坊?、糖基化、聚乙二醇（PEG）修飾、脂肪酸修飾及本領(lǐng)域已知的其它多肽修飾技術(shù)。

本發(fā)明所述的乙?；王０坊嵌嚯某Ｓ玫闹麈溎┒诵揎椃椒ǎǔＪ窃诙嚯闹麈淣端乙?；?，多肽主鏈C端酰胺化。

本發(fā)明所述的糖基化修飾是指將糖結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)多肽分子中某些特殊功能團(tuán)以共價(jià)鍵相連接，包括N-糖基化、O-糖基化、S-糖基化、C-糖基化以及糖基磷脂酰肌醇修飾等。所述的N-糖基化是通過天冬酰胺使側(cè)鏈的酰胺氮進(jìn)行連接，O-糖基化是與絲氨酸或蘇氨酸殘基上的氧相連。所述的糖結(jié)構(gòu)包括各種單糖、寡糖和多糖。

本發(fā)明所述的PEG修飾是指以多肽主鏈氨基、側(cè)鏈氨基、主鏈羧基、側(cè)鏈羧基、咪唑基、巰基及羥基等官能團(tuán)為修飾位點(diǎn)選擇相應(yīng)類型的PEG進(jìn)行修飾。所述的PEG是由環(huán)氧乙烷聚合的大分子聚合物，不限結(jié)構(gòu)，也不限分子量。所述PEG修飾類型包括直鏈PEG，支鏈PEG，同雙官能團(tuán)PEG衍生物，異官能團(tuán)雙取代PEG衍生物和多臂官能團(tuán)PEG衍生物等。

本發(fā)明所述的脂肪酸修飾是指將脂肪酸結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)多肽分子中的某些特殊官能團(tuán)以共價(jià)連接，包括氨基、羧基、巰基和羥基等的修飾。脂肪酸修飾可分為不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸修飾，飽和脂肪酸主要以肉豆蔻酸、棕櫚酸進(jìn)行修飾；不飽和脂肪酸修飾主要是以油酸、亞油酸等進(jìn)行修飾。

本發(fā)明所述的多肽修飾可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法。本發(fā)明所述的修飾目的是為了改變多肽序列的理化性質(zhì)，提高多肽的成藥性，但修飾后的多肽仍能夠抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本發(fā)明所述的抑制TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)是指在TGF-β信號(hào)通路激活的情況下，使用本發(fā)明所述的一類多肽片段，一類多肽片段的衍生物，一類多肽衍生物，及上述片段及其衍生物經(jīng)化學(xué)修飾改造后的多肽衍生物抑制TGF-β的活化，受體的磷酸化，TGF-β信號(hào)通路中蛋白不限形式的激活，以及下游調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)方式確定。

本發(fā)明所述的一類多肽片段，一類多肽片段的衍生物，一類多肽衍生物，及上述片段及其衍生物經(jīng)化學(xué)修飾改造后的多肽衍生物可作為活性成分制備預(yù)防或治療纖維化藥物。其中，所述的預(yù)防或治療纖維化藥物中包含預(yù)防或治療的安全和有效量的一類多肽片段，一類多肽片段的衍生物，一類多肽衍生物，及上述片段及其衍生物經(jīng)化學(xué)修飾改造后的多肽衍生物的一種或多種。預(yù)防或治療的安全和有效量是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，給予所需對(duì)象足以有效且可避免嚴(yán)重副作用的活性成分含量。雖然其安全和有效量隨如下因素變化：所選擇的多肽（例如，考慮多肽的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和半衰期）；選擇的給藥途徑；待治療的病癥及嚴(yán)重程度；待治療對(duì)象的年齡、體型、體重和身體狀況；待治療對(duì)象的病史；治療持續(xù)時(shí)間；期望的治療效果及類似因素，但可由本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)方式確定。

本發(fā)明所述“預(yù)防”是指在可能的促纖維因素的存在下，使用后防止或降低纖維化的產(chǎn)生。本發(fā)明所述“治療”是指降低纖維化的程度，或者治愈纖維化使之正常化，或者減緩纖維化的進(jìn)程。

本發(fā)明所提供的纖維化疾病是由于TGF-β細(xì)胞因子及其信號(hào)通路過度激活所導(dǎo)致的，本領(lǐng)域?qū)I(yè)研究結(jié)果公認(rèn)的纖維化疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，肺纖維化，肝纖維化，肝硬化，腎纖維化，骨髓纖維化，囊性纖維化，心肌纖維化，硬皮病，結(jié)節(jié)病，瘢痕疙瘩，燒傷致增生性瘢痕，增生性視網(wǎng)膜病變，青光眼，白內(nèi)障，晶狀體后囊混濁，血管成形術(shù)、血管手術(shù)或血管損傷后血管再狹窄，馬凡綜合癥等。

本發(fā)明所述的肺纖維化是以成纖維細(xì)胞增殖及大量胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變。肺組織中肺泡巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均廣泛表達(dá)TGF-β前體，在上皮細(xì)胞受損后TGF-β激活從促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終使胞外基質(zhì)異常增多而沉積，肺纖維化是正常的肺泡組織被損壞后經(jīng)異常修復(fù)導(dǎo)致的疤痕形成。本發(fā)明所述的肺纖維化可以為特發(fā)性肺纖維化，即原因不明的肺纖維化；也可以為繼發(fā)性的肺纖維化，既多種病因引起的肺纖維化，所述病因可以是職業(yè)性粉塵（SiO2等）、放射性損傷、自發(fā)免疫疾病、藥物副作用（博來霉素等）、慢性肺感染（肺結(jié)核）、急性肺損傷等。本發(fā)明所述的肺纖維化包括過敏性肺炎，放射性誘導(dǎo)的肺纖維化，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，特發(fā)性肺纖維化，矽肺，石棉肺和肺結(jié)核。所述肺纖維化可以表現(xiàn)為肺部炎癥尤其是間質(zhì)性肺炎、肺功能退化和肺實(shí)變（如肺間質(zhì)形成大量纖維結(jié)締組織和肺結(jié)構(gòu)紊亂）中的一種或多種。

本發(fā)明所述的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性的，以滑膜炎為主的炎癥性疾病，常伴有關(guān)節(jié)外器官受累，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失。滑膜組織中有大量過度表達(dá)和激活的細(xì)胞因子，其中TGF-β在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生前異常激活，招募間充質(zhì)干細(xì)胞至軟骨下骨骨髓，導(dǎo)致破骨細(xì)胞骨吸收和未偶聯(lián)骨的骨吸收和骨形成，使上覆關(guān)節(jié)軟骨退化，關(guān)節(jié)損傷和破壞。

本發(fā)明所述的骨髓纖維化是一種由于骨髓造血組織中膠原增生，纖維組織嚴(yán)重影響造血功能所引起的骨髓增生性疾病。TGF-β在骨髓中血小板、巨核細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中廣泛表達(dá)，促進(jìn)膠原和纖連蛋白的合成，抑制分解膠原的基質(zhì)金屬蛋白酶，并促進(jìn)金屬蛋白酶抑制子的合成，最終導(dǎo)致膠原沉積。TGF-β還可能造成血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和骨髓微血管生長(zhǎng)。

本發(fā)明所述的系統(tǒng)性硬化癥是臨床上以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征，并累及心、肺、腎、消化道等內(nèi)臟器官的結(jié)締組織病。TGF-β能夠促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞胞外基質(zhì)的過度沉積，同時(shí)促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明所述的燒傷致增生性瘢痕是燒傷患者創(chuàng)面愈合后嚴(yán)重后遺癥，是一種不具備正常皮膚組織結(jié)構(gòu)及生理功能的，失去正常組織活力的、異常的、不健全的組織，涉及機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)在燒傷后的瘢痕中的角質(zhì)細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)量較高，另外TGF-β及其下游調(diào)控因子結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，核心蛋白聚糖和結(jié)合蛋白P311在傷口愈合和瘢痕形成過程中起重要作用。

本發(fā)明所述的囊性纖維化是一種遺傳性外分泌腺疾病，主要影響胃腸道和呼吸系統(tǒng)。囊性纖維化患者與正常群體相比TGF-β1顯著增加，肌成纖維細(xì)胞活化明顯，其機(jī)制涉及機(jī)械刺激導(dǎo)致激活的TGF-β，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致的胞外基質(zhì)分泌增加，膠原沉積和組織攣縮。

本發(fā)明所述的結(jié)節(jié)病是一種非干酪樣壞死性上皮細(xì)胞肉芽腫炎癥性疾病，以侵犯肺實(shí)質(zhì)為主，并累及全身多臟器，如淋巴結(jié)、皮膚、關(guān)節(jié)、肝、腎及心臟等組織。其病因不完全清楚，但主要涉及在肉芽腫瘤內(nèi)或周邊炎性細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子如 TGF-β。

本發(fā)明所述的心肌纖維化是由中至重度的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄引起心肌纖維持續(xù)性和（或）反復(fù)加重的心肌缺血缺氧所產(chǎn)生的結(jié)果，導(dǎo)致逐漸發(fā)展為心力衰竭的慢性缺血性心臟病。TGF-β能夠促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，增加胞外基質(zhì)合成，還能促進(jìn)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)促進(jìn)纖維化發(fā)生。

本發(fā)明所述的肝纖維化是一個(gè)病理過程，是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，纖維化的過程長(zhǎng)期持續(xù)會(huì)發(fā)展為肝硬化。肝硬化是慢性進(jìn)行性肝病，由一種或多種病因長(zhǎng)期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害。TGF-β信號(hào)通路參與肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌整個(gè)病理過程。正常情況在肝細(xì)胞中，TGF-β能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡的作用，慢性肝損傷后中TGF-β過度激活導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，胞外基質(zhì)過度沉積，大量肝細(xì)胞死亡產(chǎn)生炎癥和氧化應(yīng)激而產(chǎn)生纖維化直至肝硬化。

本發(fā)明所述的腎纖維化是慢性腎病中關(guān)鍵且不可逆的過程，導(dǎo)致腎臟不可逆的損傷，TGF-β能夠刺激腎小管上皮細(xì)胞膠原合成，并通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致腎纖維化。本發(fā)明所述的腎纖維化可以由藥物中毒、高血壓、糖尿病、持續(xù)感冒、感染等致病因素引發(fā)。

本發(fā)明所述的青光眼是由于眼內(nèi)壓增高而引起視盤凹陷、視野缺損，最終能夠?qū)е率鞯膰?yán)重眼病。眼壓增高是由于胞外基質(zhì)沉積所導(dǎo)致的由小梁網(wǎng)途徑的房水外流排出系統(tǒng)發(fā)生病變、房水流出阻力增加。來源于房水的TGF-β可局部誘導(dǎo)小梁網(wǎng)細(xì)胞表達(dá)粘連蛋白等多種胞外基質(zhì)，打破胞外基質(zhì)的合成和分解平衡導(dǎo)致胞外基質(zhì)沉積。

本發(fā)明所述的白內(nèi)障是各種原因如老化，遺傳，局部營(yíng)養(yǎng)障礙，免疫與代謝異常，外傷，中毒，輻射等，引起的晶狀體代謝紊亂，導(dǎo)致晶狀體蛋白質(zhì)變性而發(fā)生混濁。晶狀體后囊混濁是白內(nèi)障行囊外摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥。白內(nèi)障術(shù)后晶狀體后囊混濁是術(shù)中殘留的晶狀體上皮細(xì)胞的異常生長(zhǎng)和變性纖維化所致。TGF-β誘導(dǎo)的晶狀體上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是晶狀體后囊混濁和纖維的白內(nèi)障的主要原因。

本發(fā)明所述的增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變：是孔源性視網(wǎng)膜脫離術(shù)后視網(wǎng)膜表面和玻璃體后面廣泛纖維增殖膜收縮、牽拉而引起的再次視網(wǎng)膜脫離。纖維增殖膜由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞構(gòu)成。TGF-β在玻璃體、視網(wǎng)膜下積液和增殖膜中過度表達(dá)，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞遷移、增殖，并轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞，及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生和收縮。

本發(fā)明所述的瘢痕疙瘩是皮膚損傷愈合過程中，膠原合成代謝機(jī)能失去正常的約束控制，持續(xù)處于亢進(jìn)狀態(tài)，以致膠原纖維過度增生的結(jié)果，又稱為結(jié)締組織增生癥。TGF-β刺激成纖維細(xì)胞增殖，增加基質(zhì)蛋白酶抑制劑的合成和活性，激活結(jié)締組織生長(zhǎng)因子促進(jìn)膠原沉積和結(jié)締增生。

本發(fā)明所述的血管再狹窄是指血管成形術(shù)、血管手術(shù)或血管損傷后血管愈合反應(yīng)所造成的平滑肌增生、膠原和瘢痕組織增生，導(dǎo)致局部血管腔的再次狹窄。TGF-β能夠調(diào)控下游Smad和ERK/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜形成，促進(jìn)胞外基質(zhì)蛋白分泌而加強(qiáng)內(nèi)膜增生。

本發(fā)明所述的馬凡綜合征是一種遺傳性結(jié)締組織疾病，患病特征為四肢、手指、腳趾細(xì)長(zhǎng)不勻稱，身高明顯超出常人，伴有心血管系統(tǒng)異常，同時(shí)可影響包括肺、眼、硬脊膜、硬顎等其他器官。馬方綜合征由15號(hào)染色體上編碼糖蛋白微纖蛋白的微纖蛋白-1（FBN1）基因突變引起，阻礙了微纖絲的形成，由于微纖蛋白與潛在TGF-β結(jié)合蛋白的相互作用可用于穩(wěn)定非活性的TGF-β潛在復(fù)合物，當(dāng)微纖蛋白異常時(shí)就導(dǎo)致TGF-β過度激活。受累的胞外基質(zhì)組成和異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)共同決定馬凡綜合征的表型。

本發(fā)明所述的治療對(duì)象是指患有上述疾病和病癥或可能患有上述疾病和病癥的人或動(dòng)物。

本發(fā)明所述的預(yù)防和治療纖維化疾病的應(yīng)用是指所述一類多肽片段，一類多肽片段的衍生物，一類多肽衍生物，及上述片段及其衍生物經(jīng)化學(xué)修飾改造后的多肽衍生物可作為單一活性成分，或者互相聯(lián)用，或者與其他具有預(yù)防或治療纖維化活性的中藥、化合物或生物制劑聯(lián)合作為活性成分。

本發(fā)明所述的一類多肽片段，一類多肽片段的衍生物，一類多肽衍生物，及上述片段及其衍生物經(jīng)化學(xué)修飾改造后的多肽衍生物，可以直接作為原料藥使用，也可以通過藥學(xué)上可接受的載體來制備預(yù)防或治療纖維化疾病的藥物。其中，所述藥學(xué)上可接受的載體可根據(jù)藥物劑型進(jìn)行常規(guī)選擇，例如稀釋劑、填充劑、賦形劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、泡騰劑、表面活性劑、吸收促進(jìn)劑、潤(rùn)滑劑、吸附載體、緩釋微球、埋植劑、原位微球、脂質(zhì)體、微乳、原位水凝膠、納米粒、蛋白酶抑制劑、生物黏附劑、融合蛋白、抗體、多肽等。

本發(fā)明所述的一類多肽片段，一類多肽片段的衍生物，一類多肽衍生物，及上述片段及其衍生物經(jīng)化學(xué)修飾改造后的多肽衍生物的劑型沒有特別限制，為本領(lǐng)域常規(guī)劑型，較佳地是固體、半固體或液體，也可以是水溶液、非水溶液或混懸液，可以為片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、眼用制劑、吸入制劑、軟膏劑、乳膏劑、噴霧劑、氣霧劑、凝膠劑、散劑、涂劑、植入劑、洗劑等。

本發(fā)明所述的一類多肽片段，一類多肽片段的衍生物，一類多肽衍生物，及上述片段及其衍生物經(jīng)化學(xué)修飾改造后的多肽衍生物可以通過任何合適的給藥途徑給藥，較佳地為注射給藥，也可以通過口服給藥、肺部給藥、鼻腔給藥、經(jīng)皮給藥和眼部給藥等。其中，所述的注射給藥的方式較佳地包括：靜脈注射或靜脈滴注、腹腔注射、皮下注射及肌肉注射等。

在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)例中，所選多肽為SEQ ID NO：1的片段，為序列表中SEQ ID NO：2（簡(jiǎn)稱N2），所選的多肽衍生物SEQ ID NO：3（簡(jiǎn)稱N3）是N2化學(xué)修飾后的產(chǎn)物，是將PEG2通過酰胺鍵連接至多肽N-末端。

在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)例中，所選多肽的劑型為水溶液，溶劑為無菌的0.01 M PBS緩沖液。

在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)例中，所選的治療對(duì)象為博來霉素（Bleomycin，BLM）所誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠，所選大鼠來源為無特定病原體級(jí)（Specific Pathogen Free，SPF）的Sprague–Dawley（SD）大鼠，大鼠體重為200~250g。

在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)例中，所選多肽N2和N3的給藥途徑為微創(chuàng)氣管內(nèi)灌注方式，且多肽N2和N3的較佳給藥劑量均為2.5 mg/kg。

在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)例中，與氣管內(nèi)僅灌注博來霉素相比，大鼠氣管內(nèi)共同灌注博來霉素和多肽N2或者N3后，使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成降低，膠原沉積減少，從而抑制由博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺部炎癥和纖維化。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了多肽片段、多肽片段的衍生物和多肽衍生物在制備預(yù)防和治療纖維化藥物中的用途。

附圖說明

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺系數(shù)。

圖2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理切片圖。

圖3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理切片評(píng)分結(jié)果。

圖4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

圖5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織勻漿胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)圖。

圖6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織勻漿胞外基質(zhì)蛋白半定量分析圖。

圖7實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織羥脯氨酸含量。

圖8實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織勻漿Smad蛋白表達(dá)圖。

圖9實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織勻漿Smad蛋白半定量分析圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照本領(lǐng)域常規(guī)方法和條件或商品說明書進(jìn)行。

實(shí)施例1 多肽和大鼠肺纖維化模型

1. 主要實(shí)驗(yàn)材料和動(dòng)物

博來霉素由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)（批號(hào)650472）；舒泰50麻醉劑由法國(guó)維克有限公司生產(chǎn)。

多肽N2和N3由成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司合成。N2序列為：Tyr-Arg-Val-Arg-Phe-Leu-Ala-Lys-Glu-Asn-Val-Thr-Gln-Asp-Ala-Glu-Asp（序列如序列表中SEQ ID NO：2所示）。N3序列為：PEG2-Tyr-Arg-Val-Arg-Phe-Leu-Ala-Lys-Glu-Asn-Val-Thr-Gln-Asp-Ala-Glu-Asp（PEG2通過酰胺鍵連接至多肽N-末端，序列如序列表中SEQ ID NO：3所示）

SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自重慶市大坪醫(yī)院，雄性，體重200-250g。

2. 大鼠肺纖維化模型

給藥前稱重，肌肉注射舒泰麻醉液，劑量為65 mg/kg，待大鼠進(jìn)入Ⅲ期麻醉后將實(shí)驗(yàn)大鼠以斜側(cè)臥位保定，用12號(hào)灌胃針從口腔經(jīng)聲門插入大鼠氣管并灌注藥物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣管內(nèi)給藥后第1日至第7日正常飼喂，每天定時(shí)稱重，不限制飼料、飲水。

空白對(duì)照組大鼠麻醉后不做任何處理；模型組（博來霉素）大鼠氣管內(nèi)灌注博來霉素（3 mg/kg）；PBS對(duì)照組大鼠氣管內(nèi)灌注等體積的無菌PBS緩沖液（0.01 M，pH=9.5）；藥物對(duì)照組大鼠氣管內(nèi)灌注2.5 mg/kg的多肽N2（溶劑為0.01 M，pH=9.5的PBS緩沖液）；N2治療組大鼠氣管內(nèi)同時(shí)灌注2.5 mg/kg的多肽N2和3 mg/kg博來霉素，N3治療組大鼠氣管內(nèi)同時(shí)灌注2.5 mg/kg的多肽N3和3 mg/kg博來霉素。

實(shí)施例2 檢測(cè)大鼠的肺系數(shù)

取實(shí)施例1中的大鼠，稱取體重后過量麻醉處死大鼠，取下大鼠兩側(cè)肺組織，仔細(xì)去除肺組織周圍結(jié)締組織，經(jīng)生理鹽水洗滌后用濾紙吸干，電子天平稱取全肺濕重。電子天平稱取全肺濕重后，根據(jù)公式計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)=肺質(zhì)量（mg）/體重（g）（結(jié)果見圖1）。結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組、PBS對(duì)照組及藥物對(duì)照組大鼠相比，博來霉素組大鼠左肺、右肺及全肺的肺系數(shù)均顯著增高（*：P<0.01），提示大鼠肺組織發(fā)生病變；與博來霉素組大鼠相比，N2和N3治療組大鼠左肺、右肺及全肺的肺系數(shù)均顯著降低（#：P<0.05），提示N2和N3治療組大鼠肺組織病變減輕。

實(shí)施例3大鼠肺組織病理切片HE染色

取實(shí)施例1大鼠的肺組織用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，在包埋肺組織的蠟塊最大橫截面切片，蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肺組織病理學(xué)變化，在光學(xué)顯微鏡下（低倍鏡）觀察肺組織病理學(xué)改變，放大倍數(shù)100倍（結(jié)果見圖2）。結(jié)果顯示：PBS 對(duì)照組及藥物對(duì)照組的大鼠肺泡形態(tài)正常，肺泡壁纖細(xì)，間質(zhì)中有極少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肺組織有較多的小片實(shí)變區(qū)，實(shí)變區(qū)肺泡壁增厚，間隔斷裂，融合形成肺大泡，有較多肺泡結(jié)構(gòu)消失，間質(zhì)有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組對(duì)比，N2和N3治療組大鼠的肺組織肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，有少量的小片實(shí)變區(qū)，間質(zhì)有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

參照Szapie等提供的方法評(píng)價(jià)肺泡炎程度，根據(jù)病變范圍的不同可分為0～3 級(jí)，對(duì)應(yīng)0~3分，肺泡炎程度判斷使用的評(píng)價(jià)指標(biāo)如下：0級(jí)：未發(fā)生肺泡炎；1級(jí)輕度肺泡炎，表現(xiàn)為肺泡間隔稍增寬，單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，以及靠近胸膜部或僅限于局部，病變范圍小于20%，而無肺泡結(jié)構(gòu)破壞；2 級(jí)中度肺泡炎，病變范圍為20%～50%，而近胸膜部相對(duì)嚴(yán)重；3級(jí)重度肺泡炎，呈彌漫性分布，其病變范圍超過50%，偶可見實(shí)變。炎癥病理評(píng)分（結(jié)果見圖3）結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組、PBS 對(duì)照組及藥物對(duì)照組大鼠相比，博來霉素組大鼠出現(xiàn)顯著的炎癥病理改變（*：P<0.01），與BLM 組大鼠相比，N2和N3治療組大鼠肺組織炎癥病變程度均顯著減輕（#：P<0.01），結(jié)果表明多肽N2和N3能夠抑制由博來霉素所致的大鼠肺部炎癥。

實(shí)施例4 瑞氏-姬姆薩染色法檢測(cè)大鼠支氣管肺泡灌注液中炎性細(xì)胞數(shù)量的變化

取實(shí)施例1大鼠，頸部解剖，暴露氣管進(jìn)行插管，經(jīng)插管灌注預(yù)冷的生理鹽水，反復(fù)灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液，離心重懸，另取5μl細(xì)胞重懸液涂于載玻片上，待細(xì)胞懸液自然晾干后，加適量甲醇作用30 s后進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色，顯微鏡下觀察進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法為：根據(jù)100個(gè)完整細(xì)胞中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的各自占有比例，用炎性細(xì)胞總數(shù)算出巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量（結(jié)果見圖4）。與空白對(duì)照組、PBS對(duì)照組和藥物對(duì)照組大鼠相比，博來霉素組大鼠巨噬細(xì)胞、異型核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著升高（*：P<0.01）；與博來霉素組大鼠相比，N2和N3治療組大鼠巨噬細(xì)胞、異型核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（#：P<0.05），說明多肽N2和N3能夠博來霉素所致的大鼠肺部炎癥。

實(shí)施例5 免疫印跡檢測(cè)大鼠肺組織勻漿中胞外基質(zhì)蛋白含量

取實(shí)施例1大鼠的肺組織，使用RIPA裂解液（100mg肺組織對(duì)應(yīng)1mL裂解液）進(jìn)行組織勻漿，離心取上清后，采用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，取等量的蛋白樣品，使用anti-GAPDH，anti-Fibronectin，anti-CollagenⅠ和anti-Collagen Ⅲ抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)（結(jié)果見圖5）。

使用GAPDH 作為內(nèi)參照，與空白對(duì)照組，PBS 對(duì)照組和藥物對(duì)照組相比，BLM 組大鼠的肺組織中Fibronectin、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表達(dá)條帶亮度明顯增加，表明博來霉素引發(fā)大鼠肺部組織中胞外基質(zhì)沉積；而與博來霉素組相比，治療組大鼠的肺組織中Fibronectin、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表達(dá)條帶亮度幾乎恢復(fù)至對(duì)照組水平，表明多肽N2和N3能夠明顯降低博來霉素所致的肺纖維化。

使用Image pro plus 6.0圖像分析軟件對(duì)各個(gè)條帶的灰度值進(jìn)行檢測(cè)并分析（結(jié)果見圖6），結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組、PBS對(duì)照組和藥物對(duì)照組大鼠相比，博來霉素組大鼠肺組織中Fibronectin、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白水平均顯著增高（*：P<0.01）；與博來霉素組大鼠相比，N2和N3治療組大鼠Fibronectin、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白水平均顯著降低（#：P<0.05）?；叶戎禉z測(cè)支持了上述描述。

實(shí)施例8 ELISA法檢測(cè)大鼠肺組織勻漿中羥脯氨酸含量

取實(shí)施例1大鼠，采用博士德羥脯氨酸堿水解法檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：A030）檢測(cè)肺組織勻漿中羥脯氨酸的含量（結(jié)果見圖7）。結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組、PBS對(duì)照組以及藥物對(duì)照組相比，博來霉素組肺組織中的羥脯氨酸的含量顯著升高（*：P<0.01），表明BLM 引發(fā)大鼠肺部膠原纖維沉積；與博來霉素組相比，N2和N3治療組的肺組織中羥脯氨酸的含量顯著降低（#： P<0.05），表明多肽N2和N3對(duì)BLM 誘導(dǎo)的肺纖維化具有顯著抑制作用。

實(shí)施例9免疫印跡檢測(cè)大鼠肺組織勻漿Smad蛋白含量

取實(shí)施例1大鼠的肺組織，使用RIPA裂解液（100mg肺組織對(duì)應(yīng)1mL裂解液）進(jìn)行組織勻漿，離心取上清后，采用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，取等量的蛋白樣品，使用anti-GAPDH，anti-p-Smad2和anti- p-Smad3抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)（結(jié)果見圖8）。

使用GAPDH 作為內(nèi)參照，與空白對(duì)照組，PBS 對(duì)照組和藥物對(duì)照組相比，BLM 組大鼠的肺組織中p-Smad2 （磷酸化的Smad2）和p-Smad3（磷酸化的Smad3）的表達(dá)條帶亮度明顯增加，表明博來霉素引發(fā)大鼠肺部組織中TGF-β/Smad 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)；而與博來霉素組相比，N2和N3治療組大鼠的肺組織中p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)條帶亮度幾乎恢復(fù)至對(duì)照組水平，表明多肽N2和N3能夠明顯抑制博來霉素所致的肺部組織中TGF-β/Smad 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

使用Image pro plus 6.0圖像分析軟件對(duì)各個(gè)條帶的灰度值進(jìn)行檢測(cè)并分析（結(jié)果見圖9），結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組、PBS對(duì)照組和藥物對(duì)照組大鼠相比，博來霉素組大鼠肺組織中p-Smad2和p-Smad3蛋白水平均顯著增高（*：P<0.01）；與博來霉素組大鼠相比，N2和N3治療組大鼠p-Smad2和p-Smad3蛋白水平均顯著降低（#：P<0.05）?；叶戎禉z測(cè)支持了上述描述。

以上所述僅為本發(fā)明專利的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明專利的專利范圍，凡是利用本發(fā)明專利說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明專利的專利保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都惠泰生物醫(yī)藥有限公司

<120> 多肽及多肽衍生物在預(yù)防和治療纖維化疾病中的應(yīng)用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 1

Tyr Arg Val Arg Phe Leu Ala Lys Glu Asn Val Thr Gln Asp Ala Glu

1 5 10 15

Asp Asn

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人（Homo Sapiens）

<400> 2

Tyr Arg Val Arg Phe Leu Ala Lys Glu Asn Val Thr Gln Asp Ala Glu

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PEG2通過酰胺鍵連接至N-末端

<400> 3

PEG2 Tyr Arg Val Arg Phe Leu Ala Lys Glu Asn Val Thr Gln Asp Ala Glu

1 5 10 15

Asp