本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及生藥有效部位的制備和應用，具體涉及一種廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位及在治療高脂血癥中的應用。

背景技術：

高脂血癥是一種脂質(zhì)紊亂導致機體代謝失衡的慢性疾病，常表現(xiàn)為血清總膽固醇或甘油三酯水平過高和高密度脂蛋白過低等。高脂血癥與許多慢性疾病如脂肪肝、糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓及心血管疾病的形成有密切的聯(lián)系。近年來，隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構的改變，患高脂血癥的人群不斷增加。目前治療高脂血癥的藥物主要有他汀類、煙酸類、貝特類、膽酸整合劑等，其中他汀類藥物是應用最廣泛的降脂藥物。盡管他汀類藥物能夠有效降低患心血管疾病的風險，但是會引起肝酶增高、肌痛、消化道不適等副作用。

陳皮是不可多得的藥食同源、食養(yǎng)俱佳的著名地方特產(chǎn)，它是廣東道地藥材，乃廣東三寶(陳皮、老姜、禾稈草)之首和廣東十大中藥材之一。陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮。采摘成熟果實，剝?nèi)」?，曬干或低溫干燥。藥材廣陳皮主產(chǎn)于廣東新會。

陳皮主要含有黃酮類、揮發(fā)油、生物堿、肌醇、微量元素等物質(zhì)，其中黃酮和揮發(fā)油是研究最多的活性成分。黃酮類化合物主要有橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、蜜桔黃酮等，其中橙皮苷是陳皮中含量最高的黃酮類物質(zhì)。吳宏偉對陳皮的黃酮類化合物進行分離，除川陳皮素外，還分離出3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮和3-羥基-5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮。鄭國棟采用傳統(tǒng)分離純化方法從廣陳皮中分離得到個黃酮類化合物，分別為橙皮苷、5-羥基-6,7,8,3’,4’-五甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素、橙皮素、新橙皮苷和柚皮苷；并采用高速逆流色譜法制備分離得到3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮和5,7,8,4’-四甲氧基黃酮這兩種常規(guī)柱層析未能分離得到的黃酮類化合物(鄭國棟等，高速逆流色譜分離制備廣陳皮中多甲氧基黃酮類成分的研究，中草藥第41卷第1期2010年1月)。

上述3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮、3-羥基-5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮、5-羥基-6,7,8,3’,4’-五甲氧基黃酮等多種化合物都屬于多甲氧基黃酮類化合物。多甲氧基黃酮(PMFs)是苯基色原酮結(jié)構上的3,4,5,6,7,8,2’,3’,4’,5’,6’等位置處連有4個或4個以上甲氧基的黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理研究證實，PMFs具有抗病原微生物、抗誘變、抗血小板聚集、抗癌、抗炎、保護胃黏膜、神經(jīng)保護、預防心腦血管疾病等方面的藥理活性(宋家玲等，多甲氧基黃酮類化合物研究進展，中國實驗方劑學雜志第18卷第17期2012年9月)。

現(xiàn)有技術未有廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位用于治療高脂血癥的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一目的在于提供一種用于治療高脂血癥的廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位；本發(fā)明第二目的在于提供該廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位的定性分析方法；本發(fā)明第三目的在于提供該廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位的定量分析方法。

本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：

一種廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位，由如下步驟制備而成：

步驟S1，提?。簩V陳皮粉碎后用醇水溶液提取，濃縮；

步驟S2，除雜：將步驟S1所得濃縮液上樣于大孔樹脂，用體積百分濃度40-45％的乙醇水溶液洗脫除雜，所述大孔樹脂型號為D101型；

步驟S3，洗脫：用體積百分濃度90％以上的乙醇水溶液洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，濃縮即得所述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位。

優(yōu)選地，步驟S1所述醇水溶液為體積百分濃度90％以上的乙醇水溶液。

更優(yōu)選地，步驟S1將廣陳皮粉碎后用體積百分濃度95％的乙醇水溶液提取一至多次，合并提取液，濃縮。

優(yōu)選地，步驟S2用體積百分濃度40-45％的乙醇水溶液洗脫8-12個柱體積除雜。

優(yōu)選地，步驟S3用體積百分濃度90％以上的乙醇水溶液洗脫6-10個柱體積。

一種液質(zhì)定性分析上述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位的方法，參數(shù)如下：

HPLC色譜柱：Waters Symmetry C18analytical column(2.1mm×100mm,3.5μm)；

HPLC流動相：A相為0.1％(v/v)甲酸水溶液，B相為0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；

HPLC流速：0.3mL/min；

HPLC梯度洗脫程序：0-9min，10-23％B；9-13min,23％B；13-28min，23-40％B；28-32min,40-50％B；32-37min,50-100％B；

質(zhì)譜離子源：ESI離子源，正離子模式；

質(zhì)譜檢測范圍：m/z 200-1000Da；

質(zhì)譜參數(shù)：干燥氣溫度，350℃；干燥氣N₂流速，10L/min；鞘氣溫度，350℃；鞘氣He流速，11L/min；霧化器壓力，35psi；毛細管電壓，3500V；一級裂解電壓120V。

一種HPLC定量分析上述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位中多甲氧基黃酮的方法，包括：

色譜柱：Aglient Zorbax-Extend C18柱(4.5×250mm，5μm)

流動相：A相為0.1％(v/v)甲酸水溶液；B相為乙腈；

梯度洗脫程序：0-3min，25-50％B；3-7min，50-58％B；7-11min，58-58％B；11-16min，58-70％B；16-18min,70-76％B；

流速：1mL/min；檢測波長：283nm和330nm。

上述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位在治療高脂血癥中的應用。

本發(fā)明對現(xiàn)有技術的貢獻：

本發(fā)明提供的廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位可以有效降低高血脂模型小鼠的血脂水平，長期毒性試驗證明其對小鼠無明顯毒性，安全有效，可以用于預防或治療高脂血癥。

附圖說明

圖1為實施例1所得有效部位在HPLC-QTOF-MS正離子模式檢測下的總離子流圖；

圖2為小鼠血漿中總膽固醇(TC)測定結(jié)果；

圖3為小鼠血漿中甘油三酯(TG)測定結(jié)果；

圖4為小鼠血漿中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定結(jié)果；

圖5為小鼠血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定結(jié)果；

圖6為大鼠體重在0-12周的動態(tài)變化。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例具體介紹本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護范圍。實驗中未詳述的試驗操作均為本領域技術人員所熟知的常規(guī)試驗操作。

實施例1廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位的制備

由如下步驟制備而成：

步驟S1，提?。簩V陳皮藥材粉碎至粗顆粒，按固液比1:4的比例，用體積百分含量為95％的乙醇水溶液加熱回流提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏；

步驟S2，除雜：將步驟S1所得浸膏用體積百分含量為25％的乙醇水溶液溶解后，過濾取濾液上樣于D101大孔樹脂，然后用體積百分濃度43％的乙醇水溶液洗脫10個柱體積除雜；

步驟S3，洗脫：除雜后用體積百分濃度為95％的乙醇水溶液洗脫8個柱體積，收集洗脫液，濃縮即得所述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位。

實施例2廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位的制備

由如下步驟制備而成：

步驟S1，提?。簩V陳皮藥材粉碎至粗顆粒，按固液比1:4的比例，用體積百分含量為90％的乙醇水溶液加熱回流提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏；

步驟S2，除雜：將步驟S1所得浸膏用體積百分含量為20％的乙醇水溶液溶解后，過濾取濾液上樣于D101大孔樹脂，然后用體積百分濃度40％的乙醇水溶液洗脫12個柱體積除雜；

步驟S3，洗脫：除雜后用體積百分濃度為90％的乙醇水溶液洗脫12個柱體積，收集洗脫液，濃縮即得所述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位。

實施例3廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位的制備

由如下步驟制備而成：

步驟S1，提?。簩V陳皮藥材粉碎至粗顆粒，按固液比1:4的比例，用無水乙醇加熱回流提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏；

步驟S2，除雜：將步驟S1所得浸膏用體積百分含量為30％的乙醇水溶液溶解后，過濾取濾液上樣于D101大孔樹脂，然后用體積百分濃度45％的乙醇水溶液洗脫8個柱體積除雜；

步驟S3，洗脫：除雜后用無水乙醇洗脫6個柱體積，收集洗脫液，濃縮即得所述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位。

實施例4廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位的制備

由如下步驟制備而成：

步驟S1，提取：將廣陳皮藥材粉碎至粗顆粒，按固液比1:4的比例，用體積百分含量為95％的乙醇水溶液加熱回流提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏；

步驟S2，除雜：將步驟S1所得浸膏用體積百分含量為25％的乙醇水溶液溶解后，過濾取濾液上樣于D101大孔樹脂，然后用體積百分濃度43％的乙醇水溶液洗脫10個柱體積除雜；

步驟S3，洗脫：除雜后用體積百分濃度為90％的乙醇水溶液洗脫8個柱體積，收集洗脫液，濃縮即得所述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位。

實施例5廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位的制備

由如下步驟制備而成：

步驟S1，提?。簩V陳皮藥材粉碎至粗顆粒，按固液比1:4的比例，用體積百分含量為95％的乙醇水溶液加熱回流提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏；

步驟S2，除雜：將步驟S1所得浸膏用體積百分含量為25％的乙醇水溶液溶解后，過濾取濾液上樣于D101大孔樹脂，然后用體積百分濃度43％的乙醇水溶液洗脫10個柱體積除雜；

步驟S3，洗脫：除雜后用無水乙醇洗脫8個柱體積，收集洗脫液，濃縮即得所述廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位。

實施例6廣陳皮多甲氧基黃酮部位的制備(對比實施例)

由如下步驟制備而成：

步驟S1，提?。簩V陳皮藥材粉碎至粗顆粒，按固液比1:4的比例，用體積百分含量為95％的乙醇水溶液加熱回流提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏；

步驟S2，除雜：將步驟S1所得浸膏用體積百分含量為25％的乙醇水溶液溶解后，過濾取濾液上樣于D101大孔樹脂，然后用體積百分濃度43％的乙醇水溶液洗脫10個柱體積除雜；

步驟S3，洗脫：除雜后用體積百分濃度為80％的乙醇水溶液洗脫8個柱體積，收集洗脫液，濃縮得廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位。

實施例7多甲氧基黃酮有效部位的定性和定量分析

為明確廣陳皮中多甲氧基黃酮有效部位的化學成分，我們采用HPLC-QTOF/MS技術對其進行定性表征。色譜分析采用Agilent 1290高效液相串聯(lián)Agilent 6530(ESI離子源)Q-TOF質(zhì)譜(Santa Clara,CA,USA)。色譜柱為Waters Symmetry C18analytical column(2.1mm×100mm,3.5μm；Waters,Wexford,Ireland)。流速0.3mL/min。流動相系統(tǒng)A為0.1％(v/v)甲酸水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0-9min，10-23％B；9-13min,23％B；13-28min，23-40％B；28-32min,40-50％B；32-37min,50-100％B。35min后流入廢液。所有樣品均在正離子模式下檢測，質(zhì)譜的檢測范圍為m/z 200-1000Da。質(zhì)譜的參數(shù)為：干燥氣溫度，350℃；干燥氣(N2)流速，10L/min；鞘氣溫度，350℃；鞘氣(He)流速，11L/min；霧化器壓力，35psi；毛細管電壓，3500V；一級裂解電壓120V。按照設定的HPLC-QTOF-MS分析條件，使用自動二級掃描模式獲得化合物的MS/MS數(shù)據(jù)，碰撞能力設置為30V和40V?？傠x子流圖見圖1。

實施例1廣陳皮中多甲氧基黃酮有效部位的化學成分鑒定結(jié)果如下表：

上表中，*代表該化合物經(jīng)標準品比對。

根據(jù)定性結(jié)果，以及色譜峰的高度，發(fā)現(xiàn)實施例1制備的廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位中主要含有如下8種多甲氧基黃酮：

用HPLC法對實施例1多甲氧基黃酮有效部位中這8種多甲氧基黃酮進行定量分析，色譜分離采用Aglient Zorbax-Extend C18柱(4.5×250mm，5μm)；流動相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0-3min，25-50％B；3-7min，50-58％B；7-11min，58-58％B；11-16min，58-70％B；16-18min,70-76％B；柱后運行時間8min回到起始梯度；流速：1mL/min；檢測波長：283nm，330nm；進樣量：4μL。

8種多甲氧基黃酮的含量以及占有效部位的總含量如下表所示：

實施例2-6制備的廣陳皮多甲氧基黃酮有效部位也主要含有該8種多甲氧基黃酮，該8種多甲氧基黃酮在實施例1-6有效部位中的總含量如下表所示：

由文獻(大孔樹脂分離純化陳皮中多甲氧基黃酮類化合物，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)2014年26卷1562-1567頁)可知，使用D101大孔樹脂富集陳皮中多甲氧基黃酮類化合物時，80％乙醇洗脫6個柱體積就已經(jīng)將多甲氧基黃酮類化合物洗脫完全。上述實施例中，實施例6使用80％乙醇洗脫8個柱體積時，洗脫物中多甲氧基黃酮類化合物的含量最高，實施例4、1、5分別使用90％、95％和100％乙醇洗脫8個柱體積，洗脫物中多甲氧基黃酮類化合物的含量依次降低，這是因為隨著乙醇比例的升高，洗脫液的洗脫強度增大，洗脫物中比多甲氧基黃酮類化合物極性小的雜質(zhì)陸續(xù)從D101大孔樹脂上洗脫下來。

實施例8多甲氧基黃酮有效部位降血脂藥效學實驗

1、動物模型的建立

C57BL/6J雄性小鼠，體重18-20g，6周齡。小鼠適應一周后隨機分為7組：正常飼料組(Chow)，高脂飲食組(High fat diet，HFD)，高脂飲食+實施例1低劑量組(HFD-LD-1)，高脂飲食+實施例1高劑量組(HFD-HD-1)，高脂飲食+實施例6低劑量組(HFD-LD-6)和高脂飲食+實施例6高劑量組(HFD-HD-6)，高脂飲食+陽性藥洛伐他汀組(HFD-LOV)。

高脂飼料配方為：1.25％膽固醇、20％豬油、5％蔗糖、0.5％膽酸。

2、給藥劑量和給藥方式

實施例1和實施例6所得多甲氧基黃酮部位分別用0.5％CMC-Na溶液配置成混懸液。HFD-LD-1組灌胃給予60mg/kg的實施例1所得PMFs部位；HFD-HD-1組灌胃給予120mg/kg的實施例1所得PMFs部位；HFD-LD-6組灌胃給予60mg/kg的實施例6所得PMFs部位；HFD-HD-6組灌胃給予120mg/kg的實施例6所得PMFs部位；HFD-LOV組灌胃給予30mg/kg的洛伐他?。籆how組和HFD組給予同體積的0.5％CMC-Na空白溶劑。以上各組動物每日上午灌胃給藥一次，給藥時間持續(xù)八周。

3、血漿制備

實驗結(jié)束前，小鼠禁食12h，期間自由飲水。眼眥靜脈取血，放入離心管中，4000rpm，4℃，離心10min，上清-80℃保存。

4、血漿生化指標測定

血漿甘油三酯、總膽固醇、血漿低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇指標委托江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院測定。儀器設備名稱為Cobas 8000全自動生化分析儀。

5、動物血漿生化指標測定結(jié)果

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定結(jié)果如下表和圖2-5所示。測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：HFD誘導8周后，模型組與空白組相比較，TG、TC、LDL-C顯著增加(P＜0.001)，說明小鼠高脂血癥模型造模成功；與模型組相比，HFD-LD-1、HFD-HD-1、HFD-LD-6、HFD-HD-6組小鼠血漿中TG、TC、LDL-C水平均明顯降低，HDL-C升高。以上結(jié)果表明實施例1和實施例6制備的廣陳皮的多甲氧基黃酮部位具有顯著的降血脂作用，能預防或治療高脂血癥，且具有量效差異性。

實施例6多甲氧基黃酮部位降血脂效果略優(yōu)于實施例1和陽性藥洛伐他汀。

實施例2-5制備的多甲氧基黃酮有效部位與實施例1的降血脂效果基本一致。

實施例9多甲氧基黃酮有效部位對大鼠的長期毒性實驗

1、實驗動物

清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體重120±20g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(中國，上海)，購買后進行適應性飼養(yǎng)一周。

2、給藥劑量和給藥方式

健康Wistar大鼠分籠飼養(yǎng)，適應性飼養(yǎng)一周后，按性別隨機分成5組：正常對照組(BL)15只，每天以同體積0.5％CMC-Na空白溶劑灌胃；給藥LD-1組20只，每天以150mg/kg實施例1制備的PMFs部位灌胃；給藥HD-1組20只，每天以300mg/kg實施例1制備的PMFs部位灌胃；給藥LD-6組20只，每天以150mg/kg實施例6制備的PMFs部位灌胃；給藥HD-6組20只，每天以300mg/kg實施例6制備的PMFs部位灌胃。

以上各組每日上午灌胃給藥一次，連續(xù)用藥84d。

3、檢測項目

試驗期間密切觀察大鼠給藥前后的行為情況，每周記錄動物體重變化；每周計算動物的日均攝入量；給藥至84d時，空腹16h腹主動脈采血，觀察各組動物血液學指標及血液生化指標；處死動物后對動物各臟器進行病理組織學檢，同時主要臟器按動物體重計算臟器系數(shù)。

4、實驗結(jié)果

4.1對大鼠一般情況的影響

與空白組相比，實施例1低劑量和高劑量組對動物行為活動、飲食、大小便、精神狀態(tài)等均無明顯差異；實施例6低劑量和高劑量組在84d用藥期間動物出現(xiàn)怠動，流涎及輕微稀便等現(xiàn)象，試驗期間無大鼠出現(xiàn)異常死亡。

HD-6組與空白組在體重增長中有統(tǒng)計學差異P>0.05，見圖6。

4.2對大鼠血液學指標的影響

由下表可以看出，與空白組相比，實施例1低劑量和高劑量組給藥84d，各組血液生化學指標外周血象未見明顯異常；實施例6低劑量和高劑量組紅細胞計數(shù)未出現(xiàn)顯著性差異，但白細胞、淋巴細胞計數(shù)顯著增加，網(wǎng)織紅細胞、血紅蛋白，血小板計數(shù)顯著降低。

4.3對大鼠血液生化指標的影響

由下表可知，與空白組相比，實施例1低劑量和高劑量組給藥84d，血液生化學指標未見明顯異常；實施例6低劑量和高劑量組總蛋白升高，白蛋白降低，總膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、尿素、血肌酐均升高，提示有肝腎毒性，其余血液指標未見異常。

4.4對大鼠臟器指數(shù)的影響

與空白組相比，實施例1低劑量和高劑量組給藥84d，對大鼠臟器指數(shù)的影響沒有統(tǒng)計學差異。實施例6低劑量和高劑量組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)均升高。

長期毒性實驗發(fā)現(xiàn)，實施例1制備的多甲氧基黃酮部位比實施例6制備的多甲氧基黃酮部位具有更高的安全性。實施例1低劑量和高劑量給藥84d對大鼠體重、外周血象、血液生化指標及各臟器指數(shù)的影響并未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，對大鼠的正常生長、發(fā)育無不利影響，未出現(xiàn)明顯蓄積性毒性反應；而實施例6高劑量會導致動物精神狀態(tài)欠佳，毛色、行為活動、糞便性狀等出現(xiàn)異常，網(wǎng)織紅細胞計數(shù)下降提示可能產(chǎn)生造血功能障礙；白細胞、淋巴細胞計數(shù)增加等可能有炎癥反應。在血液生化指標中，實施例6低劑量和高劑量組ALT、AST及肝臟指數(shù)均明顯升高，可能會對肝臟造成損傷；尿素、血肌酐也出現(xiàn)升高，提示可能有腎臟毒性。從主要臟器指數(shù)來看，實施例6低劑量和高劑量組肝臟、脾臟、腎臟腫大增生，提示可能會導致大鼠體內(nèi)出現(xiàn)炎癥或器官代償性增生、肥大。以上結(jié)果說明實施例1制備的多甲氧基黃酮部位比實施例6制備的多甲氧基黃酮部位具有更高的安全性。實施例2-5制備的多甲氧基黃酮部位與實施例1制備的多甲氧基黃酮部位具有相同的安全性。

上述實施例僅用于解釋本發(fā)明技術方案，但本發(fā)明要求保護的范圍不局限于上述實施例。