本發(fā)明屬于中藥提取物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位及其制備方法。

背景技術(shù)：

冠心病是臨床上最常見病、多發(fā)病之一，它是一種由冠狀動脈器質(zhì)性(動脈粥樣硬化或動力性血管痙攣)狹窄或阻塞引起的心肌缺血缺氧(心絞痛)或心肌壞死(心肌梗塞)的心臟病，亦稱缺血性心臟病。平時我們說的冠心病多數(shù)是動脈器質(zhì)性狹窄或阻塞造成心肌。缺血缺氧引起的，又稱冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。其冠狀動脈狹窄多系脂肪物質(zhì)沿血管內(nèi)壁堆積所致，這一過程稱為動脈硬化。動脈硬化發(fā)展到一定程度，冠狀動脈狹窄逐漸加重，限制流入心肌的血流。心臟得不到足夠的氧氣供給，就會發(fā)生胸部不適，即心絞痛。該病病因至今尚未完全清楚，但認(rèn)為與高血壓、高脂血癥、高粘血癥、糖尿病、內(nèi)分泌功能低下及年齡大等因素有關(guān)，其發(fā)病率呈逐年增長趨勢。

針對冠心病的治療，主要原則是改善冠狀動脈的供血和減輕心肌缺血和耗氧，同時治療和預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)展。其中，冠心病支架術(shù)是冠心病的手術(shù)治療方法之一，其基本原理是將球囊導(dǎo)管通過血管穿刺置入狹窄的血管內(nèi)，在體外將球囊加壓膨脹，撐開狹窄的血管壁，使病變血管恢復(fù)暢通，1-2處冠狀動脈狹窄且放支架容易可選擇介入治療。但是臨床上發(fā)現(xiàn)，一些冠心病冠脈支架術(shù)后患者仍然冠狀動脈血管狹窄、心肌缺血的問題，對于這類患者，增加冠狀動脈分支或側(cè)枝循環(huán)、恢復(fù)缺血心肌血供，對改善患者癥狀和預(yù)后也是十分重要的。

中醫(yī)藥在治療冠心病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，不僅能有效改善冠狀動脈缺血癥狀，且維持時間長，不良反應(yīng)小，對病人臟器損害小，如果中國發(fā)明專利CN1310019A、CN1579487A、CN1522747A、CN1517122A、CN1452998A等都公開了治療冠心病的中藥組合物，但現(xiàn)有的中藥制劑不能適應(yīng)當(dāng)今冠心病新變化的需要，臨床辯證選藥余地小。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位及其制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位，它是由如下質(zhì)量份的原料制成：人參0.5～2和牡丹皮1～4。

根據(jù)上述的治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位，它是由如下質(zhì)量份的原料制成：人參1～1.5和牡丹皮2～3。

根據(jù)上述的治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位，它是由如下質(zhì)量份的原料制成：人參1和牡丹皮2。

根據(jù)上述的治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位，該有效部位可制成任何一種臨床上或藥學(xué)上可接受的制劑。

所述的治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位的制備方法，包括以下步驟：

(1)分別將原料人參和牡丹皮粉碎備用；

(2)先稱取配方量的牡丹皮加入8～10倍量水浸泡1.5～2.5h，然后蒸餾，直至餾出液澄清、無丹皮酚結(jié)晶析出為止，分別收集餾出物和餾余物，餾出物密閉冷藏過夜后過濾得丹皮酚結(jié)晶，將丹皮酚結(jié)晶于60℃以下低溫干燥備用，餾余物過濾后得藥渣和余液；

(3)將步驟(2)蒸餾后的藥渣與配方量的人參混合，加水煎煮3次，每次加5～8倍量的水，煎煮1.5～2h，過濾，合并濾液；

(4)將步驟(2)得到的余液與步驟(3)得到的濾液合并，濃縮至每1kg藥液相當(dāng)于0.5kg藥材量，冷藏靜置24h，濾過，濾液通過大孔吸附樹脂柱，依次用8倍量水、5％乙醇、70％乙醇和85％乙醇洗脫，收集洗脫液，濾液回收乙醇并濃縮干燥，然后與丹皮酚結(jié)晶混合即得產(chǎn)品。

所述的治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位中人參總皂苷和牡丹皮總苷的含量不低于60％，其中單體成分的含量人參皂苷Rg₁不低于6mg/g，Re不低于5mg/g，Rb₁不低于7mg/g，Rd不低于4mg/g，芍藥苷的含量不低于23mg/g，丹皮酚的含量不低于80mg/g。

上述步驟(1)所述原料人參和牡丹皮粉碎成直徑0.5-3mm的顆粒。

方解及處方分析：

冠心病是常見的心血管系統(tǒng)疾病，應(yīng)當(dāng)屬于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中的“胸痹”或“心痛”等范疇。根據(jù)中醫(yī)理論，冠心病、心肌缺血的主要病機(jī)是氣虛血瘀，氣虛為本，血瘀為標(biāo)，益氣活血法是目前防治冠心病的主要治療法則之一。本方中人參大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，牡丹皮活血化瘀，清熱涼血，二者配伍，標(biāo)本兼治，通補(bǔ)結(jié)合，具有益氣通絡(luò)，活血化瘀的作用，符合中醫(yī)理論。文獻(xiàn)資料表明，人參中含有人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁和Rd等多種皂苷類成分，具有抗血栓、促進(jìn)免疫、抗缺血損傷、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用；牡丹皮中含有以芍藥苷為主的等多種苷類成分，對心肌缺血有明顯的保護(hù)作用，抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變等作用，牡丹皮中還含有以丹皮酚為主的等酚酸類成分，具有抗炎、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、改善血流變學(xué)、保護(hù)心肌缺血損傷等作用。因此，人參、牡丹皮抗腦缺血的有效部位(人參總皂苷、牡丹皮總苷、丹皮酚)主要活性成分相對清楚，生物活性較好，體現(xiàn)出了中醫(yī)藥治療冠心病、心肌缺血缺血的特色和優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為芍藥苷、人參皂苷Rg1、Re、丹皮酚、Rb1和Rd混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖；

圖2為本發(fā)明人參牡丹皮有效部位樣品的高效液相色譜圖；

圖3為缺牡丹皮陰性對照品的高效液相色譜圖；

圖4為缺人參陰性對照品的高效液相色譜圖；

注：圖1～4中，1.芍藥苷 2.人參皂苷Re 3.人參皂苷Rg₁ 4.丹皮酚 5.人參皂苷Rb₁6.人參皂苷Rd。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

1.丹皮酚的提取方法及其轉(zhuǎn)移量的測定

水蒸氣蒸餾法提取丹皮酚

取粉碎后的牡丹皮500g，置10000mL具塞圓底燒瓶中，加5000mL水浸泡兩小時，連接冷凝器，蒸餾，收集蒸餾液，至溜出液無渾濁，將其置于冰箱中冷藏靜置，取出，過濾，干燥，精密稱重，得到丹皮酚6.1325g，即牡丹皮采用水蒸氣蒸餾法提取，丹皮酚的轉(zhuǎn)移量為12.256mg/g。

另外，按中國藥典2010年版一部牡丹皮項(xiàng)下HPLC法測定藥材中丹皮酚的含量，結(jié)果測得丹皮酚的含量為16.28mg/g。計算出蒸餾法從牡丹皮中提取的丹皮酚的轉(zhuǎn)移率為75.34％。

2.牡丹皮的藥渣與人參混合煎煮工藝參數(shù)的研究

取相當(dāng)于牡丹皮原藥材40g的藥渣與人參20g混合，選取提取次數(shù)(A)、提取時間(B)、加水量(C)3個實(shí)驗(yàn)因素，每個因素3個水平，按L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1因素水平表

3.人參皂苷的含量測定

3.1色譜條件

SHIMADZU ODS C₁₈色譜柱(4.6×150mm，5μm)；以乙腈—水溶液系統(tǒng)，按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，流速：1.0mL/min；檢測波長：203nm；柱溫：35℃。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg₁峰計算應(yīng)不少于2000。

表2人參皂苷流動相梯度洗脫時間程序

3.2人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg₁ 2.58mg，人參皂苷Re 1.97mg，人參皂苷Rb₁ 2.67mg，人參皂苷Rd 3.57mg，至10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3.3人參混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20、30μL，分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定人參皂苷的吸收峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以吸收峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸處理。人參皂苷Rg₁的回歸方程為Y＝2.22×10⁵X－1.10×10⁴，r＝0.999 1；人參皂苷Re的回歸方程為Y＝2.56×10⁵X－2.85×10⁴，r＝0.999 8；人參皂苷Rb₁的回歸方程為Y＝2.86×10⁵X－2.18×10⁴，r＝0.999 8；人參皂苷Rd的回歸方程為Y＝3.20×10⁵X－2.09×10⁴，r＝0.999 8。

結(jié)果表明，人參皂苷Rg₁在0.516～7.740μg范圍內(nèi)，人參皂苷Re在0.394～5.910μg范圍內(nèi)，人參皂苷Rb₁在0.534～8.010μg范圍內(nèi)，人參皂苷Rd在0.714～10.710μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積積分值之間有良好的線性關(guān)系。

3.4供試品溶液的制備及測定

將正交試驗(yàn)所得的各組提取液分別水浴濃縮，加水定容至100mL，放入冰箱靜置過夜；取出，以3500r/min離心30min，精密吸取上清液10mL至分液漏斗中，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次10mL，合并水飽和正丁醇提取液，用20mL氨試液洗滌，棄去氨水層，分取正丁醇液，水浴蒸干，用甲醇定容至25mL，作為供試品溶液。

分別精密吸取各供試品溶液5μL、標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL注入高效液相色譜儀，按照上述條件進(jìn)行測定計算提取液中人參皂苷的總含量，結(jié)果見表3。

表3人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rd總含量的正交試驗(yàn)結(jié)果

3.5各因素方差分析結(jié)果，見表4。

表4人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rd總含量的方差分析表

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析及方差分析可知，以人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rd的總含量計，對人參牡丹皮提取液中人參皂苷含量影響因素大小順序A>B>C>D，因素A、B、C對試驗(yàn)結(jié)果的影響均顯著，其中因素A和B為極顯著性影響因素，依據(jù)表3選擇最佳水平，得到人參的最佳的工藝條件為A₃B₃C₁，即6倍量的水，煎煮3次，每次2h。

4.芍藥苷的含量測定

4.1色譜條件

SHIMADZU ODS C₁₈色譜柱(4.6×150mm，5μm)；流動相0.05％磷酸水溶液—甲醇(76:24)，流速：1.0mL/min；檢測波長：230nm；柱溫：35℃；理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不少于2000。

4.2芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取芍藥苷1.42mg，至25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1mL含0.0568mg的芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

4.3芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品溶液1、5、10、15、20μL，分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定芍藥苷的吸收峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以吸收峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸處理，回歸方程為Y＝1.32×10⁶X－6.41×10⁴，r＝0.999 3，結(jié)果表明芍藥苷在0.0568～1.136μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積積分值之間有良好的線性關(guān)系。

4.4供試品溶液的制備及測定

精密吸取“3.4”項(xiàng)下上清液5mL至三角瓶中，滴加無水乙醇至20mL，振搖，靜置約2h，過濾，作為供試品溶液。

分別精密吸取各續(xù)濾液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL注入高效液相色譜儀，按照上述條件進(jìn)行測定計算提取液中芍藥苷的含量，結(jié)果見表5。

表5芍藥苷的正交試驗(yàn)結(jié)果

4.5各因素方差分析結(jié)果，見表6。

表6芍藥苷方差分析表

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析及方差分析可知，對芍藥苷含量影響因素大小順序?yàn)锳>C>D>B，但各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響均不顯著，因此蒸餾后的牡丹皮藥渣的煎煮條件參考人參項(xiàng)下參數(shù)即可。

5.煎煮液的純化精制

將提取的人參牡丹皮濃縮液冷藏并離心后，上清液過大孔吸附樹脂，待藥液充分吸附，再依次用蒸餾水、5％乙醇、40％乙醇、70％乙醇和85％乙醇洗脫。采用薄層色譜法，分別檢視各洗脫液中人參皂苷和芍藥苷，結(jié)果人參皂苷主要集中在70％乙醇洗脫液，芍藥苷主要集中在40％乙醇洗脫液中，故在實(shí)際精制提取物時，可簡化操作，省略40％乙醇洗脫步驟，直接收集70％乙醇洗脫液即可，洗脫液回收乙醇，濃縮干燥。即得人參總皂苷和牡丹皮總苷提取物。該提取物與“1”項(xiàng)下丹皮酚混合即為人參牡丹皮有效部位提取物。

本發(fā)明提供了一種治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位的制備方法，包括以下步驟：

(1)分別將原料人參1kg和牡丹皮2kg粉碎備用；

(2)先稱取配方量的牡丹皮加入8～10倍量水浸泡1.5～2.5h，然后蒸餾，直至餾出液澄清、無丹皮酚結(jié)晶析出為止，分別收集餾出物和餾余物，餾出物密閉冷藏過夜后過濾得丹皮酚結(jié)晶，將丹皮酚結(jié)晶于60℃以下低溫干燥備用，餾余物過濾后得藥渣和余液；

(3)將步驟(2)蒸餾后的藥渣與配方量的人參混合，加水煎煮3次，每次加5～8倍量的水，煎煮1.5～2h，過濾，合并濾液；

(4)將步驟(2)得到的余液與步驟(3)得到的濾液合并，濃縮至每1kg藥液相當(dāng)于0.5kg藥材量，冷藏靜置24h，濾過，濾液通過大孔吸附樹脂柱，依次用8倍量水、5％乙醇、70％乙醇和85％乙醇洗脫，收集洗脫液，濾液回收乙醇并濃縮干燥，然后與丹皮酚結(jié)晶混合即得產(chǎn)品，得到中藥有效部位量為250～300g。

6.治療冠心病、心肌缺血的中藥有效部位的定量研究

為保證提取的人參牡丹皮有效部位提取物的質(zhì)量穩(wěn)定，對提取物中人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁和Rd等主要人參皂苷類成分和丹皮酚、芍藥苷等牡丹皮中主要活性成分采用HPLC法進(jìn)行了含量測定研究，采用紫外分光光度法對提取物中的總苷進(jìn)行了含量測定研究。

6.1人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁和Rd、丹皮酚和芍藥苷的HPLC法測定

6.1.1色譜條件

色譜柱：SHIMADZU C₁₈柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-水溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，梯度洗脫程序見下表7；體積流量：1mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：35℃；檢測波長：分別在各成分的最大吸收波長處測定，其中人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rd為203nm，芍藥苷為230nm，丹皮酚為274nm。

表7本發(fā)明有效部位含量測定的梯度洗脫時間程序

6.1.2混合對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rd、芍藥苷和丹皮酚對照品，加甲醇制成每1mL分別含人參皂苷Rg₁ 0.38mg、人參皂苷Re 0.199mg、人參皂苷Rb₁ 0.315mg、人參皂苷Rd 0.324mg、芍藥苷0.314mg、丹皮酚0.912mg的混合溶液。

6.1.3供試品溶液的制備

取人參牡丹皮有效部位提取物約0.2g，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

6.1.4樣品測定

取制備的本發(fā)明有效部位提取物，按上述方法操作，測定樣品中人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rd、丹皮酚和芍藥苷等活性成分的含量，結(jié)果見下表8，色譜圖見圖1～4。

表8本發(fā)明有效部位中活性成分的含量(單位：mg/g)

另外，在實(shí)驗(yàn)中還進(jìn)行了線性關(guān)系考察、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率等方法學(xué)考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷Rg₁在0.76～11.40μg、Re在0.398～5.97μg、Rb₁在0.63～9.45μg、Rd在0.648～9.72μg、芍藥苷在0.628～9.42μg、丹皮酚在1.824～27.36μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與色譜峰的峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(r≥0.9990)；精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的平均值RSD＜3.0％，平均加樣回收率在98.5％～101.2％，RSD＜3.0％；同時進(jìn)行的陰性對照試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性無干擾。

6.2 UV法測定人參牡丹皮提取物中總苷的含量

6.2.1對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對照品10.02mg，置10mL量瓶中，加甲醇制成每lmL含1.002mg的溶液，即得。

6.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品溶液20、40、80、120、160和2 00μL，分別置于具塞試管中，低溫?fù)]去溶劑，加入1％香草醛高氯酸試液0.5mL，置60℃恒溫水浴上混勻并加熱15min，立即用冰水冷卻1min，加人濃硫酸溶液5mL，搖勻；以試劑作空白。在540nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6.2.3測定法

取本品約50mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取50μL，照“6.2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“置于具塞試管中”起依法操作，測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中芍藥苷的量，計算樣品中人參皂苷和牡丹皮總苷以芍藥苷計的含量。測定結(jié)果見下表9。

表9人參牡丹皮有效部位中總苷的測定結(jié)果

7.人參牡丹皮有效部位的抗冠心病、心肌缺血的藥效作用：

7.1對心肌缺血的保護(hù)作用

7.1.1受試藥物、對照藥和主要試劑

人參和牡丹皮有效部位提取物，臨用前以純化水分別配制成混懸液。按日處方量人參6g、牡丹皮12g計算，人參牡丹皮有效部位的擬臨床人用劑量為0.3g生藥/(kg·d)，人以60kg計。地奧心血康膠囊，乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、一氧化氮(NO)、總超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒。

另外，按黃芪6g、赤芍12g比例，取黃芪和赤芍藥材，按“2、人參牡丹皮有效部位的制備”項(xiàng)下方法，提取黃芪和赤芍總苷部位。具體方法為：黃芪、赤芍加水煎煮3次，每次2h，濾過，合并提取液，濾過，濃縮至每1kg藥液相當(dāng)于0.5kg藥材量，冷藏靜置24h，濾過，濾液加于已處理好的大孔吸附樹脂柱上，依次用8倍量水、5％乙醇、70％乙醇和85％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮干燥，即得黃芪赤芍總苷部位提取物。

7.1.2實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠，SPF級，體重200～250g，雌雄各半。

7.1.3統(tǒng)計方法

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先做ANOVA分析，然后進(jìn)行t檢驗(yàn)或q’檢驗(yàn)，以P＜0.05為差別有顯著性意義，給藥組間比較用q檢驗(yàn)(SNK法)，以P＜0.05為差別有顯著性意義。

7.1.4實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

7.1.4.1劑量設(shè)置與分組

取大鼠175只，體重200～250g，雌雄各半，隨機(jī)分為7組：①假手術(shù)組，給予蒸餾水；②模型對照組，給予蒸餾水；③陽性對照組，給予地奧心血康膠囊0.1g/kg；④高劑量組，⑤中劑量組，⑥低劑量組，分別給予人參牡丹皮有效部位提取物6g生藥/kg、3g生藥/kg和1.5g生藥/kg；⑦黃芪赤芍組，給予黃芪赤芍總苷部位提取物3g生藥/kg。

7.1.4.2線栓法致大鼠心肌缺血再灌注模型的制備

灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天，給藥容積均為1.0mL/100g體重。末次給藥后2h腹腔注射水合氯醛0.35g/kg(10％，3.5mL/kg)麻醉，仰臥固定，頸正中切口，接呼吸機(jī)，開胸暴露心臟，以左主干冠脈為標(biāo)志，在左心耳根部下方2mm處穿5-0線結(jié)扎冠脈造成心肌缺血，心電圖ST段抬高被認(rèn)為是成功模型建立的標(biāo)志；假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。大鼠缺血適應(yīng)15min后，關(guān)閉胸腔，逐層縫合胸壁，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后，拔出插管，停呼吸機(jī)。正常飼養(yǎng)24h后，麻醉大鼠，分別取血及心臟組織備用。

7.1.4.3結(jié)果評價

7.1.4.3.1血清生化指標(biāo)測定

各組大鼠腹動脈取血2mL，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，取血清，測定血清中CK、LDH、NO、SOD和MDA的含量。

7.1.4.3.2心肌梗死面積測定

采用Evans blue-TTC雙重染色法^[4]：大鼠取血后，迅速開胸取心臟，從主動脈緩慢注入PBS溶液10mL沖洗余血，再緩慢注入1％依文思藍(lán)溶液6mL；剔除血管和脂肪等非心肌組織，-80℃冷凍30min，沿房室溝從心尖部將心臟平行切成2mm厚切片；將心臟切片放入1％TTC溶液中(用PH7.4-7.5的PBS溶液配制)，置于37℃水浴中避光染色20min，于10％福爾馬林溶液中固定24h；心臟切片稱重，解剖顯微鏡下拍照，ImageTool 3.0圖像分析軟件分析各心臟切片(正常心肌為藍(lán)色，缺血心肌為紅色，梗死心肌為白色)，計算心肌梗死面積百分比。

7.1.4.4結(jié)果

7.4.4.1對血清生化指標(biāo)的的影響

與假手術(shù)組比較，模型對照組動物血清CK、LDH、NO和MDA水平升高(P＜0.01)，SOD活力下降(P＜0.01)，表現(xiàn)為明顯的氧化應(yīng)激損傷以及清除自由基能力下降。與模型對照組比較，人參牡丹皮有效部位各劑量組均能明顯降低血清CK、LDH、NO和MDA水平(P＜0.01，P＜0.05)，高、中劑量組對模型動物血清SOD活力降低和NO水平升高均有明顯改善作用(P＜0.01，P＜0.05)。將人參牡丹皮配方替換為黃芪赤芍后，制備的黃芪赤芍總苷按人參牡丹皮有效部位中劑量給藥，結(jié)果能明顯降低血清CK、LDH水平，有降低NO和MDA水平、升高SOD水平的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與人參牡丹皮有效部位中劑量組相比，對模型動物血清生化指標(biāo)的影響較小，具體結(jié)果見表10。

表10人參牡丹皮有效部位對心肌缺血模型大鼠血清生化指標(biāo)的影響

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

7.1.4.4.2對心肌梗死范圍的影響

染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見明顯梗死區(qū)域，模型對照組動物有較大梗死范圍，人參牡丹皮有效部位提取物高、中劑量組和陽性藥物組與模型對照組比較，可改善作用明顯(P＜0.01，P＜0.05)，人參牡丹皮有效部位低劑量組和黃芪赤芍總苷部位組有減小心肌梗死范圍面積的趨勢，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表11。

表11人參牡丹皮有效部位對心肌缺血模型大鼠梗死范圍的影響

注：與模型對照組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

7.2對血栓形成的影響

7.2.1受試藥物、對照藥、主要試劑

人參和牡丹皮有效部位提取物，臨用前以純化水分別配制成混懸液。按日處方量人參6g、牡丹皮12g計算，人參牡丹皮有效部位的擬臨床人用劑量為0.3g生藥/(kg·d)，人以60kg計。地奧心血康膠囊，烏拉坦(氨基甲酸乙酯)，肝素鈉注射液。

7.2.2實(shí)驗(yàn)動物、飼養(yǎng)條件等

SD大鼠，SPF級，體重200～250g，雌雄各半，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心。

7.2.3統(tǒng)計方法

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先做ANOVA分析，然后進(jìn)行t檢驗(yàn)或q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差別有顯著性意義，給藥組間比較用q檢驗(yàn)(SNK法)，以P＜0.05為差別有顯著性意義。

7.2.4實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

取大鼠70只，體重250g左右，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，①假手術(shù)組，給予蒸餾水；②陽性對照組，給予地奧心血康膠囊0.1g/kg；③高劑量組，④中劑量組，⑤低劑量組，分別給予人參牡丹皮有效部位提取物6g生藥/kg、3g生藥/kg和1.5g生藥/kg。

灌胃給藥，每天1次，連續(xù)28天，給藥容積均為1.0mL/100g體重。末次給藥前動物禁食不禁水14h，末次給藥后0.5h，腹腔注射烏拉坦溶液1g/kg(10％，1.0mL/100g體重)麻醉，仰位固定，分離右側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸外靜脈，用內(nèi)徑為1～2mm的三段聚乙烯管相互連接，中段放置一根預(yù)先稱重的長5cm的4號手術(shù)線，以肝素生理鹽水溶液(50U/mL)充滿管腔，當(dāng)管的一端插入左頸外靜脈后，從聚乙烯管注入肝素50U/kg，夾住管壁，將管的另一端插入右頸總動脈，手術(shù)完成后開放血流，15min后中斷血流，迅速取出絲線稱重，總重量減去手術(shù)線重即血栓濕重，然后置60℃干燥4h后稱血栓干重，按以下公式計算抑制率：

結(jié)果表明，與空白對照組比較，陽性對照組和人參牡丹皮有效部位三個劑量組均能減輕大鼠血栓濕重，差別有顯著性意義或非常顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)，亦能使大鼠血栓干重減輕，其中陽性對照藥組差別有顯著性意義(P＜0.05)，高劑量組有非常顯著性意義(P＜0.01)。具體結(jié)果見表12。

表12人參牡丹皮有效部位對大鼠血栓形成的影響

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

8、研究結(jié)果總結(jié)

8.1人參牡丹皮的配伍

人參牡丹皮配伍后，大補(bǔ)元?dú)猓钛?，通補(bǔ)結(jié)合，符合中醫(yī)益氣活血理論。藥理研究結(jié)果表明人參牡丹皮有效部位表現(xiàn)出了較好的抗心肌缺血和抗血栓活性。另取同樣具有補(bǔ)中益氣作用的經(jīng)典藥物黃芪替換方中人參，取同樣具有活血化瘀作用的同為毛茛科植物的常用藥材赤芍替代方中牡丹皮，提取精制成黃芪赤芍總苷提取物，觀察其對心肌缺血再灌注模型大鼠的作用，結(jié)果將人參和牡丹皮置換為黃芪赤芍后，藥物的抗心肌缺血藥理活性明顯差于人參牡丹皮有效部位，提示本發(fā)明具有獨(dú)特的配伍組方優(yōu)勢。

8.2有效部位的提取工藝

人參的主要有效部位為皂苷類化合物，牡丹皮為苷類成分和丹皮酚，在實(shí)驗(yàn)中對上述有效部位的最佳提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，并對提取液加以精制純化，保證了有效部位的純度。所采用的提取純化方法可適合工業(yè)化生產(chǎn)。

8.3定量控制

對人參牡丹皮有效部位分別采用HPLC法建立了提取物中6種主要有效成分的含量測定方法，采用UV法測定了提取物中的總苷含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的含量測定方法簡單準(zhǔn)確，可重復(fù)性好，能準(zhǔn)確控制提取物中主要成分的含量。

8.4藥理實(shí)驗(yàn)研究

心肌缺血發(fā)生后，心肌細(xì)胞磷脂酶激活，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、通透性增高和氧自由基聚積，細(xì)胞內(nèi)LDH、CK等酶漏出入血，這兩種心肌酶活性與心肌損害的程度呈正相關(guān)，是臨床判斷心肌損傷的特異性指標(biāo)；堆積的氧自由基使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化物MDA水平升高，體內(nèi)氧自由基清除的抗氧化酶SOD活性下降，因此MDA、SOD是評價過氧化損傷的經(jīng)典指標(biāo)；再灌注損傷時，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致內(nèi)源性NO合成減少，血清NO含有量降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參牡丹皮有效部位提取物各劑量、地奧心血康均能減輕心肌缺血模型大鼠的心肌梗死面積，還可能通過增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過氧化、增加NO水平起作用，減少心肌細(xì)胞的氧化損傷，從而改善心肌功能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，人參牡丹皮有效部位提取物能對抗大鼠血栓形成。三種劑量的實(shí)驗(yàn)研究提示，高、中、低劑量人參牡丹皮有效部位提取物均具有較好的抑制作用，其中高劑量最佳。