本發(fā)明屬于生物涂層材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于骨組織工程支架表面的明膠/羥基磷灰石復合涂層的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著組織工程的發(fā)展，越來越多的生物材料被應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域來修復病損的組織，實現(xiàn)組織再生的功能。目前的組織工程用材料主要為天然高分子材料、合成高分子材料及生物活性陶瓷。其中骨組織工程支架材料是生物材料領(lǐng)域的研究熱點之一。作為骨組織修復重建的組織工程載體材料，要求其具有良好的生物相容性，可控的生物降解性，適當?shù)娜S連通氣孔立體結(jié)構(gòu)，一定的機械強度和良好的細胞親和性。

以聚l-乳酸為主要成分的支架材料，是目前廣泛研究的支架材料，已經(jīng)實現(xiàn)在兔子體內(nèi)植入，但是考慮到高分子材料與骨組織的親和性相對較差，因此本發(fā)明通過涂層的方式來改善其親和性，以滿足臨床醫(yī)學的要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的人工合成骨支架材料存在親和性差的缺點，提供一種用于骨組織工程支架表面的明膠/羥基磷灰石復合涂層的制備方法，實現(xiàn)對骨支架材料的改性。

自然骨組織主要包括以羥基磷灰石（hydroxyapatite）為主要成分的無機相和以膠原（collagen）為主的有機相。羥基磷灰石與骨組織無機成分非常相似，因而具有優(yōu)良的生物活性、生物相容性和骨傳導性，但無機的羥基磷灰石生物材料的力學性能較差，難以替換承力部位的骨缺損，同時僅具有骨傳導性的羥基磷灰石植入骨缺損部位后新骨長入的深度和數(shù)量有限，難以修復大體積或病理狀態(tài)的骨缺損，即骨誘導性比較差。

明膠(gelatin)是皮膚、骨骼、軟骨以及韌帶的膠原部分水解的產(chǎn)物，也是一種蛋白質(zhì)，具有與膠原相同的氨基酸，表現(xiàn)出良好的生物相容性、弱抗原性，同時還具有與細胞較好的粘附作用和骨誘導性，但是它吸收太快而且機械性能較差。將兩者進行復合，即合成復合涂層，可以提高生物相容性、機械性質(zhì)以及骨誘導性。

因此，對骨支架材料表面進行復合涂層（surfacecoating）處理，從而改善骨支架材料的親和性。利用各種成分復合，構(gòu)建具有優(yōu)良性能的生物醫(yī)用材料，將與自然骨組織非常相似的明膠和羥基磷灰石同時引入材料表面，使其兼?zhèn)湓牧虾屯繉硬牧系膬?yōu)勢。

本發(fā)明在合成涂層溶液的時候選用了原位合成的方法，提高了羥基磷灰石的純度，而且顆粒尺寸比較小，有利于羥基磷灰石在明膠上的沉積，并且防止脫落，提高了力學性能；在對聚l-乳酸/β-磷酸三鈣骨支架薄片改性的時候，先進行氨基化，后進行醛化，使其能更好地進行涂層。

本發(fā)明提供的用于骨組織工程支架表面的明膠/羥基磷灰石復合涂層的制備方法，具體步驟如下：

第一步，配制明膠溶液：在45~55℃的溫度下，將明膠溶解于去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為1%~10%的明膠溶液；

第二步，明膠/羥基磷灰石原位合成：選取兩種易溶鹽：鈣鹽和磷酸鹽作為原料，先將鈣鹽溶液加入攪拌的上述明膠溶液中，完畢后，再用分液漏斗將磷酸鹽溶液緩慢滴加到明膠/鈣鹽溶液中，所述鈣鹽和磷酸鹽的摩爾比為（4~5）：3，合成過程中維持反應(yīng)液ph在8-10之間，反應(yīng)溫度控制在45~55℃，滴加完畢；原位合成過程中，進行攪拌，陳化；

第三步，基體材料表面改性：首先對基體材料薄片進行氨基化處理，將清洗過的基體材料薄片浸泡在二銨/異丙醇溶液中，溫度保持在45~55℃；其次進行醛基化處理，將氨基化處理過得基體材料薄片于室溫下浸泡在戊二醛/水溶液中，清洗、干燥，得到改性過的基體材料薄片；

第四步，化學接枝涂層：將改性過的基體材料薄片浸泡在步驟二制備的明膠/羥基磷灰石溶液中12~24h，清洗，干燥，得到所述的明膠/羥基磷灰石復合涂層。

步驟一中，所述的明膠的數(shù)均分子量約為10000~100000。

步驟二中，所述的原位合成法，能夠使羥基磷灰石的顆粒更精細，有利于其更好地與明膠結(jié)合，增加明膠/羥基磷灰石復合涂層的力學性能，防止羥基磷灰石從明膠上脫落。

步驟二中，所述的鈣鹽選自氯化鈣、硝酸鈣中的一種，或其中幾種的混合物。

步驟二中，所述的磷酸鹽選自磷酸二氫鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、磷酸銨中的一種，或其中幾種的混合物。

步驟二中，所述的明膠/羥基磷灰石原位合成的攪拌時間為1~10h。

步驟二中，明膠/羥基磷灰石原位合成的陳化時間為1~24h。

步驟三中，所述的二胺選自n-（2-乙胺基）-1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一種。

步驟三中，所述的支架薄片材料選自選自聚l-乳酸支架（plla）、聚l-乳酸/β-磷酸三鈣復合支架（plla/β-tcp）、聚l-乳酸-羥基乙酸/β-磷酸三鈣復合支架（plga/β-tcp）等人工合成的骨組織工程支架的一種。

步驟三中，所述的二胺/異丙醇溶液濃度為2%~15%。

步驟三中，所述的氨基化處理時間為5~60min。

步驟三中，所述的醛化處理時間為12~24h。

步驟四中，所述的明膠/羥基磷灰石溶液的明膠含量約為3~15mg/ml。

步驟四中，所述的明膠/羥基磷灰石復合涂層的厚度為5~20μm。

本發(fā)明還提供所述明膠/羥基磷灰石復合涂層修飾醫(yī)用介入聚合物器件的制備方法的應(yīng)用，其可廣泛用于生物醫(yī)學領(lǐng)域，特別是可作為一種骨組織工程支架材料。

本發(fā)明的原料和試劑皆市售可得。

本發(fā)明通過化學接枝的方法，可使醫(yī)用介入聚合物器件表面成較為均勻的涂層，增加合成高分子材料與天然高分子的界面相容性，從而改善人工合成的高分子材料與生物組織的親和性差的缺點。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯。

圖1為57306分子量的明膠制備的gel/ha涂層plla/β-tcp薄片的橫截面圖。

圖2為清洗過后、未經(jīng)過處理的plla/β-tcp基體薄片的sem圖。

圖3為氨基化的plla/β-tcp薄片的sem圖。

圖4為經(jīng)過gel/ha化學接枝涂層修飾的plla/β-tcp薄片的sem圖。

圖5為氨基化時間分別為5min、10min、30min、60min的氨基化的plla/β-tcp薄片的傅里葉紅外光譜圖。

圖6為不同分子量明膠制備的gel/ha涂層plla/β-tcp薄片接觸角變化關(guān)系圖。

具體實施方式

下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制，實施例中的原料均為常規(guī)市售產(chǎn)品，其中：

本發(fā)明制備的明膠/羥基磷灰石涂層的骨支架材料，通過傅里葉變換紅外光譜（ftir）、掃描電子顯微鏡（sem）、原子力顯微鏡（afm）、接觸角測試儀對其性能進行測定。

實施例1

將明膠顆粒（約57306分子量）1g加入到去離子水中溶脹2小時，而后加熱至50℃形成2wt%的明膠溶液，等明膠全部溶解后，將25ml的0.2m的cacl2溶液加入明膠溶液中，再用滴液漏斗緩慢滴加0.12m的nah2po4溶液，滴加完畢再在反應(yīng)50℃下攪拌4h，陳化1h，得到混合的明膠溶液。

將裁剪成約為10mm*10mm的plla/β-tcp支架薄片浸泡在20ml乙醇：水（v/v）=1:1中2h，然后用大量水沖洗，將清洗過的薄片浸泡在1,6-己二胺/異丙醇=2.4g/20ml中于45℃下反應(yīng)10min，去離子清洗12h，真空干燥24h，得到氨基化的薄片，然后將其浸泡在10ml1wt%的1,5-戊二醛溶液中，去離子清洗12h，真空干燥得薄片。

配置3mg/ml的混合明膠溶液，將上述薄片浸泡在混合明膠溶液中24h，在蒸餾水中浸泡12h，真空干燥24h，得到明膠/羥基磷灰石涂層的plla/β-tcp支架薄片。

最后得到的涂層厚度約為13μm。

通過掃描電子顯微鏡觀測，plla/β-tcp支架如圖（圖1），氨基化10min的plla/β-tcp支架如圖（圖2），gel/ha涂層修飾的plla/β-tcp支架如圖（圖3），可以觀測到未修飾過的plla/β-tcp支架表面有一些顆粒凸起，這是由于β-tcp摻雜于plla基體中造成的，氨基化10min中后的支架表面可以看到明顯的裂紋，這是由于1,6-己二胺中的氨基與plla中酯基發(fā)生化學反應(yīng)所致。當表面被gel/ha涂層覆蓋后，裂紋消失，且表面相對未修飾的plla/β-tcp薄膜表面更加光滑。

為了探究氨基化時間對其氨基化效果的影響，將清洗過的4片薄片浸泡在1,6-己二胺/異丙醇=2.4g/20ml中于45℃下反應(yīng)5min、10min、30min、60min，然后去離子清洗12h真空干燥12h，得到氨基化的薄片，通過傅里葉紅外光譜（圖4），可以發(fā)現(xiàn)當氨基化時間為10min鐘時，氨基伸縮振動峰的相對強度最強，為最佳氨基化時間。

同時，對薄片進行接觸角測試，發(fā)現(xiàn)plla/β-tcp支架材料的表面接觸角由未修飾之前的82.2°減小到修飾之后48.6°（圖6）。

最后得到的涂層厚度約為15μm。

實施例2

將明膠顆粒（約49317分子量）1g加入到去離子水中溶脹2小時，而后加熱至50℃形成2wt%的明膠溶液，等明膠全部溶解后，將25ml的0.2m的cacl2溶液加入明膠溶液中，再用滴液漏斗緩慢滴加0.12m的nah2po4溶液，滴加完畢再在反應(yīng)50℃下攪拌4h，陳化1h，得到混合的明膠溶液。

將裁剪成約為10mm*10mm的plla/β-tcp支架薄片浸泡在20ml乙醇：水（v/v）=1:1中2h，然后用大量水沖洗，將清洗過的薄片浸泡在1,6-己二胺/異丙醇=2.4g/20ml中于45℃下反應(yīng)10min，去離子清洗12h，真空干燥24h，得到氨基化的薄片，然后將其浸泡在10ml1wt%的1,5-戊二醛溶液中，去離子清洗12h，真空干燥得薄片。

plla/β-tcp支架材料的表面接觸角由未修飾之前的82.2°減小到修飾之后50.4°（圖6）。

最后得到的涂層厚度約為12μm。

實施例3

將明膠顆粒（約38379分子量）1g加入到去離子水中溶脹2小時，而后加熱至50℃形成2wt%的明膠溶液，等明膠全部溶解后，將25ml的0.2m的cacl2溶液加入明膠溶液中，再用滴液漏斗緩慢滴加0.12m的nah2po4溶液，滴加完畢再在反應(yīng)50℃下攪拌4h，陳化1h，得到混合的明膠溶液。

將裁剪成約為10mm*10mm的plla/β-tcp支架薄片浸泡在20ml乙醇：水（v/v）=1:1中2h，然后用大量水沖洗，將清洗過的薄片浸泡在1,6-己二胺/異丙醇=2.4g/20ml中于45℃下反應(yīng)10min，去離子清洗12h，真空干燥24h，得到氨基化的薄片，然后將其浸泡在10ml1wt%的1,5-戊二醛溶液中，去離子清洗12h，真空干燥得薄片。

plla/β-tcp支架材料的表面接觸角由未修飾之前的82.2°減小到修飾之后51.8°（圖6）。

最后得到的涂層厚度約為10μm。

實施例4

將明膠顆粒（約28862分子量）1g加入到去離子水中溶脹2小時，而后加熱至50℃形成2wt%的明膠溶液，等明膠全部溶解后，將25ml的0.2m的cacl2溶液加入明膠溶液中，再用滴液漏斗緩慢滴加0.12m的nah2po4溶液，滴加完畢再在反應(yīng)50℃下攪拌4h，陳化1h，得到混合的明膠溶液。

將裁剪成約為10mm*10mm的plla/β-tcp支架薄片浸泡在20ml乙醇：水（v/v）=1:1中2h，然后用大量水沖洗，將清洗過的薄片浸泡在1,6-己二胺/異丙醇=2.4g/20ml中于45℃下反應(yīng)10min，去離子清洗12h，真空干燥24h，得到氨基化的薄片，然后將其浸泡在10ml1wt%的1,5-戊二醛溶液中，去離子清洗12h，真空干燥得薄片。

plla/β-tcp支架材料的表面接觸角由未修飾之前的82.2°減小到修飾之后54.8°，并且可以發(fā)現(xiàn)，水接觸角的大小與明膠的分子量大小有線性關(guān)系，水接觸角隨著明膠分子量的增大而增大（圖6）。

最后得到的涂層厚度約為8μm。

實施例5

將明膠顆粒（約57306分子量）1g加入到去離子水中溶脹2小時，而后加熱至50℃形成2wt%的明膠溶液，等明膠全部溶解后，將25ml的0.2m的ca(no3)2溶液加入明膠溶液中，再用滴液漏斗緩慢滴加0.12m的na3po4溶液，滴加完畢再在反應(yīng)50℃下攪拌4h，陳化1h，得到混合的明膠溶液。

將裁剪成約為10mm*10mm的plla支架薄片浸泡在20ml乙醇：水（v/v）=1:1中2h，然后用大量水沖洗，將清洗過的薄片浸泡在1,6-己二胺/異丙醇=2.4g/20ml中于45℃下反應(yīng)10min，去離子清洗12h，真空干燥24h，得到氨基化的薄片，然后將其浸泡在10ml1wt%的1,5-戊二醛溶液中，去離子清洗12h，真空干燥得薄片。

最后得到的涂層厚度約為15μm。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施案例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。