本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含pi3k抑制劑和perk抑制劑的藥物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是僅次于心血管疾病的高死亡率疾病，全球癌癥患者和死亡病例都在不斷地增加。新增癌癥病例有近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國，中國新增癌癥病例高居世界第一位。尤其是在肝癌、食管癌、胃癌和肺癌等4種惡性腫瘤中，中國新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。這些癌癥的治療雖然以手術(shù)為主，但由于早期患者一般無明顯癥狀，在首次被確診的癌癥患者中，很多已為中晚期，失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，故非手術(shù)治療在腫瘤的綜合治療中有著十分重要的地位。其中，化療無論是術(shù)前化療、術(shù)后輔助化療還是姑息性化療，在綜合治療中占據(jù)舉足輕重的地位。目前常用的化療藥物多以長春瑞濱、紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶為主，其產(chǎn)生的化療反應(yīng)，如惡心嘔吐較強(qiáng)烈以及對肝腎功能和骨髓損害等，一定程度上限制了其應(yīng)用。

在復(fù)雜的酪氨酸激酶信號調(diào)節(jié)網(wǎng)路中，pi3k/akt/m-tor通路是至關(guān)重要的調(diào)控體系，它和細(xì)胞的增殖、分化、存活、凋亡、遷移、侵襲、信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和翻譯、血管生長、膜通透、糖轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)突生長、膜皺熠、超氧化產(chǎn)生、肌動(dòng)蛋白重組和趨化作用中起到關(guān)鍵的作用。愈來愈多的研究結(jié)果證明，活化的pi3k/akt/m-tor通路在人類腫瘤中出現(xiàn)的頻率最高。據(jù)估計(jì)，在30-50％的所有人類癌癥中(包括肺癌、前列腺癌、乳癌、腦癌、腎癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌和淋巴瘤)發(fā)生了腫瘤抑制基因pten(其為pi(3，4，5)p3磷酸酶和pi3k信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)劑)的遺傳缺失。另外，已將pi3k表達(dá)的升高與肺癌、卵巢癌和胰腺癌聯(lián)系起來，這些結(jié)果表明，pi3k酶的小分子抑制劑可能具有治療各種形式的癌癥的潛在價(jià)值。ly294002是首個(gè)合成的已知抑制pi3kα/δ/β的小分子，在溶液中比在wortmannin中穩(wěn)定，且能夠阻斷自噬體的形成。dactolisib(bez235，nvp-bez235)是一種雙重atp競爭性pi3k和mtor抑制劑，目前正在進(jìn)行ⅱ期臨床試驗(yàn)。pictilisib(gdc-0941)是一種口服有效且特異性的pi3k抑制劑，目前正在進(jìn)行ⅱ期臨床試驗(yàn)。buparlisib(bkm120，nvp-bkm120)是一種選擇性的pi3k抑制劑，目前正在進(jìn)行ⅱ期臨床試驗(yàn)。

已有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在不同腫瘤中激活。perk/eif2α通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游的重要傳感通路。蛋白激酶r樣內(nèi)酯(perk)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種ⅰ型跨膜蛋白，屬于eif2α上游激酶家族中的一種。perk通過寡聚化和自身磷酸化活化，導(dǎo)致其下游因子真核翻譯起始因子2α亞單位(eif2α)磷酸化，磷酸化的eif2α可直接抑制蛋白合成，致使新生的多肽流出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以減輕其負(fù)擔(dān)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡。體外研究發(fā)現(xiàn)將perk/eif2α通路敲除后，細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致凋亡敏感性增加，而增強(qiáng)perk/eif2α通路，細(xì)胞凋亡減少，證明抑制perk/eif2α通路可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。gsk2656157是一種atp競爭性的高選擇性perk抑制劑。gsk2606414是一種口服具有生物活性的、有效的、選擇性perk抑制劑。isrib(trans-isomer)，反式異構(gòu)體isrib，是一種高度選擇性perk抑制劑，通過抑制雌激素受體的平衡來抑制perk信號通路來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的平衡，降低面對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的細(xì)胞的存活率。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，腫瘤分子靶向治療已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，在多種腫瘤的治療中發(fā)揮了重要的作用。然而，大部分腫瘤的生物學(xué)行為并非由單一信號傳導(dǎo)通路所支配，而是多個(gè)信號傳導(dǎo)通路共同起作用的，因此聯(lián)合用藥針對多靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療將不僅旨在減少或延緩耐藥性的出現(xiàn)、降低毒性，而且通過多種藥物對癌細(xì)胞殺傷的協(xié)同作用取得更好的療效。目前，沒有關(guān)于pi3k抑制劑和perk抑制劑聯(lián)合用藥用于抗腫瘤的相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種藥物組合物及其在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，具體涉及含有pi3k抑制劑和perk抑制劑的藥物組合物及其在制備治療肺癌、肝癌、食管癌、腸癌、胃癌、腦瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含有pi3k抑制劑和perk抑制劑。

其中，所述的pi3k抑制劑選自ly294002、dactolisib(bez235，nvp-bez235)、pictilisib(gdc-0941)或buparlisib(bkm120，nvp-bkm120)。

所述的perk抑制劑選自gsk2656157、gsk2606414或isrib(trans-isomer)。

優(yōu)選地，所述的pi3k抑制劑為ly294002。

優(yōu)選地，所述的perk抑制劑為gsk2656157。

優(yōu)選地，所述的藥物組合物包含有l(wèi)y294002和gsk2656157。

進(jìn)一步地，所述的藥物組合物中l(wèi)y294002和gsk2656157的摩爾濃度比為0～50:1～10。

優(yōu)選地，所述的藥物組合物中l(wèi)y294002和gsk2656157的摩爾濃度比為20:5。

此外，本發(fā)明還請求保護(hù)上述的藥物組合物在制備防治腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤包括但不限于肺癌、肝癌、食管癌、腸癌、胃癌、腦瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌。

優(yōu)選地，本發(fā)明請求保護(hù)上述的藥物組合物在制備防治肺癌、肝癌、食管癌藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述的藥物組合物可配以藥學(xué)可接受的添加劑制成注射制劑或口服制劑，優(yōu)選注射制劑，尤其是靜脈注射制劑。

pi3k/akt/m-tor通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該通路的激活與腫瘤的產(chǎn)生有關(guān)。m-tor是pi3k/akt的下游產(chǎn)物，可通過改變p70s6k的磷酸化狀態(tài)啟動(dòng)翻譯過程。p70s6k的磷酸化可促使40s核糖體蛋白s6磷酸化而啟動(dòng)翻譯，促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生。本發(fā)明人以ly294002單獨(dú)處理食管癌細(xì)胞株eca-109細(xì)胞，利用westernblot方法檢測pi3k通路下游靶點(diǎn)蛋白s6的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ly294002可明顯抑制癌細(xì)胞pi3k通路下游靶點(diǎn)蛋白s6的磷酸化水平，而s6本底蛋白變化并不明顯，這說明ly294002在腫瘤細(xì)胞中能顯著抑制pi3k通路的活化，從而發(fā)揮抗腫瘤效果。

一方面，本發(fā)明人分別考察食管癌細(xì)胞eca-109、ec9706、肺癌細(xì)胞a549、肝癌細(xì)胞hepg2和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞huvec對ly294002和gsk2656157單獨(dú)使用的藥物敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ly294002與gsk2656157單獨(dú)使用對腫瘤細(xì)胞均顯示一定的生長抑制作用，同時(shí)對正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性均相對較小，安全性高。

另一方面，本發(fā)明人還考察了ly294002與gsk2656157聯(lián)合用藥對食管癌細(xì)胞eca-109、ec9706、肺癌細(xì)胞a549、肝癌細(xì)胞hepg2和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞huvec生長抑制和促進(jìn)凋亡的影響。結(jié)果顯示，ly294002與gsk2656157聯(lián)合用藥能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)凋亡，效果顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥，均顯示出較佳的協(xié)同作用。同時(shí)對人正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞顯示出較低的毒性。

此外，ly294002與gsk2656157聯(lián)合用藥對食管癌細(xì)胞eca-109、ec9706的細(xì)胞克隆形成的影響試驗(yàn)顯示聯(lián)合用藥對細(xì)胞克隆形成具有明顯的協(xié)同抑制作用，聯(lián)合用藥組細(xì)胞克隆數(shù)量以及克隆大小均為最小，再次證明，ly294002與gsk2656157組合用藥顯著提高對腫瘤的防治效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

本發(fā)明提供一種用于防治腫瘤的藥物組合物，具體為將pi3k抑制劑和perk抑制劑組合使用，更具體為以ly294002與gsk2656157聯(lián)合用藥，為腫瘤患者提供一種新的治療方案，所述的ly294002與gsk2656157在單獨(dú)使用時(shí)，均對腫瘤細(xì)胞的生長有一定抑制作用。聯(lián)合用藥后，該類藥物組合物能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)凋亡、抑制細(xì)胞集落形成，效果顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥，具有良好的協(xié)同效應(yīng)。此外，該藥物組合物對人正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較低的毒性，同時(shí)對腫瘤細(xì)胞具備良好的抑制作用，有望最終提高治療癌癥的效果，可應(yīng)用于制備抗腫瘤的藥物領(lǐng)域。

附圖說明

圖1ly294002與gsk2656157單獨(dú)使用對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞生長的影響。

圖2ly294002對pi3k通路下游靶點(diǎn)蛋白s6的影響。

圖3ly294002與gsk2656157聯(lián)合使用對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞生長的影響。

圖4ly294002與gsk2656157聯(lián)合使用對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。

圖5ly294002與gsk2656157聯(lián)合使用對腫瘤細(xì)胞克隆形成的影響。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1ly294002與gsk2656157單獨(dú)使用對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞生長的影響

首先檢測食管癌細(xì)胞eca-109、ec9706、肺癌細(xì)胞a549、肝癌細(xì)胞hepg2和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞huvec對ly294002與gsk2656157單獨(dú)使用的藥物敏感性。

1、實(shí)驗(yàn)方法

將細(xì)胞以每孔3000-6000個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁(24h)后，將ly294002與gsk2656157藥物稀釋成一定的梯度濃度，每濃度設(shè)5復(fù)孔，分實(shí)驗(yàn)組及調(diào)零組加藥。48h后采用mtt法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，每孔加入10μlmtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸除孔內(nèi)液體，避免接觸孔內(nèi)結(jié)晶物，每孔加入100μl的dmso，于恒速搖床上避光搖晃。待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上讀取od值(波長570nm，參考波長630nm)，測得吸光度a值。細(xì)胞活力(cellviability)的計(jì)算公式為：細(xì)胞活力＝od實(shí)驗(yàn)組/od對照組，結(jié)果見圖1。

如圖1所示，ly294002與gsk2656157對腫瘤細(xì)胞均具有一定的生長抑制作用，其中l(wèi)y294002在20μm對四株腫瘤細(xì)胞eca-109，ec9706，a549，hepg2和正常細(xì)胞huvec的存活率分別為51％，68％，65％，70％和86％，而gsk2656157在5μm的存活率分別為60％，76％，74％，73％和95％，表明，ly294002與gsk2656157在抑制腫瘤細(xì)胞生長的同時(shí)對正常細(xì)胞的毒性相對較小。

實(shí)施例2ly294002對pi3k通路下游靶點(diǎn)蛋白s6的影響

將eca-109細(xì)胞分別以每孔4×10⁵個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板。待細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞分別經(jīng)ly294002處理0、1、3、6h后，利用westernblot方法檢測pi3k通路下游靶點(diǎn)蛋白s6的表達(dá)情況。westernblot實(shí)施方法為：分別收取各組細(xì)胞全蛋白。先經(jīng)sds電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉1h，孵育所需檢測的蛋白相對應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。24h回收一抗，用tbst清洗3次，每次5min，之后孵育二抗，室溫孵育1h。后用tbst清洗3次，每次5min，之后ecl顯影，結(jié)果見圖2。

如圖2所示，在eca-109細(xì)胞中，當(dāng)用ly294002分別處理0、1、3、6h后，pi3k通路下游靶點(diǎn)蛋白s6的磷酸化水平受到明顯抑制，而s6本底蛋白變化并不明顯，這說明ly294002在腫瘤細(xì)胞中能顯著抑制pi3k通路的活化。

實(shí)施例3ly294002與gsk2656157聯(lián)合作用對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的影響

將腫瘤eca-109、ec9706、a549和hepg2細(xì)胞和huvec正常血管內(nèi)皮細(xì)胞以每孔3000-6000個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入對照組、20μmly294002、5μmgsk2656157及聯(lián)合用藥組藥物；此外，另鋪eca-109細(xì)胞株于96孔板中，分組如下：對照組、0.5μg/ml順鉑組(gddp)、5μmgsk2656157組及、0.5μg/ml順鉑(gddp)與5μmgsk2656157聯(lián)合用藥組、2μg/ml5-氟尿嘧啶組(5-fu)及2μg/ml5-氟尿嘧啶組(5-fu)與5μmgsk2656157聯(lián)合用藥組；培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl濃度為5mg/ml的mtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄去培養(yǎng)液每孔加入100μl的dmso，于恒速搖床上避光搖晃。待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上讀取od值(波長570nm，參考波長630nm)，讀取每孔的吸光值，計(jì)算兩藥合用后的細(xì)胞存活及抑制率。

采用金氏修正式評價(jià)兩種藥物聯(lián)合用藥時(shí)對腫瘤細(xì)胞的聯(lián)用效果，具體步驟為，按照生長抑制率＝(1-od實(shí)驗(yàn)組/od對照組)的公式，計(jì)算出a藥在某種條件下對腫瘤細(xì)胞的抑制率為ea，計(jì)算出b藥在某種條件下對腫瘤細(xì)胞的抑制率為eb，再計(jì)算出兩者聯(lián)合給藥的抑制率為ec，通過以下公式計(jì)算聯(lián)合用藥指數(shù)q值，q＝ec/(eb+ea-eb*ea)，當(dāng)q值>1.15為協(xié)同效應(yīng)，0.85<q<1.15為相加效應(yīng)，q<0.85為拮抗效應(yīng)。通過上述聯(lián)合用藥指數(shù)的計(jì)算進(jìn)一步判斷兩種藥物聯(lián)合用藥的最終藥效，結(jié)果見圖3。

如圖3所示，ly294002與gsk2656157聯(lián)合用藥在eca-109，ec9706，a549和hepg2腫瘤細(xì)胞中的q值分別為1.07，1.27，1.20，1.16；順鉑(gddp)與gsk2656157聯(lián)合用藥在eca-109細(xì)胞中的q值為0.71；5-氟尿嘧啶(5-fu)與gsk2656157聯(lián)合用藥在eca-109細(xì)胞中的q值為0.76；這些表明20μmly294002與5μmgsk2656157在腫瘤細(xì)胞中聯(lián)合使用具有很好的協(xié)同效果，而對正常huvec細(xì)胞的毒性較小，并且ly294002與gsk2656157聯(lián)用效果強(qiáng)于臨床一線藥物順鉑(gddp)、5-氟尿嘧啶(5-fu)與gsk2656157。

實(shí)施例4ly294002與gsk2656157聯(lián)合作用對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

將eca-109細(xì)胞分別以每孔2×10⁵個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板。待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)施例2分組給藥，共同處理48h后。利用westernblot方法檢測經(jīng)ly294002與gsk2656157分別單獨(dú)處理及聯(lián)合處理后食管癌細(xì)胞eca-109細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白parp的表達(dá)情況。westernblot方法按照實(shí)施例2進(jìn)行，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，在eca-109細(xì)胞中，當(dāng)用ly294002與gsk2656157單獨(dú)及聯(lián)合用藥處理時(shí)，凋亡標(biāo)志蛋白parp的剪切條帶明顯上調(diào)，并且聯(lián)合組與各個(gè)單藥組相比表達(dá)具有明顯的差異，這說明ly294002與gsk2656157聯(lián)合用藥能夠顯著引起食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

實(shí)施例5ly294002與gsk2656157聯(lián)合作用對腫瘤細(xì)胞克隆形成的影響

將食管癌細(xì)胞eca-109和ec9706接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁過夜后，加入對照組、20μmly294002、5μmgsk2656157及聯(lián)合用藥組藥物，孵育7天，檢測細(xì)胞平板克隆形成情況，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，與對照組以及單藥組相比，ly294002與gsk2656157聯(lián)合用藥對細(xì)胞克隆形成具有明顯的協(xié)同抑制作用，聯(lián)合用藥組細(xì)胞克隆數(shù)量以及克隆大小均為最小，表明ly294002與gsk2656157組合用藥顯著提高對腫瘤的防治效果。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。