本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術領域，具體涉及一種免疫增強抗腫瘤膠原組合物、制備方法及其應用，該組合物能用于腫瘤預防、腫瘤術后防復發(fā)或延長腫瘤患者的生存期。
背景技術：
惡性腫瘤已成為威脅人類健康和生命的“第一殺手”，在人類死亡原因中，因患惡性腫瘤致死的病例已上升到首位。全世界每年大約有870萬人患腫瘤，死亡約690萬人，僅我國每年就有105萬人死于晚期惡性腫瘤。目前治療惡性腫瘤的方法十分有限，而腫瘤疫苗，是繼手術切除、化療、放療等手段的另一種免疫治療方案，包括治療性和預防性疫苗。腫瘤疫苗包括腫瘤細胞疫苗、病毒疫苗、腫瘤抗原及抗原分子類疫苗、重組病毒、病菌疫苗、dna疫苗、樹突狀細胞疫苗、熱休克蛋白－多肽復合物疫苗等。
腫瘤細胞疫苗是研究、運用最早的腫瘤疫苗，是將整個腫瘤細胞作為抗原導入患者體內，經樹突狀細胞(dc)提呈免疫細胞，誘導特異性的抗腫瘤免疫應答。由于腫瘤細胞帶有腫瘤的全部抗原，無需考慮分離腫瘤特異性抗原，而且由于自體腫瘤細胞具有和正常組織相同的人類白細胞抗原，不會引發(fā)機體強烈的免疫排斥反應。但是腫瘤能在人體內發(fā)生并持續(xù)生長，因其具有多重免疫逃逸機制，如免疫原性低下、缺少刺激粘附分子、抗原呈遞效率低下等等。因此，為提高腫瘤細胞免疫效果，應在疫苗中加入免疫增強劑，與抗原合并使用能增強抗原免疫性，提高腫瘤疫苗形成抗體的成功率。目前被fda批準用于人體免疫的增強劑只有鋁鹽佐劑，而該佐劑由于材料的高度異質性，生產過程也難以實現(xiàn)統(tǒng)一標準，皮下注射易引起嚴重反應(如出現(xiàn)紅斑、皮下結節(jié)、接觸性過敏和肉芽腫性炎癥)。因此，免疫增強劑還可以從新材料中尋找更安全、更有效的替代品。
細胞外基質材料是一種潛在的生物型免疫增強劑材料，因此其本身在動物體內可以起到調控細胞微環(huán)境的作用，從而促進細胞相互作用、血管化及免疫反應。免疫原去除小腸粘膜下層(sis)材料是在臨床上廣泛應用于腹壁、泌尿道、硬腦膜、血心管修復等軟組織缺損修復、加固的生物醫(yī)用材料。本身基質中除了i型膠原蛋白的主要成分，還含有糖胺聚糖、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白、堿性纖維生長因子、血管內皮生長因子等生物因子，具有良好的生物相容性，可以促進缺損組織修復、血管化及功能重建。最為關鍵的是sis材料與吞噬樹突狀細胞(dc)具有高度親和性，而后者為最有效的抗原提呈細胞(apc)。另外sis材料植入體內所激發(fā)的免疫反應主要為th2通路，實現(xiàn)材料與宿主組織的整合與重建，而抑制th1通路介導的促炎癥反應。因此，sis材料可以作為安全、可降解、高效的免疫增強劑，與腫瘤疫苗復合后作為免疫整體，用于腫瘤預防、腫瘤術后防復發(fā)或延長腫瘤患者的生存期。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種免疫增強抗腫瘤膠原組合物，該組合物采用sis材料作為生物免疫增強劑，增強腫瘤細胞疫苗的免疫反應，用于腫瘤預防、腫瘤術后防復發(fā)或延長腫瘤患者的生存期。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：一種免疫增強抗腫瘤膠原組合物，其特征在于：所述的組合物包含抗腫瘤因子、膠原蛋白、多糖物質和活性因子。
所述組合物以動物小腸粘膜下層組織材料制成。
所述動物為哺乳動物，優(yōu)選豬或牛。
所述抗腫瘤因子為滅活后腫瘤細胞疫苗。
所述腫瘤細胞包括乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、頭、頸部鱗狀細胞癌、子宮頸癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、急性髓性白血病、骨髓瘤、食管鱗狀細胞癌、淋巴瘤細胞或它們的組合。
所述滅活方式為紫外線法、熱滅活法、深冷凍融法、戊二醛法或它們的組合。
所述的膠原蛋白為包含i型、iii型、iv型和vi型膠原蛋白的組合物。
所述的多糖物質為包含硫酸軟骨素和透明質酸的組合物。
所述的活性因子為包含纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素及生長因子的組合物。
所述組合物是可體內降解的片狀或顆粒狀組合物。
所述組合物的體內降解時間為1-3個月。
所述的免疫增強抗腫瘤膠原組合物片狀形態(tài)為：長1-10cm，寬1-10cm，厚度0.1-1mm。
所述的免疫增強抗腫瘤膠原組合物顆粒狀粒徑為500μm以下。該顆粒尺寸用于注射。
本發(fā)明還提供一種免疫增強抗腫瘤膠原組合物的制備方法，其特征在于：采用動物小腸粘膜下層組織作為原料，依次通過組織前置處理、病毒滅活、免疫原消除、冷凍干燥、滅菌解析、腫瘤細胞培養(yǎng)、腫瘤細胞滅活、冷凍干燥、成型和滅菌解析；獲得清除動物源病毒風險、細胞成分、dna成分和α-gal抗原，保留細胞外基質成分的物質，然后與抗腫瘤因子復合為組合物。
本發(fā)明上述的免疫增強抗腫瘤膠原組合物的制備方法，具體的步驟包括：
(1)組織前置處理：取動物小腸粘膜下層組織材料，清洗并將水濾干；
(2)病毒滅活：采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡動物小腸粘膜下層組織材料進行病毒滅活，然后進行超聲清洗；
(3)免疫原去除：免疫原去除液采用加入胰蛋白酶和edta的pbs溶液，免疫原去除過程在多頻超聲裝置中進行，然后進行超聲清洗；得到動物小腸粘膜下層基質材料；
(4)冷凍干燥：將一層或多層動物小腸粘膜下層基質材料固定于模具上，將模具放置于真空冷凍干燥機中進行真空冷凍干燥；
(5)滅菌解析：采用環(huán)氧乙烷進行滅菌，并進行解析；
(6)腫瘤細胞培養(yǎng)：取自體或同種異體腫瘤切除組織，在mem培養(yǎng)基中剪碎，體外培養(yǎng)傳代后，分散為單個細胞，配制細胞培養(yǎng)液，向從步驟(4)得到的動物小腸粘膜下層基質材料上滴加細胞培養(yǎng)液；然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(7)腫瘤細胞滅活：腫瘤細胞培養(yǎng)完成后，將動物小腸粘膜下層基材料與腫瘤細胞一同從培養(yǎng)基中取出，得到復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物。
進一步地，本發(fā)明還可以包括以下步驟：將由步驟(7)得到的復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物放入冷凍干燥裝置中凍干。得到片狀復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物。
進一步地，本發(fā)明還可以包括以下步驟：采用液氮破碎裝置將片狀復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物研磨破碎；然后進行過篩，得到粉狀復合免疫增強劑腫瘤疫苗材料。
進一步地，本發(fā)明還可以包括以下步驟：將由片狀組合物或粉狀組合物最后滅菌解析。
本發(fā)明步驟(2)的過氧乙酸-乙醇溶液，其中過氧乙酸的體積百分比濃度為0.1％-5％、乙醇的體積百分比濃度為5％-40％，過氧乙酸-乙醇溶液與動物小腸粘膜下層組織材料的體積比為(3-20)︰1，滅活時間2-4小時，溫度范圍為10-40℃。采用ph6-8中的pbs溶液超聲處理，溫度10-40℃，溶液與動物小腸粘膜下層組織材料體積比為20：1至40：1之間，每次10-30分鐘；清洗2-4次；然后采用純化水超聲清洗，溫度范圍為10-40℃，純化水與動物小腸粘膜下層組織材料比例為20：1至40：1之間，檢測電導率為10μs/cm以下終止。超聲裝置頻率優(yōu)選40khz，功率優(yōu)選3000w以上。
本發(fā)明步驟(3)中的免疫原去除液包括：胰蛋白酶、edta和ph值為6-8的pbs溶液；所述免疫原去除液中胰蛋白酶質量百分比濃度為0.01-0.2％，edta的濃度為0.1-1mmol/l；進一步包括：免疫原去除液中胰蛋白酶的質量百分比濃度為0.02-0.05％，edta的濃度為0.4-0.8mmol/l，免疫原去除液ph值為7.0-8.0，優(yōu)選為7.2-7.5；所述免疫原去除液與小腸粘膜下層組織材料體積比為(20-40)︰1；所述超聲裝置至少具有兩個超聲頻率，其中低頻頻率范圍為20-40khz，高頻頻率為60-90khz，其中低頻處理5-40min，高頻處理5-40min，溫度范圍為20-35℃。
步驟(4)中的冷凍干燥包括：預凍至-45℃，保溫1-2小時，然后調節(jié)溫度至-15℃，保溫5-7小時，再調節(jié)溫度至0℃，保溫2-5小時，最后調節(jié)溫度至25℃，保溫3-8小時。
步驟(5)中的滅菌解析包括：采用環(huán)氧乙烷進行滅菌，滅菌條件為：在溫度20-40℃保溫，然后通入環(huán)氧乙烷滅菌；解析過程在通風的解析室中進行，溫度控制在20℃之間，時間14天。
步驟(6)中的腫瘤細胞培養(yǎng)包括：取自體或同種異體腫瘤切除組織，在mem培養(yǎng)基中剪碎，體外培養(yǎng)傳代后，分散為單個細胞，進行細胞計數(shù)，配制(1.0-10.0)×106個/ml細胞培養(yǎng)液，向動物小腸粘膜下層基質材料滴加細胞培養(yǎng)液；然后在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-28天，每隔一天換一次液。
步驟(7)中的腫瘤細胞滅活包括：腫瘤細胞培養(yǎng)完成后，將動物小腸粘膜下層基質材料與腫瘤細胞一同從培養(yǎng)基中取出，使用清洗液清洗，清洗液為ph6-8的pbs溶液，pbs溶液溫度為20-40℃，pbs溶液與復合材料(動物小腸粘膜下層基質材料與腫瘤細胞)的比例(體積比)為20-40︰1，多次清洗。清洗后可采用-80℃深冷凍融滅活腫瘤細胞，或者可采用紫外線法、熱滅活法或戊二醛法進行細胞滅活，得到復合免疫增強劑腫瘤疫苗材料。
進一步地，本發(fā)明還可以包括以下步驟：將由步驟(7)得到的復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物放入冷凍干燥裝置中凍干，包括：預凍至-45℃，保溫1-2小時，然后調節(jié)溫度至-15℃，保溫5-7小時，再調節(jié)溫度至0℃，保溫2-5小時，最后調節(jié)溫度至25℃，保溫3-8小時。得到片狀復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物。
進一步地，本發(fā)明還可以包括以下步驟：片狀復合免疫增強劑腫瘤疫苗材料切碎或剪碎，在進一步用低溫破碎裝置研磨破碎，在研磨破碎過程中將液氮與被切碎或剪碎的材料送入低溫破碎裝置中進行破碎，然后使破碎后的顆粒通過篩網，篩選500μm以下的顆粒，得到粉狀組合物。
進一步地，本發(fā)明還可以包括以下步驟：將片狀組合物或粉狀組合物最后滅菌解析，具體的滅菌解析步驟包括：采用環(huán)氧乙烷進行滅菌，滅菌條件為：在溫度20-40℃保溫，然后通入環(huán)氧乙烷滅菌；解析過程在通風的解析室中進行，溫度控制在20℃之間，時間14天。
其中步驟(7)的滅活方式可以采用深冷凍融法、紫外線法、熱滅活法或戊二醛法的組合來進行。
所述腫瘤細胞滅活步驟為將免疫原去除基質與腫瘤細胞一同從培養(yǎng)基中取出，使用清洗液清洗后，滅活(包括但不限于紫外線、熱滅活、深冷凍融、戊二醛等物理化學方法)腫瘤細胞。
本發(fā)明進一步提供上述免疫增強抗腫瘤膠原組合物的應用方法，具體為：通過植入或注射方式進入體內，通過激發(fā)增強免疫反應提高人體對腫瘤細胞殺滅能力。
本發(fā)明上述免疫增強抗腫瘤膠原組合物，所述的片狀組合物用于皮下、肌肉植入，所述的顆粒狀組合物用于皮下、肌肉植入或注射。
本發(fā)明上述免疫增強抗腫瘤膠原組合物，可預防腫瘤形成、生長、復發(fā)，延長腫瘤患者腫瘤切除后的生存期。
本發(fā)明上述免疫增強抗腫瘤膠原組合物，可應用于但不限于用于治療乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、頭、頸部鱗狀細胞癌、子宮頸癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、急性髓性白血病、骨髓瘤、食管鱗狀細胞癌和淋巴瘤等的細胞中。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點和有益效果：
(1)滅活腫瘤細胞疫苗技術：通過物理、化學方法滅活腫瘤細胞，使腫瘤細胞喪失侵染能力，但是保留腫瘤細胞生理特征，增強人體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞識別能力；
(2)免疫增強機制：將滅活腫瘤細胞作為抗原物質，與sis膠原組合物配伍使用，強化人體免疫反應，增強抗原提呈細胞識別腫瘤細胞能力；
(3)酶法細胞洗脫工藝：本發(fā)明采用更溫和的胰蛋白酶和edta復合溶液以及雙頻超聲處理相配合進行脫細胞處理，這一步驟是制造生物材料很重要的一個環(huán)節(jié)，只有將作為免疫原的細胞含量降至極低或完全去除，植入體內的材料才不會引發(fā)免疫反應，從而保證了材料的安全性；采用胰蛋白酶和edta使細胞與細胞外基質之間的連接被破壞，然后采用低頻超聲對細胞進行破碎，同時使用高頻超聲作用于破碎的細胞及細胞外基質，進一步使細胞脫離細胞外基質，從而達到脫細胞目的，針對脫細胞的各個環(huán)節(jié)采用對應的方法進行細節(jié)上的處理，使脫細胞效果更好，細胞殘留更低；脫除細胞過程溫和，減少對基質結構的破壞，保留基質中的活性生長因子；
(4)高效破碎技術：低溫超高速剪切破碎技術，保護膠原蛋白、生物因子成分不受破壞；
(5)可降解吸收：體內可降解，降解過程可控，作用周期長；
(6)一種新型復合免疫增強劑腫瘤疫苗，包括腫瘤疫苗與免疫增強劑，增強腫瘤細胞疫苗的免疫反應，用于腫瘤預防、腫瘤術后防復發(fā)或延長腫瘤患者的生存期。
具體實施方式
以下結合實施例對本發(fā)明作進一步具體描述，但不局限于此。
本發(fā)明中注射用水的使用標準依照國家藥典中規(guī)定。
本發(fā)明所述小腸粘膜下層組織材料取自哺乳動物，豬小腸粘膜下層組織材料(sis)或牛小腸粘膜下層組織材料均適用于本發(fā)明的實施例。
實施例1：
本實施例免疫增強抗腫瘤膠原組合物，通過以下步驟制備而成：
(1)組織前置處理：
取小腸粘膜下層組織材料分割成寬10cm，長15cm的規(guī)定尺寸，剔除淋巴組織，用自來水沖洗3次，再用純化水沖洗至表面無污漬，然后放置于不銹鋼濾網等濾水裝置上，靜置5分鐘以上，將水濾干。
(2)病毒滅活：
采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡小腸粘膜下層組織材料進行病毒滅活，該過程可在不銹鋼桶中進行。過氧乙酸-乙醇溶液中過氧乙酸的體積百分比濃度為1％、乙醇的體積百分比濃度為24％，過氧乙酸-乙醇溶液與小腸粘膜下層組織材料的體積比為6︰1，滅活時間2小時，溫度范圍為20℃。然后在超聲裝置中分別用pbs和純化水清洗，其中采用ph7的pbs溶液超聲處理，溫度25℃，溶液與動物小腸粘膜下層組織材料體積比為30:1，每次10分鐘；清洗3次；然后采用純化水超聲清洗，溫度范圍為25℃，純化水與動物小腸粘膜下層組織材料比例為30:1，檢測電導率為10μs/cm以下終止。超聲裝置頻率優(yōu)選45khz，功率3000w。
(3)免疫原去除：
免疫原去除液采用加入胰蛋白酶和edta的ph7的pbs溶液，其中胰蛋白酶的質量百分比濃度為0.025％和edta質量百分比濃度為0.02％，免疫原去除液與小腸粘膜下層組織材料混合體積比為30︰1，免疫原去除過程在至少包括兩個超聲頻率的超聲波裝置中進行，其中低頻頻率范圍為24khz，高頻頻率為80khz，其中低頻處理10min，高頻處理15min，溫度為25℃，超聲波功率至少在5000w以上。然后在超聲裝置中分別用pbs和純化水清洗，其中采用ph7的pbs溶液超聲處理，溫度25℃，溶液與動物小腸粘膜下層組織材料體積比為30:1，每次10分鐘；清洗3次；然后采用25℃注射用水超聲清洗，溫度范圍為25℃，注射用水與動物小腸粘膜下層組織材料比例為30:1，檢測清洗后注射用水與清洗前注射用水電導率差為1μs/cm以下終止。超聲裝置頻率優(yōu)選45khz，功率3000w。得到小腸粘膜下層基質材料。
(4)冷凍干燥：
將一層或多層小腸粘膜下層基質材料固定于模具(模具結構可以參考發(fā)明專利zl201310203588.6和zl201310203602.2)上，將模具平鋪于真空冷凍干燥機中，關閉凍干室的門，打開循環(huán)泵約1min，開啟壓縮機對凍干箱致冷，將步驟(6)模具連同材料預凍至-45℃，保溫2小時，然后開啟真空泵，調節(jié)溫度至-15℃，保溫7小時，再調節(jié)溫度至0℃，保溫2小時，最后調節(jié)溫度至25℃，保溫4小時，真空冷凍干燥完成。
(5)滅菌解析：
采用環(huán)氧乙烷進行滅菌，滅菌條件為：先溫度40℃保溫4小時，濕度30-70％，然后通入濃度400mg/l環(huán)氧乙烷，滅菌6小時；解析過程在通風的解析室中進行，溫度控制在20℃之間，時間14天。
(6)腫瘤細胞培養(yǎng)：
取自體或同種異體腫瘤切除組織，在mem培養(yǎng)基中剪碎，體外培養(yǎng)傳代后，分散為單個細胞，進行細胞計數(shù)，配制(1.0-10.0)×106個/ml細胞培養(yǎng)液，按每2×2cm2步驟(4)所得小腸粘膜下層基質材料滴加1ml細胞培養(yǎng)液的比例滴加細胞培養(yǎng)液；然后在體積百分比濃度5％二氧化碳培養(yǎng)箱中保持37℃培養(yǎng)3-28天，每隔一天換一次液。
(7)腫瘤細胞滅活：
腫瘤細胞培養(yǎng)完成后，將小腸粘膜下層基質材料與腫瘤細胞一同從培養(yǎng)基中取出，使用清洗液清洗，清洗液為ph6-8的pbs溶液，pbs溶液溫度為40℃，pbs溶液與復合材料(小腸粘膜下層基質材料與腫瘤細胞)的比例(體積比)為30︰1，清洗3次，每次30min。清洗后采用-80℃深冷凍融滅活腫瘤細胞，得到復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物。
進一步地，本實施方式還可以包括以下步驟：將由步驟(7)得到的復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物放入冷凍干燥裝置中凍干，包括：預凍至-45℃，保溫1-2小時，然后調節(jié)溫度至-15℃，保溫5-7小時，再調節(jié)溫度至0℃，保溫2-5小時，最后調節(jié)溫度至25℃，保溫3-8小時。得到片狀復合免疫增強劑腫瘤疫苗組合物。
進一步地，本實施方式還可以包括以下步驟：片狀復合免疫增強劑腫瘤疫苗材料切碎或剪碎，在進一步用低溫破碎裝置研磨破碎，在研磨破碎過程中將液氮與被切碎或剪碎的材料送入低溫破碎裝置中進行破碎，然后使破碎后的顆粒通過篩網，篩選400μm的顆粒，得到粉狀組合物。
進一步地，本實施方式還可以包括以下步驟：將片狀組合物或粉狀組合物最后滅菌解析，具體的滅菌解析步驟包括：采用環(huán)氧乙烷進行滅菌，滅菌條件為：在溫度20-40℃保溫，然后通入環(huán)氧乙烷滅菌；解析過程在通風的解析室中進行，溫度控制在20℃之間，時間14天。
其中的滅活方式可以采用紫外線法、熱滅活法、深冷凍融法、戊二醛法或它們的組合來進行。
實施例2：
對實施例1中樣品進行性能檢測，檢測項目與結果如下：
1)膠原蛋白亞型鑒別：采用免疫組化染色法檢測i、iii、iv型和vi型膠原蛋白，3μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。將切片移入電飯煲水浴中(內含0.01mol/l，ph6.0的枸櫞酸三鈉緩沖液)，溫度保持在95-100℃，煮20min，進行抗原修復，取出后在室溫下自然冷卻。磷酸鹽緩沖液(pbs)洗滌，5min×3次。二步法免疫組化：分別滴加i、iii、iv型和vi型膠原蛋白單克隆抗體一抗，濃度1：100，4℃冰箱過夜室溫下孵育60min，pbs洗滌3次。滴加envision反應液，室溫下孵育30min。pbs洗滌3次。0.05％的3，3一二氨基聯(lián)苯胺+0.03％的h2o2顯色5-10min。流水洗，蘇木精襯染。遞增梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)樹脂封固。結果表明，顯微鏡下觀察四種染色標本皆可見棕黃染色，為陽性，表明樣品中可檢測到i、iii、iv型和vi型膠原蛋白。
2)多糖物質含量檢測：取10個樣品，取樣，浸提，用biocolor硫酸軟骨素檢測試劑盒測試硫酸軟骨素含量，樣品中硫酸軟骨素含量平均值為5842±320μg/g；用透明質酸檢測試劑盒測試透明質酸(ha)含量，結果顯示，樣品的透明質酸(ha)保留量平均值為321±24μg/g。
3)活性因子種類鑒別：將樣品浸泡pbs24h后，固定于4％多聚甲醛5-10min，用0.1mol/lpbs洗3次，每次5min，然后用玻璃細管轉至涂有多聚賴氨酸的玻片上,進行免疫組織化學染色。ln抗體、fn抗體和整合素效價均為1∶100，0.5％胰酶消化3-5min暴露抗原，0.1％tritonx100作用10min增加抗體的穿透性。免疫組織化學染色顯陽性，表面樣品中包含纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素及其配體的等物質。
4)dna殘留：依據生物制劑殘留dna檢測方法《中國藥典》2015年版第四部，采用熒光染色法檢測實施例1所提供的樣品dna殘留量，結果：實施例1所提供的樣品的dna殘留量100±5ng/mg。
5)半乳糖苷酶(α-gal)清除率：取動物源性生物材料gal陽性參考品，gal抗原陰性參考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的gal標準曲線樣品，測試免疫原去除前后的測試品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液與m86抗體反應后的上清液，加入96孔板，加二抗，加顯色劑，采用elisa方法450nm檢測吸光度值，按標準曲線計算出樣品的gal值，免疫原去除處理前材料的gal值為22.25±2.36×1014/mg，實施例1中樣品的gal值為0.16±0.02×1014/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.28％以上。
6)病毒檢測：選擇偽狂犬病毒為指示病毒，采用實時定量pcr法檢測病毒的dna拷貝數(shù)，檢測3批樣品。結果：病毒dna拷貝數(shù)為0。
7)細菌內毒：按照gb/t14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學試驗方法》進行檢測，共3批樣品，結果：細菌內毒小于20eu/包裝。
8)環(huán)氧乙烷殘留量：按gb/t14233.1-2008《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學分析法》中9的規(guī)定的方法試驗，結果：產品環(huán)氧乙烷殘留量不超過10μg/包裝。
9)重金屬檢查：鉛、鉻按gb/t14233.1-2008中5.9.1《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學分析法》規(guī)定的方法試驗，汞、砷按gb/t14233.1-2008中5.9.3《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學分析法》規(guī)定的方法試驗，產品檢驗液中鉛、鉻、汞、砷總重金屬含量少于1ug/g。
10)生長因子殘留量：對實施例1中樣品采用elisa法檢測樣品中堿性生長因子(bfgf)和血管內皮生長因子(vegf)含量，并對免疫原去除前動物組織作為對照。結果發(fā)現(xiàn)堿性生長因子(bfgf)免疫原去除前后含量分別為2634±231ng/l、941±102ng/l，保留生長因子30％以上；血管內皮生長因子(vegf)含量免疫原去除前后含量分別為773±63ng/l、3361±22ng/l，保留生長因子40％以上。
實施例3：
按照實施例1，取鼠肺癌細胞滅活后制得滅活肺癌細胞復合免疫增強劑片狀材料，以3月齡健康實驗鼠側翼皮下注射0.1ml，106個肺癌細胞，造腫瘤模型，當腫瘤生成后，行腫瘤切除手術，保留腫瘤基底，動物隨機分為對照組、sis組、滅活肺癌細胞復合免疫增強劑片狀材料組，將材料覆蓋于創(chuàng)面上并固定，對照組只切除腫瘤，3周后觀察腫瘤切除后創(chuàng)面腫瘤復發(fā)、腫瘤重量、腫瘤轉移情況，發(fā)現(xiàn)腫痛復發(fā)率為100％，記錄腫瘤重量與轉移情況如下表，表明sis組材料可以減緩腫瘤生長速度，但無法控制腫瘤轉移，但是滅活肺癌細胞與sis復合后，不僅明顯減緩腫瘤生長速度，同時也控制腫瘤轉移的發(fā)生。
表13周后復發(fā)腫瘤重量(g)
表23周后腫轉移情況
由此可見，本發(fā)明制備得到的免疫增強抗腫瘤膠原組合物：
(1)與滅活腫瘤細胞復合使用，強化腫瘤免疫效果，降低腫瘤轉移風險，減緩腫瘤生長速率，延長患者生存時間；
(2)降低引起過敏、感染、炎癥、肉芽腫、局部膿腫的風險；
(3)體內可降解，降解過程可控，作用周期長；
(4)生產過程可實現(xiàn)標準化、產業(yè)化；
(5)可用腫瘤切除面的植入材料，也可制成針劑進行肌肉注射也可以皮下注射。
本發(fā)明的上述實施例是對本發(fā)明的說明而不能用于限制本發(fā)明，與本發(fā)明的權利要求書相當?shù)暮x和范圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。