本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料、制備方法和應(yīng)用，該材料用于將生長(zhǎng)因子復(fù)合于免疫原去除基質(zhì)中，增強(qiáng)材料對(duì)特定組織的誘導(dǎo)修復(fù)作用。
背景技術(shù)：
：免疫原去除小腸粘膜下層(sis)材料是在臨床上廣泛應(yīng)用于腹壁、泌尿道、硬腦膜、血心管修復(fù)等軟組織缺損修復(fù)、加固的生物醫(yī)用材料，是一種無細(xì)胞、無免疫原性、能生物降解且具有纖維彈性良好的材料。發(fā)明專利(103272278a)曾公開了一種動(dòng)物源性植入性醫(yī)用生物材料的制備方法，介紹了通過動(dòng)物組織材料的前置處理分離、初洗、病毒滅活、免疫原去除、氯化鈉處理、成型、包裝滅菌獲得具有不同的尺寸、厚度和力學(xué)強(qiáng)度的醫(yī)用產(chǎn)品。免疫原去除技術(shù)將動(dòng)物組織或器官活細(xì)胞消化、溶解，去除引起免疫反應(yīng)的細(xì)胞表面抗原，獲得保留有生長(zhǎng)因子等調(diào)控因子的細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)。免疫原去除基質(zhì)是由多種大分子物質(zhì)如i型膠原蛋白、非膠原糖蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖及生長(zhǎng)因子等物質(zhì)組成，構(gòu)成一個(gè)多孔三維結(jié)構(gòu)，為各種細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)微環(huán)境，能夠調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的附著、形態(tài)、遷移、代謝、增殖和分化。免疫原去除基質(zhì)作為組織和器官移植的天然生物醫(yī)用材料，植入體內(nèi)后可誘導(dǎo)患者自身細(xì)胞長(zhǎng)入，為細(xì)胞重建受損組織提供模板，修復(fù)為血管化、功能化的組織或器官，并且免疫原去除基質(zhì)會(huì)逐步降解，與重建組織再生過程基本同步，最終免疫原去除基質(zhì)補(bǔ)片完全被宿主組織代替。免疫原去除sis基質(zhì)補(bǔ)片中含有氨基聚糖、蛋白聚糖及生長(zhǎng)因子，氨基聚糖、蛋白聚糖有利于生長(zhǎng)因子的固定與趨化，而生長(zhǎng)因子包括vegf、tgfβ1、bfgf，因此對(duì)于軟組織缺損的修復(fù)、血管化作用明顯，能很好的重塑與再生受損組織。但是當(dāng)用于心肌、神經(jīng)、平滑肌、上皮等組織修復(fù)時(shí)，免疫原去除sis基質(zhì)補(bǔ)片對(duì)這些組織的功能重建的誘導(dǎo)作用有限，主要起到物理屏障作用，形成組織修復(fù)微環(huán)境，防止周圍組織長(zhǎng)入受損部位形成粘連、瘢痕。另外免疫原去除sis基質(zhì)補(bǔ)片應(yīng)用于血管瓣膜時(shí)還應(yīng)考慮其防鈣化功能，考慮其增加防止鈣化的生長(zhǎng)因子。為使免疫原去除sis基質(zhì)補(bǔ)片應(yīng)用于心臟、血管、神經(jīng)、膀胱、食道、子宮等器官，實(shí)現(xiàn)其對(duì)組織功能增強(qiáng)修復(fù)，可將其與單種、多種生長(zhǎng)因子復(fù)合，以促進(jìn)其對(duì)特定組織、器官細(xì)胞的誘導(dǎo)調(diào)控作用。但是生長(zhǎng)因子在體內(nèi)半衰期短，因此體內(nèi)的釋放行為還需要進(jìn)一步解決。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種將生長(zhǎng)因子復(fù)合于免疫原去除基質(zhì)中，能夠增強(qiáng)材料對(duì)特定組織誘導(dǎo)修復(fù)作用的高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料，其特征在于：該材料由具有三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)的天然高分子材料組成，包括由中間層和上、下表面層構(gòu)成的三層結(jié)構(gòu)；中間層包含膠原蛋白、多糖物質(zhì)、活性因子和生長(zhǎng)因子，上、下表面層包含膠原蛋白、多糖物質(zhì)和活性因子，所述修復(fù)材料可體內(nèi)降解。所述修復(fù)材料以動(dòng)物小腸粘膜下層組織材料制成。所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選豬或牛。所述的膠原蛋白為包含i型、iii型、iv型和vi型膠原蛋白的組合物。所述的多糖物質(zhì)為包含硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸的組合物。所述的活性因子為包含纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素及其配體的組合物。所述的生長(zhǎng)因子包括但不限于卵泡抑制蛋白、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)γ羧基谷氨酸蛋白等一種或幾種生長(zhǎng)因子的組合物。所述的體內(nèi)降解的時(shí)間為3-6個(gè)月。所述的上表面層和下表面層的三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)的孔隙率為45～70％。所述的中間層的三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)的孔隙率為75～90％。本發(fā)明上述特定的孔隙率能夠控制生長(zhǎng)因子釋放，可以選擇多種生長(zhǎng)因子。本發(fā)明所述的高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料，長(zhǎng)1-20cm，寬1-10cm，厚度1-4mm。本發(fā)明還提供一種上述高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料的制備方法，采用動(dòng)物小腸粘膜下層組織作為原料，通過組織前置處理、病毒滅活、免疫原去除、干燥、漿料制備、成型和冷凍干燥步驟，獲得清除動(dòng)物源病毒風(fēng)險(xiǎn)、細(xì)胞成分、dna成分和α-gal抗原，保留細(xì)胞外基質(zhì)成分的高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料。上述高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料的制備方法，具體的步驟包括：(1)組織前置處理：取動(dòng)物小腸粘膜下層組織材料，清洗并將水濾干；(2)病毒滅活：采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡動(dòng)物小腸粘膜下層組織材料進(jìn)行病毒滅活；然后在超聲裝置中處理；(3)免疫原去除：免疫原去除液采用含有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，免疫原去除過程在超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行；然后在超聲裝置中清洗，得到小腸粘膜下層基質(zhì)材料；(4)干燥：將由步驟(3)得到的經(jīng)免疫原去除的基質(zhì)材料固定于模具上，然后一同放于烘箱干燥；(5)漿料制備：將由步驟(3)清洗后的基質(zhì)材料剪碎，使用液氮冷凍粉碎裝置研磨破碎，得到顆粒；顆粒加入乙酸溶液，真空干燥后破碎；然后向顆粒中加入生長(zhǎng)因子溶液，形成漿料；(6)成型：取由步驟(4)得到的干燥后的小腸粘膜下層基質(zhì)材料膜作為上表面層和下表面層，在兩個(gè)表面層之間加入由步驟(5)得到的漿料，平鋪于模具上進(jìn)行成型；(7)冷凍干燥：將成型后的材料放置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥。本發(fā)明步驟(2)中過氧乙酸的體積百分比濃度為0.1％-5％、乙醇的體積百分比濃度為5％-40％(用水配置成溶液)，過氧乙酸-乙醇溶液與小腸粘膜下層組織材料的體積比為(3-20)︰1，滅活時(shí)間2-4小時(shí)，溫度范圍為10-40℃。步驟(2)超聲裝置中處理為：采用ph值為7.0的pbs溶液超聲處理小腸粘膜下層組織材料，溶液溫度為20℃，pbs溶液與小腸粘膜下層組織材料的比例(體積比)為30︰1，優(yōu)選處理3次，每次20分鐘；然后采用20℃的純化水清洗，純化水與小腸粘膜下層組織材料比例為30︰1，至檢測(cè)電導(dǎo)率為10μs/cm以下終止；清洗過程在超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行，頻率優(yōu)選40khz，功率優(yōu)選3000w以上。本發(fā)明步驟(3)中免疫原去除液為含有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，免疫原去除液中胰蛋白酶的質(zhì)量百分比濃度為0.01-0.2％，優(yōu)選0.02-0.05％；edta的濃度為0.1-1mmol/l，優(yōu)選0.4-0.8mmol/l；免疫原去除液的ph值為7.0-8.0，優(yōu)選為7.2-7.5；所述免疫原去除液與小腸粘膜下層組織材料體積比為(20-40)︰1，免疫原去除過程在至少包括兩個(gè)超聲頻率的超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行，其中低頻頻率范圍為20-40khz，高頻頻率為60-90khz，其中低頻處理5-40min，高頻處理5-40min，溫度范圍為20-35℃。采用胰蛋白酶和edta，使細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接被破壞；采用低頻超聲對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，同時(shí)使用高頻超聲作用于破碎的細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步使細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)，達(dá)到免疫原去除目的。采用上述方式，對(duì)整個(gè)細(xì)胞脫離基質(zhì)過程中的各個(gè)步驟進(jìn)行強(qiáng)化，使細(xì)胞被從基質(zhì)上完全脫離，到達(dá)最佳的免疫原去除效果。然后在超聲波清洗機(jī)中分別用pbs溶液和降溫注射用水處理，得到小腸粘膜下層基質(zhì)材料；ph值7.2-7.4的pbs溶液與小腸粘膜下層組織材料比例為(20-40)︰1，注射用水與小腸粘膜下層組織材料比例為(20-40)︰1，注射用水處理至檢測(cè)清洗前后注射用水電導(dǎo)率差為1μs/cm以下終止；超聲頻率優(yōu)選40khz，功率優(yōu)選3000w以上。本發(fā)明所述步驟(4)干燥為：將免疫原去除組織材料置于溫度25-40℃、時(shí)間為8-16小時(shí)的環(huán)境中，形成上表面層或者下表面層。本發(fā)明步驟(5)所述漿料制備為：將步驟(3)清洗后的基質(zhì)材料剪碎，使用液氮冷凍粉碎裝置研磨破碎，將剪碎的基質(zhì)材料進(jìn)行破碎，然后通過篩網(wǎng)篩分出粒徑250μm以下，優(yōu)選150μm以下的顆粒(用于控制疏松結(jié)構(gòu)的均勻性，顆粒越小形成的疏松結(jié)構(gòu)越均勻)；顆粒中加入質(zhì)量百分比為0.3％的乙酸溶液，真空干燥后破碎；然后按生長(zhǎng)因子與顆粒質(zhì)量比為(1-50):10000的比例向顆粒中加入生長(zhǎng)因子水溶液，形成漿料，用于制備中間層(活性層)。本發(fā)明(7)所述的冷凍干燥為：將表面層與活性層進(jìn)行冷凍干燥，預(yù)凍至-45℃，保溫1-2小時(shí)，然后調(diào)節(jié)溫度至-15℃，保溫5-7小時(shí)，再調(diào)節(jié)溫度至0℃，保溫2小時(shí)，最后調(diào)節(jié)溫度至25℃，保溫4小時(shí)，形成復(fù)合結(jié)構(gòu)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種上述高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料的應(yīng)用，具體為：該高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料可以包含以下一種或多種生長(zhǎng)因子：卵泡抑制蛋白、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)γ羧基谷氨酸蛋白等。一種高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料的應(yīng)用，可應(yīng)用于心肌、神經(jīng)、平滑肌、上皮等組織損傷的修復(fù)。一種高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料的應(yīng)用，可固定于損傷組織的部位，提供力學(xué)支持與隔離保護(hù)，并緩慢釋放生長(zhǎng)因子，高活性調(diào)控組織再生與修復(fù)過程，長(zhǎng)期植入防止材料的鈣化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)采用胰蛋白酶和edta，使細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接被破壞；采用低頻超聲對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，同時(shí)使用高頻超聲作用于破碎的細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步使細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)，達(dá)到脫細(xì)胞目的。采用上述方式，對(duì)整個(gè)細(xì)胞脫離基質(zhì)過程中的各個(gè)步驟進(jìn)行強(qiáng)化，使細(xì)胞被從基質(zhì)上完全脫離。到達(dá)最佳的免疫原去除效果。(2)高效破碎技術(shù)：低溫超高速剪切破碎技術(shù)，保護(hù)膠原蛋白、生物因子成分不受破壞；(3)可降解吸收：體內(nèi)可降解，降解過程可控，作用周期長(zhǎng)；(4)多層封閉膜：三層結(jié)構(gòu)，上下表面層為完整的免疫原去除基質(zhì)層，中間層為含生長(zhǎng)因子層，形成三明治結(jié)構(gòu)，同時(shí)控制材料降解與生長(zhǎng)因子釋放過程；(5)多種生長(zhǎng)因子可應(yīng)用不同細(xì)胞各類組織的功能重建：一種高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料，可以包含以下一種或多種生長(zhǎng)因子：卵泡抑制蛋白、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)γ羧基谷氨酸蛋白等，應(yīng)用于心肌、神經(jīng)、平滑肌、上皮等組織的生長(zhǎng)與調(diào)控，或防止植入后免疫原去除基質(zhì)材料的鈣化。附圖說明圖1所示的是本發(fā)明高誘導(dǎo)活性載蛋白的異種免疫原去除基質(zhì)材料的結(jié)構(gòu)圖；圖2所示的是本發(fā)明高誘導(dǎo)活性載蛋白的異種免疫原去除基質(zhì)材料不同層的微觀結(jié)構(gòu)sem照片，其中左圖為免疫原去除基質(zhì)層，右圖為生長(zhǎng)因子層；圖3所示的是本發(fā)明高誘導(dǎo)活性載蛋白的異種免疫原去除基質(zhì)材料活性因子釋放曲線；圖4所示的是本發(fā)明高誘導(dǎo)活性載蛋白的異種免疫原去除基質(zhì)材料對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述，但不局限于此。本發(fā)明所述小腸粘膜下層組織材料取自哺乳動(dòng)物，豬小腸粘膜下層組織材料(sis)或牛小腸粘膜下層組織材料均適用于本發(fā)明的實(shí)施例。實(shí)施例1：本實(shí)施例動(dòng)物源植入性生物修補(bǔ)片的制備方法，包括以下操作步驟：(1)組織前置處理：取小腸粘膜下層組織材料分割成寬10cm，長(zhǎng)15cm的規(guī)定尺寸，剔除淋巴組織，用自來水沖洗3次，再用純化水沖洗至表面無污漬，將沖洗后的小腸粘膜下層組織材料放置于濾網(wǎng)等濾水裝置上，靜置5分鐘以上，將水濾干。(2)病毒滅活：采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡小腸粘膜下層組織材料進(jìn)行病毒滅活，該過程可在不銹鋼桶中進(jìn)行。過氧乙酸-乙醇溶液中過氧乙酸的體積百分比濃度為2％、乙醇的體積百分比濃度為20％，過氧乙酸-乙醇溶液與小腸粘膜下層組織材料的比例(體積比)為5︰1，滅活時(shí)間2小時(shí)，溫度范圍為20℃；然后在超聲裝置中分別用pbs和純化水處理；其中采用ph值為7.2-7.4的pbs溶液超聲處理小腸粘膜下層組織材料，溶液溫度為20℃，pbs溶液與小腸粘膜下層組織材料的體積比為30︰1，優(yōu)選處理3次，每次20分鐘；然后采用20℃的純化水清洗，純化水與小腸粘膜下層組織材料比例為30︰1，至檢測(cè)電導(dǎo)率為10μs/cm以下終止；清洗過程在超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行，頻率40khz，功率3000w以上。(3)免疫原去除：免疫原去除液采用含有質(zhì)量百分比0.02％的胰蛋白酶和濃度為0.5mmol/l的edta的ph值為7的pbs溶液，免疫原去除液與小腸粘膜下層組織材料混合比例(體積比)為30︰1，免疫原去除過程在多頻超聲裝置中進(jìn)行，超聲波功率在5000w以上；多頻超聲至少包括兩個(gè)超聲頻率，低頻頻率范圍為35khz，高頻頻率為70khz，其中低頻處理5min，高頻處理10min，溫度為22℃。然后在超聲波清洗機(jī)中分別用pbs溶液和純化水處理，得到小腸粘膜下層基質(zhì)材料；ph值7.2-7.4的pbs溶液與小腸粘膜下層組織材料比例為30︰1，純化水與小腸粘膜下層組織材料比例為30︰1，用24℃注射用水處理至檢測(cè)清洗前后注射用水電導(dǎo)率差為1μs/cm以下終止；超聲頻率優(yōu)選40khz，功率優(yōu)選3000w以上。(4)干燥：在熱循環(huán)百級(jí)烘箱中進(jìn)行，將烘箱預(yù)熱至40℃后，將由步驟(3)得到的經(jīng)免疫原去除的基質(zhì)材料固定于模具，并一同放于烘箱干燥，時(shí)間為16小時(shí)。(5)漿料制備：將由步驟(3)清洗后的基質(zhì)材料剪碎，使用液氮冷凍粉碎裝置研磨破碎，將剪碎的基質(zhì)材料和液氮送入裝置進(jìn)行破碎，然后通過篩網(wǎng)篩分出粒徑150μm以下的顆粒；顆粒加入0.3％(質(zhì)量百分比)的乙酸溶液，顆粒質(zhì)量與乙酸溶液質(zhì)量比為(0.5-2):1，真空干燥后破碎成顆粒；然后按生長(zhǎng)因子與顆粒質(zhì)量比為(1-50):10000的比例向顆粒中加入生長(zhǎng)因子(例如上皮生長(zhǎng)因子)水溶液，例如以20:10000的比例加入，形成漿料。其中，根據(jù)顆粒質(zhì)量及比例關(guān)系確定生長(zhǎng)因子質(zhì)量，然后將生長(zhǎng)因子與水配置為溶液，其中生長(zhǎng)因子與水的質(zhì)量比為(1-50):1000，然后將溶液滴入顆粒中并混合均勻；還可以進(jìn)一步加入純化水以調(diào)整漿料粘度；可加入顆粒質(zhì)量的5-50倍的水，優(yōu)選30倍的水。(6)成型控制：取由步驟(4)得到的干燥后的小腸粘膜下層基質(zhì)材料膜作為表面層，在兩個(gè)表面層之間加入由步驟(5)得到的漿料，平鋪于模具。(7)冷凍干燥：將成型后材料平鋪于真空冷凍干燥機(jī)中，關(guān)閉凍干室的門，打開循環(huán)泵約1min，開啟壓縮機(jī)對(duì)凍干箱致冷，將步驟(6)模具連同材料預(yù)凍至-45℃，保溫2小時(shí)，然后開啟真空泵，調(diào)節(jié)溫度至-15℃，保溫6小時(shí)，再調(diào)節(jié)溫度至0℃，保溫2小時(shí)，最后調(diào)節(jié)溫度至25℃，保溫4小時(shí)，真空冷凍干燥完成。本實(shí)施例中的制備方法還可包含以下步驟：(8)滅菌解析：采用環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌，滅菌條件為：先溫度40℃保溫4小時(shí)，濕度70％，然后通入濃度500mg/l環(huán)氧乙烷，滅菌6小時(shí)；解析過程在通風(fēng)的解析室中進(jìn)行，溫度控制在20℃之間，時(shí)間14d。本發(fā)明所得產(chǎn)品結(jié)構(gòu)如圖1所示：包括上、下表面層(上表面層和下表面層)和中間層，微觀結(jié)構(gòu)如附圖2所示。對(duì)本發(fā)明所得材料的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，如下表1所示：表1蛋白(％)碳水化合物(％)脂類(％)水分灰分生長(zhǎng)因子75％-85％15％-25％<1％<5％<1％0.01-2％實(shí)施例2：性能檢測(cè)1)高誘導(dǎo)活性載蛋白的異種免疫原去除基質(zhì)材料為三層結(jié)構(gòu)，上下表面層為完整的表面層，中間層為含生長(zhǎng)因子層，形成三明治結(jié)構(gòu)，表面層較為致密，可控制材料降解行為與生長(zhǎng)因子釋放速度，而生長(zhǎng)因子層為多孔結(jié)構(gòu)層，利于保存生長(zhǎng)因子。表面層孔隙率為67.4±5.2％，而生長(zhǎng)因子層開孔率90.5±7.0％。2)力學(xué)性能檢測(cè)表明樣品伸斷裂強(qiáng)度達(dá)105n/cm，縫合保持力大于21n。3)依據(jù)生物制劑殘留dna檢測(cè)方法《中國(guó)藥典》2015年版第四部，采用熒光染色法檢測(cè)實(shí)施例1所提供的樣品dna殘留量，實(shí)施例1所提供的樣品的dna殘留量2.56±0.14ng/mg。4)采用實(shí)時(shí)定量pcr法檢測(cè)病毒的dna拷貝數(shù)，檢測(cè)3批樣品。結(jié)果：病毒dna拷貝數(shù)為0。5)按照gb/t14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法》進(jìn)行檢測(cè)實(shí)施例1所提供的樣品，結(jié)果：細(xì)菌內(nèi)毒為20eu/套。6)半乳糖苷酶(α-gal)清除率免疫原去除處理前材料的gal值為23.41±2.34×1014/mg，實(shí)施例1中樣品的gal值為0.13±0.02×1014/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.40％以上。7)采用免疫組化染色法檢測(cè)i、iii、iv型和vi型膠原蛋白，呈陽(yáng)性。多糖物質(zhì)含量檢測(cè)表明樣品中硫酸軟骨素含量平均值為5687±201μg/g，透明質(zhì)酸(ha)保留量平均值為354±35μg/g。8)采用免疫組化染色法檢測(cè)活性因子纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素，呈陽(yáng)性。實(shí)施例3：活性因子釋放曲線的檢測(cè)高誘導(dǎo)活性載蛋白的異種免疫原去除基質(zhì)材料按實(shí)施例1制備樣品置于12孔板中，每孔中加入2毫升的pbs(ph7.4)。在飽和濕度的37℃下5％co2氣氛的co2培養(yǎng)箱中孵育1、3、5、7、14、21、28d(天)，再將pbs轉(zhuǎn)移到離心管中，并檢測(cè)pbs溶液中血小板源生長(zhǎng)因子含量m1，以加初始加入量為分母m0，計(jì)算生長(zhǎng)因子釋放率＝m1/m0。如附圖3所示，生長(zhǎng)因子釋放穩(wěn)定可控，第1天時(shí)生長(zhǎng)固子釋放率為19.92±1.96％，第3天釋放率為46.32±3.36％，第7天釋放率為64.16±2.50％，28天時(shí)總釋放率達(dá)到86.56±3.42％。因此生長(zhǎng)因子可持續(xù)周期28天以上，未出現(xiàn)突釋現(xiàn)象，體現(xiàn)了高誘導(dǎo)活性。實(shí)施例4：添加神經(jīng)生長(zhǎng)因子后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響高誘導(dǎo)活性載蛋白的異種免疫原去除基質(zhì)材料按實(shí)施例1制備樣品，其中添加的生長(zhǎng)因子替換為神經(jīng)生長(zhǎng)因子，制備好樣品裁剪為小樣，置于96孔進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，采用mtt測(cè)試神經(jīng)細(xì)胞的存活率，空白對(duì)照組只加培養(yǎng)基。結(jié)構(gòu)如附圖4所示，培養(yǎng)3天時(shí)，試驗(yàn)組細(xì)胞存活率比空白對(duì)照組高29.62±2.66％，培養(yǎng)5天時(shí)，試驗(yàn)組細(xì)胞存活率比空白對(duì)照組高50.04±12.69％，培養(yǎng)7天時(shí)，試驗(yàn)組細(xì)胞存活率比空白對(duì)照組高54.87±9.47％，因此高誘導(dǎo)活性載蛋白的異種免疫原去除基質(zhì)材料添加神經(jīng)生長(zhǎng)因子后明顯提高了神經(jīng)細(xì)胞存活率。綜上，本發(fā)明一種高誘導(dǎo)活性的修復(fù)材料：(1)dna殘留能夠達(dá)到10ng/mg以下，較同類產(chǎn)品低30-50ng/mg、半乳糖苷酶去除率較高，能夠達(dá)到99％以上；(2)降低引起過敏、感染、炎癥、肉芽腫、局部膿腫的風(fēng)險(xiǎn)；(3)保留細(xì)胞外基質(zhì)中活性生長(zhǎng)因子；(4)利用氨基聚糖、蛋白聚糖錨定添加的多種有益生長(zhǎng)因子；(5)體內(nèi)可降解，生長(zhǎng)因子釋放可控，作用周期長(zhǎng)，具有高誘導(dǎo)活能；(6)可控力學(xué)性能，通過不同層數(shù)封閉膜控制生長(zhǎng)因子釋放與力學(xué)性能；(7)生產(chǎn)過程可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明的上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的說明而不能用于限制本發(fā)明，與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12