本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種復(fù)合基因載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著21世紀(jì)蛋白組學(xué)、生物技術(shù)、化學(xué)基因組學(xué)迅猛發(fā)展，基因治療已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點。目前，腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域的常規(guī)治療尚缺乏有效藥物，因此，從基因水平上進行疾病治療已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點。而在基因治療過程中，需要將外源基因引入到細(xì)胞中,但是dna分子通常以帶負(fù)電的疏松狀態(tài)存在,體積較大,滿負(fù)電荷與細(xì)胞表面之間存在排斥作用,很難進入細(xì)胞中，另外dna會被體內(nèi)的核酸酶降解,在未進入靶細(xì)胞,甚至未達到靶器官時便降解成小分子核苷酸,從而失去治療作用，所以為了基因治療的高效率，要求在體內(nèi)運輸過程中治療基因需得到更好的保護，因此基因載體應(yīng)運而生，將目的基因與載體結(jié)合，使得外源基因或有功能的核酸片段導(dǎo)入到細(xì)胞中，實現(xiàn)基因表達調(diào)控、基因功能甚至基因治療的目的。開發(fā)高效的基因載體對于整個基因治療乃至基因工程中都是極為重要的一環(huán)，也將推動基因治療向常規(guī)治療的過渡?；蜉d體的效率可用細(xì)胞轉(zhuǎn)染率及編碼外源蛋白的表達量來表示,只有高轉(zhuǎn)染效率的載體才是能真正應(yīng)用于基因治療過程中，因此開發(fā)高轉(zhuǎn)染效率的載體是基因治療研究中一個重點。

目前基因載體分病毒載體和非病毒載體兩種。病毒載體轉(zhuǎn)染效率很高，但是存在如免疫原性等嚴(yán)重的安全性問題，而且搭載目的基因容量小，制備復(fù)雜，費用昂貴。非病毒載體免疫原性低、低毒、制備簡便且適合大規(guī)模生產(chǎn)，但是普遍轉(zhuǎn)染效率都較低。

脂質(zhì)體載體(如dc-chol-dope、dosper-dope、dotma-dope和lipofectamine^tm2000等等)是非病毒載體中研究比較深入的一類載體，陽離子脂質(zhì)體因其操作簡便，轉(zhuǎn)染的安全性、高效性和通用性而得到廣泛應(yīng)用且已有產(chǎn)品應(yīng)用于臨床試驗。lipofectamine^tm2000(以下簡稱為lipo2000)是脂質(zhì)體載體的一個典型代表，是現(xiàn)在商品化載體中的明星產(chǎn)品，可為517種細(xì)胞提供高轉(zhuǎn)染效率(表達轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))和活性(細(xì)胞抽提物中轉(zhuǎn)入基因的酶產(chǎn)物活性)。lipo2000轉(zhuǎn)染步驟簡單便捷，對很多細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率也較高。但是lipo2000的高轉(zhuǎn)染效率并非能針對所有細(xì)胞，對于一些細(xì)胞它的轉(zhuǎn)染效率并不能達到治療研究過程所滿意的結(jié)果。

另外，陽離子聚合物也是非病毒載體的一類。聚酰胺-胺(pamam)樹狀大分子是一類合成的、單分散的納米級大分子化合物,具有高度分支、多價性、易被修飾、用途廣泛等特點。很多文獻均有對pamam及其修飾得到的衍生物進行研究，研究發(fā)現(xiàn)，聚酰胺-胺樹狀高聚物可作為陽離子型基因載體，它能有效地包裹核酸，安全性好(參考文獻：[1]huangh,tangg,wangq,etal.twonovelnon-viralgenedeliveryvectors:lowmolecularweightpolyethyleniminecross-linkedby(2-hydroxypropyl)-beta-cyclodextrinor(2-hydroxypropyl)-gamma-cyclodextrin.chemcommun(camb),2006,22:2382-2384.[2]yangc,wangx,lih,etal.synthesisandcharacterizationofpolyrotaxanesconsistingofcationicalpha-cyclodextrinsthreadedonpoly[(ethyleneoxide)-ran-(propyleneoxide)]asgenecarriers.biomacromolecules,2007,8:3365-3374.[3]yangc,lih,gohsh,etal.cationicstarpolymersconsistingofalpha-cyclodextrincoreandoligoethyleniminearmsasnonviralgenedeliveryvectors.biomaterials,2007,28:3245-3254.)。采用α-環(huán)糊精作為內(nèi)核，在其外部枝接低聚酰胺-胺樹狀大分子第二代(pamam-g2)得到高分子聚合物cdg2。cdg2載體作為聚陽離子型基因載體的一種，有一定的包裹和壓縮核酸的能力，對某些細(xì)胞具有一定的轉(zhuǎn)染效率，但是同樣存在細(xì)胞種類差異性導(dǎo)致的轉(zhuǎn)染效率低的問題，對于某些細(xì)胞甚至轉(zhuǎn)染率極低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明提供了一種復(fù)合基因載體，該復(fù)合基因載體對多種細(xì)胞都具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

具體技術(shù)方案如下：

一種復(fù)合基因載體，由cdg2和脂質(zhì)體復(fù)合而成，所述cdg2和脂質(zhì)體的質(zhì)量比為1-5:1，所述cdg2是通過在α-環(huán)糊精的外部接枝pamam-g2制備得到。

在其中一些實施例中，所述cdg2和脂質(zhì)體的質(zhì)量比為1.5-4:1。

在其中一些實施例中，所述脂質(zhì)體選自dc-chol-dope、dosper-dope、dotma-dope和lipofectamine^tm2000中的至少一種。

在其中一些實施例中，所述cdg2的制備方法包括以下步驟：將α-環(huán)糊精與偶聯(lián)劑反應(yīng)，得到連接有偶聯(lián)劑的α-環(huán)糊精；將pamam-g2與連接有偶聯(lián)劑的α-環(huán)糊精反應(yīng)，即得所述cdg2。

在其中一些實施例中，所述偶聯(lián)劑為n,n-羰基二咪唑。

在其中一些實施例中，所述α-環(huán)糊精、n,n-羰基二咪唑與pamam-g2的質(zhì)量比為1：11-15：50-55。

本發(fā)明還提供了上述復(fù)合基因載體的應(yīng)用。

具體技術(shù)方案如下：

上述的復(fù)合基因載體在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種dna/載體復(fù)合物。

具體技術(shù)方案如下：

一種dna/載體復(fù)合物，由上述的復(fù)合基因載體與dna復(fù)合而成。

在其中一些實施例中，所述復(fù)合基因載體與dna的質(zhì)量比為2.5-5:1。

本發(fā)明還提供了一種dna/載體復(fù)合物的制備方法。

具體技術(shù)方案如下：

一種制備dna/載體復(fù)合物的方法，包括以下步驟：將cdg2配制成濃度為0.7-0.9mg/ml的cdg2水溶液，將脂質(zhì)體配制成濃度為0.9-1.1mg/ml的脂質(zhì)體水溶液，將dna配制成濃度為75-85ng/μl的dna水溶液；取18.5-19μlcdg2水溶液、5-7μl脂質(zhì)體水溶液、70-80μldna水溶液和45-55μl水，混合后在室溫下靜置孵育25-35min，即得所述dna/載體復(fù)合物；所述cdg2是通過在α-環(huán)糊精的外部接枝pamam-g2制備得到。

在其中一些實施例中，所述脂質(zhì)體選自dc-chol-dope、dosper-dope、dotma-dope和lipofectamine^tm2000中的至少一種。

在其中一些實施例中，所述cdg2的制備方法包括以下步驟：將α-環(huán)糊精與偶聯(lián)劑反應(yīng)，得到連接有偶聯(lián)劑的α-環(huán)糊精；將pamam-g2與連接有偶聯(lián)劑的α-環(huán)糊精反應(yīng)，即得所述cdg2。

在其中一些實施例中，所述偶聯(lián)劑為n,n-羰基二咪唑。

在其中一些實施例中，所述α-環(huán)糊精、n,n-羰基二咪唑與pamam-g2的質(zhì)量比為1：11-15：50-55。

本發(fā)明的復(fù)合基因載體及其應(yīng)用具有以下優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)明人通過大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，將cdg2與脂質(zhì)體基因載體復(fù)合后獲得的復(fù)合基因載體相比單獨的cdg2和單獨的脂質(zhì)體基因載體能夠顯著提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。通過轉(zhuǎn)染幾種實驗室常用的實驗細(xì)胞，包括hek293t細(xì)胞，a549細(xì)胞，lovo細(xì)胞和hek293a細(xì)胞，證實了其高轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果。由于實驗需要或者細(xì)胞的個體差異性，對基因傳遞載體的轉(zhuǎn)染效率會提出更高的要求，本發(fā)明的復(fù)合基因載體，能夠顯著提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，將其用于基因治療藥物的制備，有利于推動基因治療藥物的發(fā)展。

附圖說明

圖1為實施例1中的三種載體介導(dǎo)pegpf-c1轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的熒光圖片；

圖2為實施例1中的三種載體介導(dǎo)pegpf-c1轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞的熒光圖片；

圖3為實施例1中的三種載體介導(dǎo)pegpf-c1轉(zhuǎn)染lovo細(xì)胞的熒光圖片；

圖4為實施例1中的三種載體介導(dǎo)pegpf-c1轉(zhuǎn)染hek293a細(xì)胞的熒光圖片；

圖5為實施例1中的三種pdna/載體納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的的轉(zhuǎn)染效率；

圖6為實施例1中的三種pdna/載體納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞的的轉(zhuǎn)染效率；

圖7為實施例1中的三種pdna/載體納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染lovo細(xì)胞的的轉(zhuǎn)染效率；

圖8為實施例1中的三種pdna/載體納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染hek293a細(xì)胞的的轉(zhuǎn)染效率；

圖9為實施例2中的三種載體介導(dǎo)pegpf-c1轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的熒光圖片；

圖10為實施例2中的三種pdna/載體納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；

圖11為實施例3中的三種載體介導(dǎo)pegpf-c1轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的熒光圖片；

圖12為實施例3中的三種pdna/載體納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的的轉(zhuǎn)染效率；

圖13為實施例4中的三種載體介導(dǎo)pegpf-c1轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的熒光圖片；

圖14為實施例4中的三種pdna/載體納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的的轉(zhuǎn)染效率。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的復(fù)合基因載體及其應(yīng)用做進一步詳細(xì)的說明。

lipofectamine^tm2000為invitrogen公司市售商品，簡稱為lipo2000；

dc-chol-dope：自制，其中dc-chol購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，dope購自瑞士cordenpharma公司。

其制備方法如下：稱取1mgdc-chol和1mgdope，溶于1ml氯仿/甲醇中。氮氣吹干，形成薄膜，真空干燥10h。向里面加入1ml無菌水，恒溫45攝氏度超聲1.5h。得到透明澄清產(chǎn)品，即制得dc-chol-dope。

dosper-dope：自制，其中dosper購自上海倍卓生物科技有限公司，dope購自瑞士cordenpharma公司。

其制備方法如下：稱取1mgdosper和1mgdope，溶于1ml氯仿/甲醇中。氮氣吹干，形成薄膜，真空干燥10h。向里面加入1ml無菌水，恒溫45攝氏度超聲1.5h。得到透明澄清產(chǎn)品，即制得dosper-dope。

dotma-dope：自制，其中dotma購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，dope購自瑞士cordenpharma公司。

其制備方法如下：稱取1mgdotma和1mgdope，溶于1ml氯仿/甲醇中。氮氣吹干，形成薄膜，真空干燥10h。向里面加入1ml無菌水，恒溫45攝氏度超聲1.5h。得到透明澄清產(chǎn)品，即制得dotma-dope。

cdg2為自制產(chǎn)品，其中制備原料pamam-g2(低聚酰胺-胺樹狀大分子第二代)購自：西安瑞禧生物科技有限公司；cdg2的制備方法包括以下步驟：

(1)將偶聯(lián)劑n,n-羰基二咪唑(cdi)連接到α-環(huán)糊精(cd)上：分別稱取6.35gcdi和0.47gcd，于35℃真空干燥箱干燥24小時，分別溶于25ml無水dmso溶液中，將cd的無水dmso溶液超聲至溶液透明，攪拌和氮氣保護下，將cd溶液用注射器緩慢加入cdi溶液中，室溫攪拌反應(yīng)24小時。用混合溶劑(200mlthf:400mlet2o)對反應(yīng)液進行沉淀、離心，小心去除上清液、用300mlthf洗滌數(shù)次，離心沉淀，得到黃色粘稠液，于90℃真空干燥箱干燥24小時，得到白色粘稠物，即為連接有偶聯(lián)劑的α-環(huán)糊精(cd-cdi)。

(2)pamamg2純化：準(zhǔn)確取24.8gpamam-g2溶于100ml甲醇溶液中，用混合溶劑(400mlthf:200mlet2o)沉淀，離心，去除上清液，用400mlet2o洗滌數(shù)次、離心、沉淀，得到黃色粘稠狀物質(zhì)，于60℃真空干燥箱干燥6h，即為純化后的pamamg2。

(3)將純化后的pamamg2接枝到cd-cdi上制備cdg2：將步驟(2)中制備的cd-cdi和已純化的pamamg2分別溶于25ml和100ml無水dmso溶液中，在攪拌和氮氣保護下，將cd-cdi用注射器緩慢的加入pamamg2溶液中(加入時間為30分鐘)，室溫攪拌下反應(yīng)24小時，用混合溶劑(300mlthf:600mlet2o)將反應(yīng)液沉淀、離心，小心去除上清液，400mlthf洗滌數(shù)次，離心沉淀，得到黃色粘稠液，將黃色粘稠液溶于20ml去離子水中透析3天，即得cdg2。

以下實施例中所用pdna為pegpf-c1質(zhì)粒，其制備方法按試劑盒說明進行，具體如下：

(1)100mllb培養(yǎng)基的配制：分別稱取1.0g蛋白胨，0.5g酵母，及1.0g氯化鈉，溶于100ml去離子水中，15psi高壓下蒸汽滅菌20min。

(2)在生物安全柜中向已滅菌的lb培養(yǎng)基中加入100μl卡那霉素，再加入1ml已轉(zhuǎn)化有綠色熒光蛋白質(zhì)?；虻拇竽c桿菌，于37℃，270rpm振搖培養(yǎng)14～16h。

(3)向吸附柱cp5中加入2.5ml平衡液bl,1000rpm，離心2min,倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新收回收集管中。

(4)將24小時振搖的菌液加入50ml離心管中，于高速離心機中4℃，12000rpm,離心3min,棄去上清液，并將離心管倒置于濾紙上以完全吸干管壁上殘留的培養(yǎng)基。

(5)向收集到的菌體的離心管中加入7ml含有rnasea的p1溶液，渦旋以徹底混懸細(xì)菌，然后加入7ml溶液p2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6到8次，室溫靜置5min，再加入7ml溶液p4，再次激勵溫和的上下翻轉(zhuǎn)6到8次，室溫靜置10min，4℃，1000rpm，離心20～30min，使得菌體蛋白完全沉淀于離心管底部，再小心地將溶液全部倒入過濾器cs中，慢慢推動推柄過濾，最后將濾液收集在干凈的50ml離心管中。

(6)向濾液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)顛倒混勻后緩慢轉(zhuǎn)移到吸附柱cp5中，4℃，1000rpm，室溫離心4min，倒掉收集管中的廢液，再按照上述離心條件離心至全部濾液過柱，將吸附柱cp5重新放回收集管中。

(7)向吸附柱cp5中加入10ml漂洗液pw，4℃，10000rpm，離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，并重復(fù)漂洗一次。

(8)向吸附柱中加入3ml無水乙醇，4℃，12000rpm，離心5min,棄去收集管中的廢液，再將吸附柱重新放回收集管中，4℃,12000rpm，離心5min,將吸附柱開蓋至于室溫放置5min，以充分晾干吸附柱中殘留的乙醇溶液。

(9)將吸附柱至于一個干凈50ml離心管中，向吸附柱中懸空緩慢滴加1.5ml洗脫緩沖液tb，室溫放置8min，然后1000rpm離心3min，收集收集管中的洗脫液，即為質(zhì)粒pegpf-c1，再加入2ml預(yù)熱的tb洗脫緩沖液重復(fù)操作一次。

(10)小心收集濾液，以洗脫緩沖液tb或去離子水為空白，于nanodrop2000紫外可見分光光度計中測定dna濃度，并記錄od260和od280的值。其中od280/od260比值在1.8-2.0之間則dna純度合格，最后用去離子水將dna溶液稀釋到工作濃度放置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

實施例1

1、pdna/載體納米復(fù)合物的制備

(1)將cdg2配制成濃度為0.8mg/ml的水溶液；將dna配制成濃度為80ng/μl的水溶液；將lipo2000配制成濃度為1mg/ml的水溶液。

(2)按以下配比配制復(fù)合物溶液，再將復(fù)合物溶液在室溫下靜置孵育30min，即分別得到pdna/cdg2納米復(fù)合物、pdna/lipo2000納米復(fù)合物、pdna/cdg2/lipo2000納米復(fù)合物。

pdna/cdg2復(fù)合物溶液的組成:37.5μlcdg2,75μldna,37.5μlh2o。

pdna/lipo2000復(fù)合物溶液的組成:12μllipo2000,75μldna,63μlh2o。

pdna/cdg2/lipo2000復(fù)合物溶液的組成:6μllipo2000,18.8μlcdg2,75μldna,50.2μlh2o。

2、細(xì)胞培養(yǎng)

將hek293t細(xì)胞、hek293a細(xì)胞、a549細(xì)胞和lovo細(xì)胞分別在含10％胎牛血清(fbs)的高糖dmem培養(yǎng)基中，在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

3、轉(zhuǎn)染實驗

(1)接種細(xì)胞

用含0.25％edta的胰蛋白酶消化處于生長對數(shù)期的hek293t、hek293a、a549和lovo細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞接種到24孔板中，6.0×10⁵個細(xì)胞/孔，于含血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，用pbs沖洗細(xì)胞，每孔加入600μl不含血清的dmem培養(yǎng)基，等細(xì)胞匯合度為80％時即可進行轉(zhuǎn)染。

(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將上述配好的pdna/載體納米復(fù)合物加入步驟(1)的接種有細(xì)胞的24孔板中，每孔加入50μl(dna量為2μg)，每組三個復(fù)孔，在37℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4h后，棄去培養(yǎng)液，再加入1ml含10％胎牛血清的dmem，繼續(xù)培養(yǎng)44h后，棄去培養(yǎng)基。

用倒置相差熒光顯微鏡定性觀察pdna/載體納米復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染效率。于倒置相差熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)以及綠色熒光蛋白的表達，并用圖形軟件imageproplus6.0拍攝記錄熒光圖片，結(jié)果見圖1-圖4。從圖中可以看出：cdg2和lipo2000的復(fù)合物介導(dǎo)pegpf-c1轉(zhuǎn)染細(xì)胞(hek293t、hek293a、a549和lovo)的綠色熒光蛋白表達量最高，顯著高于單獨的cdg2和單獨的lipo2000。

用流式細(xì)胞術(shù)定量測定pdna/載體納米復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染效率。上一步拍照完成之后，立即用pbs緩沖液將板內(nèi)各孔細(xì)胞洗2次，加入300μl含0.25％edta的胰蛋白酶消化，再加入600μl含10％血清的dmem培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min,小心棄去上清液，最后加入300μl0.5％多聚甲醛溶液重懸細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀測定每10000個細(xì)胞中表達綠色熒光蛋白的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，得到pdna/載體納米復(fù)合物的的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果見圖5-圖8。從圖中可以看出：cdg2和lipo2000復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率顯著高于單獨的cdg2和lipo2000。

實施例2

1、pdna/載體納米復(fù)合物的制備

(1)將cdg2配制成濃度為0.8mg/ml的水溶液；將dna配制成濃度為80ng/μl的水溶液；將dc-chol-dope配制成濃度為1mg/ml的水溶液。

(2)按以下配比配制復(fù)合物溶液，再將復(fù)合物溶液在室溫下靜置孵育30min，即分別得到pdna/cdg2納米復(fù)合物、pdna/dc-chol-dope納米復(fù)合物、pdna/cdg2/dc-chol-dope納米復(fù)合物。

pdna/cdg2復(fù)合物溶液的組成:37.5μlcdg2,75μldna,37.5μlh2o。

pdna/dc-chol-dope復(fù)合物溶液的組成:12μldc-chol-dope,75μldna,63μlh2o。

pdna/cdg2/dc-chol-dope復(fù)合物溶液的組成:6μldc-chol-dope,18.8μlcdg2,75μldna,50.2μlh2o。

hek293t細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染實驗同實施例1，用倒置相差熒光顯微鏡定性觀察的結(jié)果見圖9，用流式細(xì)胞儀定量測定的結(jié)果見圖10，從圖中可以看出：cdg2和dc-chol-dope復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率顯著高于單獨的cdg2和dc-chol-dope。

實施例3

1、pdna/載體納米復(fù)合物的制備

(1)將cdg2配制成濃度為0.8mg/ml的水溶液；將dna配制成濃度為80ng/μl的水溶液；將dosper-dope配制成濃度為1mg/ml的水溶液。

(2)按以下配比配制復(fù)合物溶液，再將復(fù)合物溶液在室溫下靜置孵育30min，即分別得到pdna/cdg2納米復(fù)合物、pdna/dosper-dope納米復(fù)合物、pdna/cdg2/dosper-dope納米復(fù)合物。

pdna/cdg2復(fù)合物溶液的組成:37.5μlcdg2,75μldna,37.5μlh2o。

pdna/dosper-dope復(fù)合物溶液的組成:12μdosper-dope,75μldna,63μlh2o。

pdna/cdg2/dosper-dope復(fù)合物溶液的組成:6μldosper-dope,18.8μlcdg2,75μldna,50.2μlh2o。

hek293t細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染實驗同實施例1，用倒置相差熒光顯微鏡定性觀察的結(jié)果見圖11，用流式細(xì)胞儀定量測定的結(jié)果見圖12，從圖中可以看出：cdg2和dosper-dope復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率顯著高于單獨的cdg2和dosper-dope。

實施例4

1、pdna/載體納米復(fù)合物的制備

(1)將cdg2配制成濃度為0.8mg/ml的水溶液；將dna配制成濃度為80ng/μl的水溶液；將dotma-dope配制成濃度為1mg/ml的水溶液。

(2)按以下配比配制復(fù)合物溶液，再將復(fù)合物溶液在室溫下靜置孵育30min，即分別得到pdna/cdg2納米復(fù)合物、pdna/dotma-dope納米復(fù)合物、pdna/cdg2/dotma-dope納米復(fù)合物。

pdna/cdg2復(fù)合物溶液的組成:37.5μlcdg2,75μldna,37.5μlh2o。

pdna/dotma-dope復(fù)合物溶液的組成:12μdotma-dope,75μldna,63μlh2o。

pdna/cdg2/dotma-dope復(fù)合物溶液的組成:6μldotma-dope,18.8μlcdg2,75μldna,50.2μlh2o。

hek293t細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染實驗同實施例1，用倒置相差熒光顯微鏡定性觀察的結(jié)果見圖13，用流式細(xì)胞儀定量測定的結(jié)果見圖14，從圖中可以看出：cdg2和dotma-dope復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率顯著高于單獨的cdg2和dotma-dope。

以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。