本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及橙皮素或橙皮苷的新用途。

背景技術(shù)：

橙皮素(3’，5，7-三羥基-4-甲氧基黃酮，3’，5，7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone)常見于柑橘類果實中。流行病學(xué)研究表明，每日增加橙皮素的攝入量能夠減少人類心血管疾病的死亡率，肺癌和哮喘。也有研究顯示，橙皮素能夠有效治療許多疾病，其能夠產(chǎn)生廣泛的生物效應(yīng)，包括血管舒張作用、抗氧化劑作用、神經(jīng)保護作用、消炎作用、抗病毒效果和降低膽固醇的作用(wangh，wangh，zhangh，etal.inhibitoryeffectsofhesperetinonnav1.5channelsstablyexpressedinhek293cellsandonthevoltage-gatedcardiacsodiumcurrentinhumanatrialmyocytes[j].actapharmacologicasinica，2016，789：98-108.)。橙皮素的結(jié)構(gòu)式如下面的式i所示。

橙皮素的配糖形式是橙皮苷。橙皮苷具有多種生物功能，如清除自由基、抗氧化作用和保護神經(jīng)，還潛在地預(yù)防老年癡呆癥、抗抑郁癥、抗炎、預(yù)防癌癥和心血管疾病(a.hirata，y.murakami，m.shoji，y.kadoma，s.fujisawa，kineticsofradical-scavengingactivityofhesperetinandhesperidinandtheirinhibitoryactivityoncox-2expression，anticancerres.25(2005)3367-3374.)。

α-葡萄糖苷酶(ec3.2.1.20)是一種分解代謝酶，能夠?qū)⒌矸奂疤窃獬善咸烟?。在人體中，α-葡萄糖苷酶調(diào)節(jié)血糖水平，提供維持健康狀態(tài)的能量。但是，對于患有ii型糖尿病的病人而言，α-葡萄糖苷酶活性高時，水解糖原能力強，提升了血漿中的葡萄糖水平，從而加重了ii型糖尿病，甚至?xí)鹋R床上的嚴重后果。

因此，出于藥用目的抑制α-葡萄糖苷酶，已經(jīng)有多種α-葡萄糖苷酶抑制劑進入臨床應(yīng)用，例如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。α-葡糖苷酶抑制劑通過維持體內(nèi)血糖在一個穩(wěn)定的水平，預(yù)防或治療糖尿病。已有的α-葡糖苷酶抑制劑(包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇)是一類具有糖結(jié)構(gòu)的新型抗糖尿病藥物，可以明顯降低ii型糖尿病人餐后血糖水平，減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生(何素婷，陳代杰.具有α-葡糖苷酶抑制作用的抗糖尿病藥物[j].工業(yè)微生物，2003，33(1)：43-49.)。

此外，也有文獻提出α-葡萄糖苷酶是一種附睪標志物(epididymalmarker)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和增長過程相關(guān)(j.f.guerin，h.b.ali，j.rollet，c.souchier，j.c.czyba，alpha-glucosidaseasaspecificepididymalenzymemarker.itsvalidityfortheetiologicdiagnosisofazoospermia，j.androl.7(1986)156-162；s.atsumi，c.nosaka，y.ochi，h.iinuma，k.umezawa，inhibitionofexperimentalmetastasisbyanalpha-glucosidaseinhibitor，1，6-epi-cyclophellitol，cancerres.53(1993)4896-4899；r.pili，j.chang，r.a.partis，r.a.mueller，f.j.chrest，a.passaniti，thealpha-glucosidaseiinhibitorcastanosperminealtersendothelialcellglycosylation，preventsangiogenesis，andinhibitstumorgrowth，cancerres.55(1995)2920-2926.)。

目前，尚需要開發(fā)新的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，驚奇地發(fā)現(xiàn)，橙皮素能夠有效地抑制α-葡糖苷酶，具有制備糖尿病特別是ii型糖尿病的藥物的潛力。由此提供了下述發(fā)明：

本發(fā)明的一個方面涉及橙皮素或其藥學(xué)上可接受的鹽或者橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備如下的(1)-(3)中任一項中的用途：

(1)α-葡糖苷酶抑制劑，

(2)治療和/或預(yù)防糖尿病的藥物，

(3)治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物例如抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和/或增長的藥物。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的用途，其中，所述糖尿病為ii型糖尿病。

在發(fā)明中，通過抑制動力學(xué)和分子動力學(xué)模擬積分法評價橙皮素對α-葡萄糖苷酶的影響。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，橙皮素能夠可逆地抑制α-葡萄糖苷酶，且抑制類型為斜率-拋物線混合類型(ic50＝0.38±0.05mm；kislope＝0.23±0.01mm)；另外，這種抑制是伴隨蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化的?；诔绕に貙Ζ?葡萄糖苷酶的抑制作用，其能夠用于制備防治糖尿病特別是ii型糖尿病(例如與α-葡萄糖苷酶相關(guān)的ii型糖尿病)的藥物。

腫瘤細胞中具有α-葡萄糖苷酶，α-葡萄糖苷酶參與到腫瘤細胞相互作用的轉(zhuǎn)移過程以及腫瘤細胞表面某些寡糖的合成。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述腫瘤轉(zhuǎn)移和/或增長為α-葡萄糖苷酶參與的腫瘤轉(zhuǎn)移和/或增長。

本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含有效量的橙皮素或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽；可選地，其還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料(例如載體或賦形劑)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的藥物組合物，其還包含選自如下的一種或多種：

阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇、二甲雙胍、促胰島素分泌劑、胰島素增敏劑、gpl-1受體激動劑、ddp-4酶抑制劑。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的藥物組合物，其為口服制劑或注射劑。

通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1重量％-90重量％的橙皮素或橙皮苷和/或其藥學(xué)上可接受的鹽。藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將橙皮素或橙皮苷和/或其藥學(xué)上可接受的鹽與一種或多種固體或液體藥物賦形劑結(jié)合，制成可作為人用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?/p>

本發(fā)明的橙皮素或橙皮苷或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片、雙層片或多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分橙皮素或橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分橙皮素或橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑等。

此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。

本發(fā)明橙皮素或橙皮苷，或其藥學(xué)上可接受的鹽的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應(yīng)，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。

可改變本發(fā)明藥物組合物中各活性成分的實際劑量水平，以便所得的活性化合物量能有效針對具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應(yīng)。劑量水平須根據(jù)具體化合物的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。

本發(fā)明在再一方面涉及一種藥物產(chǎn)品，其包含獨立包裝的藥物制劑1和藥物制劑2，其中：

所述藥物制劑1包含有效量的橙皮素或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽；

所述藥物制劑2包含選自如下的一種或多種：

阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇、二甲雙胍、促胰島素分泌劑、胰島素增敏劑、gpl-1受體激動劑、ddp-4酶抑制劑。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的藥物產(chǎn)品，其中，所述藥物制劑1或藥物制劑2獨立地為口服制劑或注射劑。

本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外抑制α-葡糖苷酶的方法，包括施加于對象有效量的橙皮素或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽的步驟；優(yōu)選地，所述對象為細胞；更優(yōu)選地，所述細胞為哺乳動物細胞或者微生物細胞。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的抑制方法，是非治療目的的。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的抑制方法，其中，所述哺乳動物細胞為人的體細胞例如人胰島細胞。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的抑制方法，其中，所述微生物細胞為細菌細胞、霉菌細胞或酵母菌細胞；優(yōu)選地，為釀酒酵母細胞。

本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預(yù)防和/或輔助治療糖尿病的方法，包括給予受試者有效量的橙皮素或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽、本發(fā)明的藥物組合物或者本發(fā)明的藥物產(chǎn)品的步驟。

當(dāng)用于上述治療和/或預(yù)防和/或輔助治療時，治療和/或預(yù)防有效量的橙皮素或橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽可以以純形式應(yīng)用，或者以藥學(xué)可接受的酯或前藥形式(在存在這些形式的情況下)應(yīng)用?；蛘撸院性摶钚猿煞峙c一種或多種藥物可接受賦形劑的藥物組合物給藥。并且應(yīng)認識到，本發(fā)明活性成分和藥物組合物的總?cè)沼昧宽氂芍髟\醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)作出決定。對于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴重程度；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體藥物組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體化合物的給藥時間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時間；與所采用的具體化合物組合使用或同時使用的藥物；及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，給藥劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。一般說來，橙皮素或橙皮苷或其藥學(xué)上可接受的鹽用于哺乳動物特別是人的劑量可以介于0.001-1000mg/kg體重/天，例如介于0.01-100mg/kg體重/天，例如介于0.01-10mg/kg體重/天。

本發(fā)明中，

術(shù)語“有效量”是指可在受試者中實現(xiàn)治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的劑量。

術(shù)語“疾病和/或病癥”是指所述受試者的一種身體狀態(tài)，該身體狀態(tài)與本發(fā)明所述疾病和/或病癥有關(guān)。

術(shù)語“受試者”可以指患者或者其它接受本發(fā)明藥物組合物以治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的動物，特別是哺乳動物，例如人、狗、猴、牛、馬等。

發(fā)明的有益效果

橙皮素或其藥學(xué)上可接受的鹽能夠有效地抑制α-葡糖苷酶，具有制備糖尿病特別是ii型糖尿病的藥物的潛力。

附圖說明

圖1a：底物體系含橙皮素的條件下，對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線。n＝4。其中，橫坐標表示橙皮素的濃度(mm)，縱坐標表示α-葡萄糖苷酶的相對活性。

圖1b：底物體系不含橙皮素的條件下，對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線。n＝4。其中，橫坐標表示橙皮素的濃度(mm)，縱坐標表示α-葡萄糖苷酶的相對活性。

圖2：橙皮素對α-葡萄糖苷酶的可逆抑制曲線。其中，橫坐標表示酶濃度[e]，縱坐標是吸光度的值。橙皮素濃度分別為0mm、0.2mm、0.5mm、1.0mm和2.0mm，在圖中依次用：■、●、▲、和◆代表?！鏊鶚擞浀那€作為對照曲線。

圖3：橙皮素對α-葡萄糖苷酶抑制作用的時間進程動力學(xué)曲線。其中，橙皮素濃度分別為0.05mm、0.2mm、0.3mm、0.5mm和0.8mm，在圖中依次用：■、●、▲、和◆代表。其中，橫坐標表示時間(min)，縱坐標表示α-葡萄糖苷酶的相對活性。

圖4a：橙皮素抑制α-葡萄糖苷酶的雙倒數(shù)曲線圖。其中，橫坐標是底物濃度的倒數(shù)，單位是mm-1，縱坐標是吸光度的值的倒數(shù)。橙皮素濃度分別為0mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm和0.4mm，在圖中依次用：■、●、▲、和◆代表。

圖4b：斜率對橙皮素濃度的二次做圖，數(shù)據(jù)來自圖4a。其中，橫坐標表示橙皮素的濃度(mm)，縱坐標表示不同濃度的橙皮素的雙倒數(shù)曲線的斜率。

圖5a：橙皮素影響下的α-葡萄糖苷酶的熒光分光光度測量圖。橫坐標是熒光分光光度計的發(fā)射波長，單位是nm，縱坐標是α-葡萄糖苷酶吸收的熒光強度。其中1-7分別依次代表橙皮素濃度0mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.1mm和0.15mm。

圖5b：α-葡萄糖苷酶吸收的熒光強度最高峰值對應(yīng)波長與橙皮素濃度二次做圖。橫坐標是橙皮素濃度，單位是mm，縱坐標是α-葡萄糖苷酶吸收的熒光強度最高峰值對應(yīng)的熒光分光光度計的發(fā)射波長，單位是nm。數(shù)據(jù)來自圖5a。

圖5c：最大熒光強度與橙皮素濃度的曲線圖。橫坐標是橙皮素濃度，單位是mm，縱坐標是橙皮素影響下的α-葡萄糖苷酶最大熒光吸收強度。

圖5d：最大熒光強度差與橙皮素濃度的二次做圖。橫坐標是橙皮素濃度的倒數(shù)，單位是mm^-1，縱坐標是消去最大自然熒光強度影響的α-葡萄糖苷酶熒光吸收強度。

圖6：ans熒光強度與橙皮素濃度的柱形圖。橫坐標是橙皮素濃度，單位是mm，縱坐標是ans熒光吸收強度。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

1.實施例所用試劑

本發(fā)明中，橙皮素、α-葡萄糖苷酶、pnpg、ans均購自sigma-aldrich(usa)公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

α-葡萄糖苷酶(來自釀酒酵母)酵母菌的α-葡萄糖苷酶和人體中的是類似的。其底物是糖原，產(chǎn)物是葡萄糖，已被證實(岳振峰，陳小霞，彭志英.α-葡萄糖苷酶研究現(xiàn)狀及進展[j].食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，26(3)：63-67.)。

pnpg，4-硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)式如下面的式ii所示。

有研究證實，α-葡萄糖苷酶是屬于鍵專一性酶，主要是作用于化學(xué)鍵，對底物配對的要求相對寬松(岳振峰，陳小霞，彭志英等.α-葡萄糖苷酶研究現(xiàn)狀及進展[j].食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，26(3)：63-67，98.)。pnpg是本領(lǐng)域人員熟知的研究α-葡萄糖苷酶應(yīng)該使用的底物。

ans，即8-苯氨基-1-萘磺酸，其結(jié)構(gòu)式如下面的式iii所示。

2.部分溶液的配制

(1)α-葡萄糖苷酶溶液：α-葡萄糖苷酶溶于50mm的磷酸緩沖液，ph7.0。α-葡萄糖苷酶配制時濃度為10μm。用于下面的實施例。如果沒有特別說明，反應(yīng)體系中α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)初始濃度均為0.1μm。

(2)pnpg溶液：溶于50mm磷酸緩沖液，ph7.0，pnpg濃度為5mm。pnpg在反應(yīng)體系中的濃度是2mm。

(3)橙皮素溶液：用100％dmso完全溶解橙皮素，再用50mm磷酸緩沖液，稀釋至橙皮素濃度為100mm，此時dmso為5％。此橙皮素溶液為母液，使用時按照需求濃度進行稀釋，稀釋液使用5％dmso。這里5％dmso由5體積的dmso與95體積的去離子水配制得到。

實施例1：橙皮素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

下面在底物體系含橙皮素和不含橙皮素兩種條件下，分別進行實驗操作。

一、底物體系含橙皮素

1.實驗方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分別與不同濃度的橙皮素溶液以20∶1的體積比混合，混合后橙皮素的濃度依次為0mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm，在25℃下水浴10min，得到11份混合物。

(2)上述混合物每份分別取10μl，加入到1ml底物體系中，其中底物體系由pnpg溶液與相應(yīng)濃度的橙皮素溶液以95∶5的體積比配制得到。這里加入橙皮素的目的是為了確保加入到底物體系之后，橙皮素的濃度與加入之前保持一致。底物pnpg的反應(yīng)初始濃度均為2.0mm，α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)初始濃度均為0.1μm。

(3)使用紫外分光光度計，在發(fā)射波長400nm/min條件下，測量α-葡萄糖苷酶的活性變化，測定溫度為25℃。

反應(yīng)的整個過程從酶促反應(yīng)動力學(xué)角度看包括3個階段：一級反應(yīng)、混合級反應(yīng)和零級反應(yīng)。需要在一級反應(yīng)反應(yīng)階段進行測量，故操作時要迅速，滴加混合物后即開始測量，經(jīng)過約1分鐘后，從儀器顯示的酶活性曲線上可看出過渡為混合及級應(yīng)，則停止測量。

上述操作，對于每個橙皮素濃度，平行進行4次實驗(n＝4)，取平均值。

2.實驗結(jié)果

結(jié)果如圖1a所示。

結(jié)果表明，橙皮素在酶活性剩余一半時的濃度(ic50)為0.38±0.05mm(n＝4)。

二、底物體系不含橙皮素(稀釋效應(yīng)實驗)

1.實驗方法

按照前面“底物體系含橙皮素”的實驗方法進行，不同之處在于底物體系含pnpg，不含橙皮素。

每個橙皮素濃度，平行進行4次實驗(n＝4)。

2.實驗結(jié)果

結(jié)果見圖1b。

由于底物體系沒有橙皮素，酶體系加入到底物體系中測活時，橙皮素就被稀釋了。圖1b顯示，通過稀釋，酶活性能夠恢復(fù)一部分，沒有完全失活。說明橙皮素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。

圖1b還顯示，甚至在完全滅活的情況下，即橙皮素濃度為2.5mm時(如圖1a，縱坐標都降到約0了)，酶的活性能夠恢復(fù)至70％。這表明橙皮素與酶是可逆結(jié)合的，酶的活性可通過簡單的稀釋效應(yīng)恢復(fù)。

實施例2：抑制可逆性的驗證實驗

為了檢測和驗證橙皮素作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的可逆性，進一步證明實施例1的實驗結(jié)果，在改變橙皮素濃度的條件下，做出酶殘余活性與酶濃度的關(guān)系。

1.實驗方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分別與不同濃度的橙皮素溶液(橙皮素濃度：0mm、0.2mm、0.5mm、1.0mm和2.0mm)以20∶1的體積比混合，25℃下水浴10min，得到5份混合物。

(2)將上述混合物分別取10μl加入到1ml底物體系中，其中底物體系由pnpg溶液與相應(yīng)濃度的橙皮素溶液以95∶5的體積比配制得到。底物pnpg的反應(yīng)初始濃度為2.0mm，[e]表示α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)初始濃度，依次為0.02μm、0.05μm、0.1μm、0.15μm、0.20μm。

(3)用紫外分光光度計測量在發(fā)射波長400nm/min條件下，α-葡萄糖苷酶的活性變化，測定溫度為25℃。具體操作參照實施例1。

上述操作，對于每個橙皮素濃度，平行進行4次實驗(n＝4)。

2.實驗結(jié)果

結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，隨著抑制劑橙皮素濃度的升高，直線穿過原點，直線的斜率逐漸降低，說明橙皮素誘導(dǎo)抑制的作用是可逆的。如果是不可逆的情況，抑制劑濃度增加的曲線會與對照曲線(即圖2中■所標記的曲線)斜率相同，并會與x軸相交于相對應(yīng)酶濃度的位置。

圖2的結(jié)果明確地證明，橙皮素與α-葡萄糖苷酶是可逆結(jié)合的。

實施例3：橙皮素對α-葡萄糖苷酶抑制作用的時間進程動力學(xué)

1.實驗方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分別與不同濃度的橙皮素溶液(0mm、1mm、4mm、6mm、10mm、16mm)以20∶1的體積比混合，得到6份混合物，在25℃下水浴，指定的時間間隔：1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min，將上述混合物分別取10μl，加入到相對應(yīng)橙皮素濃度的底物體系(1ml)中，其中底物體系由pnpg溶液與相應(yīng)濃度的橙皮素溶液以95∶5的體積比配制得到。底物pnpg的反應(yīng)初始濃度為2.0mm，α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)初始濃度為0.1μm。

(2)用紫外分光光度計在發(fā)射波長400nm/min條件下，測量α-葡萄糖苷酶的活性變化，測定溫度為25℃。具體操作參照實施例1。

2.實驗結(jié)果

如圖3所示。

圖3顯示，在橙皮素(濃度在0.05-0.8mm)與酶混合水浴的時間間隔內(nèi)，酶沒有顯著的動力學(xué)進程。酶失活的反應(yīng)在很短的時間內(nèi)就到達了平衡，這證明了橙皮素能夠非常迅速地與酶結(jié)合，并沒有經(jīng)過特殊的過程就使催化活動失活，同時說明了α-葡萄糖苷酶上有橙皮素特定的結(jié)合位點。換言之，快速失活而沒有任何明顯的漸進的動態(tài)過程表明的具體對接橙皮素的位置可能位于酶活性部位的口袋里。

實施例4：橙皮素抑制α-葡萄糖苷酶的雙倒數(shù)做圖分析

1.實驗方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分別與不同濃度的橙皮素溶液(橙皮素濃度0mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm和0.4mm)以20∶1的體積比混合，在25℃下水浴10min，得到5份混合物。

(2)將上述混合物分別取10μl，加入到相對應(yīng)橙皮素濃度的1ml底物體系中，其中底物體系由pnpg溶液與相應(yīng)濃度的橙皮素溶液以95∶5的體積比配制得到。改變底物pnpg的反應(yīng)初始濃度為0.25mm、0.5mm、1.0mm、2.0mm和3.0mm，α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)初始濃度為0.1μm。

(3)用紫外分光光度計在發(fā)射波長400nm/min條件下，測量α-葡萄糖苷酶的活性變化，測定溫度為25℃。具體操作參照實施例1。

上述操作，對于每個橙皮素濃度，平行進行4次實驗(n＝4)。

傳統(tǒng)的雙倒數(shù)lineweaver-burk做圖法被用來確定抑制機制和動力學(xué)參數(shù)。lb雙倒數(shù)圖中，表觀最大反應(yīng)速率vmax變化顯著，同時米氏常數(shù)km值也變化，其中米氏常數(shù)km的物理意義為：當(dāng)酶反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度。并進行動力學(xué)參數(shù)的計算。

2.實驗結(jié)果

如圖4a和圖4b所示。

圖4a顯示，橙皮素對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為混合型抑制。

圖4b顯示，斜率對橙皮素濃度的二次做圖并不是線性的，而是拋物線，表明橙皮素能夠?qū)Ζ?葡萄糖苷酶有多重抑制位點。

通過計算，得到動力學(xué)參數(shù)：α＝2.93±0.56，ki斜率＝0.23±0.01mm(n＝3)。根據(jù)計算結(jié)果，且基于km值的變化是由于橙皮素對α-葡萄糖苷酶的綁定抑制作用是劑量依賴型，可得知橙皮素能夠在鄰近底物與酶對接點附近，綁定于活性部位的口袋里的位置，它能夠影響到底物結(jié)合活性位點。

實施例5：熒光光譜測定法研究橙皮素抑制作用下α-葡萄糖苷酶三級結(jié)構(gòu)變化(1)

內(nèi)源熒光：α-葡萄糖苷酶是一種蛋白酶，用內(nèi)源熒光光譜學(xué)方法可分析蛋白酶的結(jié)構(gòu)性。α-葡萄糖苷酶在激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長300-400nm產(chǎn)生熒光發(fā)色團，通過測量能發(fā)射熒光的色氨酸、酪氨酸的變化，探測蛋白酶構(gòu)象變化。

ans作為一種熒光探針，在激發(fā)波長380nm，發(fā)射波長400-600nm，可探測蛋白酶疏水結(jié)構(gòu)的變化，從而可推測酶失活的原因。

1.實驗方法

(1)內(nèi)源熒光實驗：

α-葡萄糖苷酶溶液分別與不同濃度的橙皮素溶液(橙皮素濃度1-7分別為0mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.1mm和0.15mm)以1∶99的體積比混合，在25℃下水浴10min。酶的反應(yīng)初始濃度為1.0μm。熒光光譜儀，激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長300-400nm。

α-葡萄糖苷酶反應(yīng)初始濃度均為1.0μm，所有反應(yīng)和檢測都在50mm磷酸緩沖液中進行，25℃。

(2)ans綁定熒光實驗

α-葡萄糖苷酶溶液與不同濃度(0mm、0.5mm、1mm、2mm、3mm)的橙皮素溶液混合(α-葡萄糖苷酶溶液10μl，橙皮素溶液930μl，最終加上ans后總體積為1000μl)，在25℃條件下水浴1小時，然后加入60μlans溶液(ans溶解方法同橙皮素。100％dmso充分溶解ans，再用50mm磷酸緩沖液稀釋至ans初濃度為1mm，此時dmso為5％。)，在25℃條件下水浴40min，然后進行ans綁定熒光檢測(激發(fā)波長380nm，發(fā)射波長400-600nm)。

(3)通過內(nèi)源熒光和ans綁定熒光確定與橙皮素混合水浴后的α-葡萄糖苷酶三級結(jié)構(gòu)的變化。

2.實驗結(jié)果

如圖5a、5b、5c和5d所示。

根據(jù)內(nèi)源熒光圖5a，可以看出橙皮素對α-葡萄糖苷酶有猝滅效應(yīng)(意味著酶失活了)，從圖5b可以看出，隨著橙皮素濃度的增加，峰值波長紅移，說明酶逐漸失活。

對比圖1中的失活結(jié)果(相對活性降到約為0)，在橙皮素濃度變化范圍內(nèi)導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)變化引起的失活，說明了橙皮素結(jié)合α-葡萄糖苷酶導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變化與酶活性的喪失是同步的。

圖5c和5d分析了橙皮素的猝滅影響。圖5c為最大熒光強度的變化。圖5d為最大熒光強度差與橙皮素濃度的二次做圖。圖5c揭示了最大熒光強度與橙皮素濃度的是線性關(guān)系。通過計算得到結(jié)合常數(shù)k＝4.28±0.18mm^-1(n＝3)，結(jié)合數(shù)n＝1.06±0.19。因此，在底物時，橙皮素對于α-葡萄糖苷酶有很強的結(jié)合能力，并且極大可能有結(jié)合位點

實施例6：熒光光譜測定法研究橙皮素抑制作用下α-葡萄糖苷酶三級結(jié)構(gòu)變化(2)

1.實驗方法

(1)α-葡萄糖苷酶溶液分別與不同濃度的橙皮素溶液(0mm、0.5mm、1.0mm、2.0mm和3.0mm)以1∶93體積比混合(94單位體積)，在25℃下水浴10min，得到5個化合物。

(2)向上述每個混合物中分別加入6單位體積ans溶液(即總體積為100單位)，在25℃下，繼續(xù)水浴30min。酶的反應(yīng)初始濃度為1.0μm，ans反應(yīng)初始濃度為60μm。

(3)用熒光分光光度計，在激發(fā)波長380nm、發(fā)射波長400-600nm條件下，進行檢測。

2.實驗結(jié)果

如圖6所示。

圖6顯示，對比不加橙皮素的狀態(tài)，隨著橙皮素濃度的增加，α-葡萄糖苷酶ans綁定熒光的光譜強度也隨之有輕微的增加。這表明了α-葡萄糖苷酶的內(nèi)部疏水位置最可能位于活性位點，這個位點略微暴露在表面但不突出的位置。

此外，因為使用的橙皮素的濃度范圍與失活的濃度范圍相似，但是超過了三級結(jié)構(gòu)變化的范圍，如圖1和圖5所示(圖1和5顯示出隨著橙皮素濃度增加，酶逐漸失活)。這表明，由橙皮素引起的α-葡萄糖苷酶失活不完全是由于疏水性暴露的變化，還源于內(nèi)在區(qū)域的構(gòu)象。

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。