本發(fā)明屬于基因治療藥物領(lǐng)域，具體涉及一種microRNA及其小分子抑制劑在抑制肺腺癌干細胞特性中的應用。

背景技術(shù)：

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤之首。我國肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，年平均增長近2％。肺癌根據(jù)病理學特點的不同分為多種組織類型，肺癌組織類型不同，其治療措施也不同。根據(jù)2004版WHO分類，常見肺癌組織病理學分型分為非小細胞癌(NSCLC)和小細胞癌(SCLC)。非小細胞癌又分為鱗狀細胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大細胞癌(LCC)。不同肺癌臨床治療方案不同，預后效果也不同。因此，為了提高治療效果，肺癌的治療策略已經(jīng)從傳統(tǒng)的以分期為基礎的治療模式轉(zhuǎn)變?yōu)橐越M織學類型和基因突變?yōu)橹笇У膫€體化、精準的多學科治療模式。個體化治療提高了肺癌的治療和預后效果。

腺癌作為最常見的肺癌組織學類型，在全球及我國發(fā)病率均呈上升趨勢。流行病學研究結(jié)果顯示，非小細胞肺癌的發(fā)病有明顯的性別差異，尤其是腺癌。腺癌占原發(fā)肺癌的50％，是非吸煙患者的主要組織學類型。腫瘤干細胞理論的出現(xiàn)，無疑為腫瘤的防治提供了新思維。該理論認為惡性腫瘤組織中并不是所有腫瘤細胞都具有惡性特征，普通腫瘤細胞經(jīng)過數(shù)次短暫的分化后，即便沒有放化療等外界干預，最終也會走向死亡；僅少量腫瘤干細胞在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的作用，腫瘤干細胞具有無限增殖和多潛能分化、自我更新、高度侵襲性和成瘤性、抗凋亡及抗拒化放療等特點，是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的根源，因此針對腫瘤干細胞的治療才能從根本上治愈腫瘤。

MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約為20-24個核苷酸的小RNA，廣泛分布于人體各種組織器官，是人類基因組中最大的基因家族之一，其在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。藥物靶點的研究一直是新藥研發(fā)中最重要的內(nèi)容之一，miRNA作為廣泛參與基因表達調(diào)控的分子，無疑是藥物靶點研究的重要對象。例如，針對癌癥中的單一蛋白的抗癌藥物在臨床使用中具有一定局限性，盡管聯(lián)合治療可彌補其不足，但這常會涉及藥物之間的相互作用所帶來的副作用，并導致治療方案復雜化。與之相比，miRNA具備調(diào)控多個靶基因的天然特性，處于多靶點調(diào)控網(wǎng)絡的中心?？傮w而言，miRNA調(diào)控基因方式是多對多的，一個mRNA可以被多個miRNA調(diào)控；一個miRNA分子也可以有多個調(diào)控靶點。同一個miRNA可以在一個細胞里同時調(diào)控多個靶基因來影響該細胞的生長發(fā)育，也可以通過對不同細胞中不同的靶基因的調(diào)控使得不同的細胞行使不同的功能，如miR-221，不僅具有調(diào)節(jié)人血液系統(tǒng)、血管生成、乳腺發(fā)育等相關(guān)功能，還與肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌等癌癥相關(guān)。因此多靶點調(diào)控分子miRNA作為藥物靶點，在新藥研發(fā)中越來越受到關(guān)注。

以miRNA為靶點尋找和發(fā)現(xiàn)特異性抑制劑，逐漸成為miRNA研究的重要部分。目前廣泛使用的miRNA抑制劑主要為經(jīng)過修飾的核苷酸寡聚物，而針對miRNA的化學小分子抑制劑的研究還處在起步階段。目前，尚未有研究揭露hsa-miR-448與肺腺癌干細胞之間的關(guān)系。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種microRNA及其小分子抑制劑在抑制肺腺癌干細胞特性中的應用；本發(fā)明第二目的在于提供一種治療肺腺癌的藥物。

上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種微小RNAhsa-miR-448作為藥物靶標在篩選制備治療肺腺癌的藥物中的應用。

微小RNAhsa-miR-448的抑制劑在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。

優(yōu)選地，所述抑制劑為雪膽素甲。

優(yōu)選地，所述抑制劑為雪膽素乙。

優(yōu)選地，所述抑制劑為辛夷脂素。

一種用于治療肺腺癌的藥物，含有上述抑制劑。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)hsa-miR-448的表達有助于肺腺癌SPCA-1細胞的增殖，有助于維持肺腺癌SPCA-1干細胞特性；通過靶向下調(diào)hsa-miR-448的表達可以有效抑制肺腺癌SPCA-1細胞的增殖，同時降低其干細胞特性。雪膽素甲、雪膽素乙和辛夷脂素為hsa-miR-448的有效抑制劑，體內(nèi)外均可以有效抑制肺腺癌SPCA-1細胞的增殖。

附圖說明

圖1為轉(zhuǎn)染后各組細胞相對增殖活力；

圖2為轉(zhuǎn)染后各組CD133+細胞的比率及干細胞特性基因OCT4mRNA和蛋白表達水平。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和附圖詳細介紹本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果。未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如教科書和實驗指南中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件，為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知或易于獲知。

實施例1hsa-miR-448表達對肺腺癌細胞的影響

一、實驗材料

hsa-miR-448模擬物hsa-miR-448mimics、阻遏物hsa-miR-448inhibitor、hsa-miR-448模擬物陰性對照hsa-miR-448mimics negative control和阻遏物陰性對照hsa-miR-448inhibitor negative control購自廣州市銳博生物科技有限公司。

PCR引物委托廣州市銳博生物科技有限公司設計合成。

TRIzol試劑和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。

肺腺癌SPCA-1細胞株為本公司長期凍存。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司。肺腺癌SPCA-1細胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基按常規(guī)方法培養(yǎng)。

BCA蛋白濃度測定試劑盒購自西安赫特生物技術(shù)有限公司。

OCT4、β-actin一抗購于Abcam公司，HRP標記的二抗購于北京中杉金橋生物科技有限公司，CD133一抗購于Cell Signaling Technology公司，F(xiàn)ITC標記的二抗購于美國KPL公司。CCK-8試劑盒購于南京凱基生物有限公司。miRcute miRNA提取分離試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，RNeasy Mini Kit總RNA提取試劑盒購自杭州沃森生物技術(shù)有限公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，Real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

二、實驗方法

1、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

肺腺癌SPCA-1細胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基按常規(guī)方法培養(yǎng)。將SPCA-1細胞分為5組，即hsa-miR-448模擬物轉(zhuǎn)染組、阻遏物轉(zhuǎn)染組、模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染組、阻遏物陰性對照轉(zhuǎn)染組和只加轉(zhuǎn)染試劑的空白對照組。轉(zhuǎn)染在六孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)、待細胞結(jié)合度75％左右進行，每孔板加入25pmol的模擬物或阻遏物或陰性對照和10μL的轉(zhuǎn)染試劑，使模擬物或阻遏物或陰性對照的終濃度為10pmol/mL，轉(zhuǎn)染后5h換液。

轉(zhuǎn)染過程嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的操作說明進行。

2、RT-PCR法檢測hsa-miR-448表達水平

在轉(zhuǎn)染后48h收獲細胞，按照miRcute miRNA提取分離試劑盒所提供的步驟提取miRNA。用紫外分光光度儀測定所提取RNA的濃度及純度，之后按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所提供的步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA為模板，按照TaKaRa RT-PCR試劑盒提供的步驟加入相關(guān)試劑及hsa-miR-448引物，以U6為內(nèi)參，在ABI-7300實時熒光定量儀上進行PCR擴增。反應條件：95℃×3min，(95℃×12s，62℃×40s)×40循環(huán)。實驗結(jié)果采用2^-ΔΔCt法進行表達量相對定量分析。

hsa-miR-448序列：5'-UUGCAUAUGUAGGAUGUCCCAU-3'

hsa-miR-448逆轉(zhuǎn)錄引物：5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGGGACA-3'

hsa-miR-448RT-PCR上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTTGCATATGTAGGATGT-3'

hsa-miR-448RT-PCR下游引物：5'-CGCCGCAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'

3、細胞增殖活力檢測

采用CCK-8方法檢測轉(zhuǎn)染細胞的增殖活力，分別在轉(zhuǎn)染1d-6d內(nèi)檢測。細胞接種在96孔板內(nèi)，每孔內(nèi)加入5000個細胞、100μL培養(yǎng)液和10μL檢測試劑。于添加CCK-8試劑2h后上酶標儀在450nm處檢測各孔OD值，每組重復4次。

相對增殖活力(％)＝轉(zhuǎn)染組OD值/空白對照組OD值×100％。

4、流式細胞術(shù)檢測細胞表面干細胞表型CD133+的表達

在轉(zhuǎn)染后48h收獲細胞，用自配的10mM EDTA-PBS細胞消化液消化細胞，該細胞液可以避免酶類消化液對細胞膜表面結(jié)構(gòu)的破壞，消化8分鐘即可達到理想的分離效果。離心重懸細胞，細胞懸液中加入FITC-CD133直標抗體進行孵育，抗體濃度約為10μg/mL，暗室中放置1小時。再次離心重懸細胞去除未結(jié)合的抗體，調(diào)節(jié)細胞密度至2×10⁶/mL，準備上機(BD公司FACSCalibur流式細胞儀)檢測，至少檢測10000個細胞。

5、RT-PCR和Western blot檢測干細胞干性基因OCT4表達水平

RT-PCR：在轉(zhuǎn)染后48h收獲細胞，采用Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度儀測定所提取RNA的濃度及純度，結(jié)果濃度均在300ng/μL以上，OD260/OD280比值均在1.8左右。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所提供的步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA為模板，按照TaKaRa RT-PCR試劑盒提供的步驟加入相關(guān)試劑及引物，以GAPDH為內(nèi)參，在ABI-7300實時熒光定量儀上進行PCR擴增。反應條件：95℃×3min，(95℃×12s，62℃×40s)×40循環(huán)。

實驗結(jié)果采用2^-ΔΔCt法進行表達量相對定量分析。

RT-PCR引物序列設計如下：

OCT4RT-PCR上游引物：5'-ACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACT-3'；

OCT4RT-PCR下游引物：5'-CTGAATACCTTCCCAAATAGAACCC-3'

GAPDH RT-PCR上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；

GAPDH RT-PCR下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'

Western blot：在轉(zhuǎn)染后48h收獲細胞，以β-actin為內(nèi)參，步驟如下：用裂解液裂解各組細胞，勻漿后離心取上清，采用BCA試劑盒測蛋白含量。按50μg蛋白上樣行SDS-PAGE電泳。濕轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜；50g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉2h，加入OCT4一抗稀釋液和β-actin一抗稀釋液，室溫搖床輕搖過夜；TBST洗膜，加入HRP標記的二抗，室溫搖床輕搖1.5h；TBST充分漂洗，加入ECL顯色液，自動凝膠分析儀照相，以相應蛋白條帶灰度值除以內(nèi)參β-actin灰度值校正得到相應蛋白的相對表達量。

三、實驗結(jié)果

1、轉(zhuǎn)染后各組hsa-miR-448表達水平比較

與空白對照組比，hsa-miR-448模擬物轉(zhuǎn)染組細胞hsa-miR-448表達水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，hsa-miR-448阻遏物轉(zhuǎn)染組細胞hsa-miR-448表達水平顯著下調(diào)(P＜0.05)，模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染組和阻遏物陰性對照轉(zhuǎn)染組細胞hsa-miR-448表達水平無顯著變化(P＞0.05)。

結(jié)果如表1所示。

表1轉(zhuǎn)染后各組hsa-miR-448表達水平比較

2、細胞增殖活力檢測結(jié)果

與空白對照比，hsa-miR-448模擬物轉(zhuǎn)染組細胞增殖活力增強，hsa-miR-448阻遏物轉(zhuǎn)染組細胞增殖緩慢，模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染組和阻遏物陰性對照轉(zhuǎn)染組細胞增殖活力無顯著變化。

結(jié)果如圖1所示。

3、細胞表面CD133+表型分析

與空白對照組比，hsa-miR-448模擬物轉(zhuǎn)染組CD133+細胞的比率顯著升高(P＜0.05)，hsa-miR-448阻遏物轉(zhuǎn)染組CD133+細胞的比率顯著降低(P＜0.05)，模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染組和阻遏物陰性對照轉(zhuǎn)染組CD133+細胞的比率無顯著變化。結(jié)果如表2和圖2所示。

表2轉(zhuǎn)染后各組CD133+細胞的比率比較

4、各組干細胞特性基因OCT4mRNA和蛋白表達水平

與空白對照組比，hsa-miR-448模擬物轉(zhuǎn)染組OCT4mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)，hsa-miR-448阻遏物轉(zhuǎn)染組OCT4mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)，模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染組和阻遏物陰性對照轉(zhuǎn)染組OCT4mRNA和蛋白表達水平無顯著變化。

結(jié)果如表3和圖2所示。

表3各組干細胞特性基因OCT4mRNA表達水平

上述實驗結(jié)果表明，hsa-miR-448的表達水平與肺腺癌細胞的增殖和干細胞特性維持有關(guān)，抑制hsa-miR-448的表達水平可以有效抑制肺腺癌細胞的增殖，抑制其干細胞特性。

實施例2靶向下調(diào)hsa-miR-448表達的小分子化合物的發(fā)現(xiàn)

一、實驗材料

雪膽素甲(CAS號58546-34-2)、雪膽素乙(CAS號50298-90-3)和辛夷脂素(CAS號31008-19-2)為本公司標準品庫中儲存的化合物。將雪膽素甲、雪膽素乙和辛夷脂素分別用二甲基亞砜溶解配成濃度為1mg/mL的母液，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

其他實驗材料同實施例1。

二、實驗方法

1、細胞培養(yǎng)及化合物給藥處理

肺腺癌SPCA-1細胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基按常規(guī)方法培養(yǎng)。將SPCA-1細胞分為7組，即雪膽素甲低劑量組和高劑量組、雪膽素乙低劑量組和高劑量組、辛夷脂素低劑量組和高劑量組和只加等量溶劑的空白對照組。取對數(shù)生長期的細胞，傳到24孔板中，貼壁培養(yǎng)過夜。吸去培養(yǎng)基，加入含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，其中，低劑量組含藥培養(yǎng)基中藥物濃度為5μM，高劑量組含藥培養(yǎng)基中藥物濃度為10μM。

2、RT-PCR法檢測hsa-miR-448表達水平

給藥培養(yǎng)24h收獲細胞，按照miRcute miRNA提取分離試劑盒所提供的步驟提取miRNA。用紫外分光光度儀測定所提取RNA的濃度及純度，之后按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所提供的步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA為模板，按照TaKaRa RT-PCR試劑盒提供的步驟加入相關(guān)試劑及hsa-miR-448引物，以U6為內(nèi)參，在ABI-7300實時熒光定量儀上進行PCR擴增。反應條件：95℃×3min，(95℃×12s，62℃×40s)×40循環(huán)。實驗結(jié)果采用2^-ΔΔCt法進行表達量相對定量分析。

hsa-miR-448序列：5'-UUGCAUAUGUAGGAUGUCCCAU-3'

hsa-miR-448逆轉(zhuǎn)錄引物：5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGGGACA-3'

hsa-miR-448RT-PCR上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTTGCATATGTAGGATGT-3'

hsa-miR-448RT-PCR下游引物：5'-CGCCGCAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'

3、細胞增殖活力檢測

給藥培養(yǎng)24h收獲細胞，采用CCK-8方法檢測各組細胞的增殖活力。細胞接種在96孔板內(nèi)，每孔內(nèi)加入5000個細胞、100μL培養(yǎng)液和10μL檢測試劑。于添加CCK-8試劑2h后上酶標儀在450nm處檢測各孔OD值，每組重復4次。

4、流式細胞術(shù)檢測細胞表面干細胞表型CD133+的表達

給藥培養(yǎng)24h收獲細胞，用自配的10m MEDTA-PBS細胞消化液消化細胞，該細胞液可以避免酶類消化液對細胞膜表面結(jié)構(gòu)的破壞，消化8分鐘即可達到理想的分離效果。離心重懸細胞，細胞懸液中加入FITC-CD133直標抗體進行孵育，抗體濃度約為10μg/mL，暗室中放置1小時。再次離心重懸細胞去除未結(jié)合的抗體，調(diào)節(jié)細胞密度至2×10⁶/mL，準備上機(BD公司FACSCalibur流式細胞儀)檢測，至少檢測10000個細胞。

5、RT-PCR和Western blot檢測干細胞干性基因OCT4表達水平

RT-PCR：給藥培養(yǎng)24h收獲細胞，采用Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度儀測定所提取RNA的濃度及純度，結(jié)果濃度均在300ng/μL以上，OD260/OD280比值均在1.8左右。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所提供的步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA為模板，按照TaKaRa RT-PCR試劑盒提供的步驟加入相關(guān)試劑及引物，以GAPDH為內(nèi)參，在ABI-7300實時熒光定量儀上進行PCR擴增。反應條件：95℃×3min，(95℃×12s，62℃×40s)×40循環(huán)。

實驗結(jié)果采用2^-ΔΔCt法進行表達量相對定量分析。

RT-PCR引物序列設計如下：

OCT4RT-PCR上游引物：5'-ACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACT-3'；

OCT4RT-PCR下游引物：5'-CTGAATACCTTCCCAAATAGAACCC-3'

GAPDH RT-PCR上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；

GAPDH RT-PCR下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'

Western blot：給藥培養(yǎng)24h收獲細胞，以β-actin為內(nèi)參，步驟如下：用裂解液裂解各組細胞，勻漿后離心取上清，采用BCA試劑盒測蛋白含量。按50μg蛋白上樣行SDS-PAGE電泳。濕轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜；50g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉2h，加入OCT4一抗稀釋液和β-actin一抗稀釋液，室溫搖床輕搖過夜；TBST洗膜，加入HRP標記的二抗，室溫搖床輕搖1.5h；TBST充分漂洗，加入ECL顯色液，自動凝膠分析儀照相，以相應蛋白條帶灰度值除以內(nèi)參β-actin灰度值校正得到相應蛋白的相對表達量。

三、實驗結(jié)果

1、給藥處理后各組hsa-miR-448表達水平比較

與空白對照組相比，各給藥組細胞中hsa-miR-448表達水平顯著下調(diào)(P＜0.05)，且高劑量組比低劑量組下調(diào)更顯著，呈一定的濃度相關(guān)性。結(jié)果如表4所示。

表4給藥處理后各組hsa-miR-448表達水平

2、細胞增殖活力檢測結(jié)果

與空白對照組相比，各給藥組細胞增殖緩慢(P＜0.05)，且高劑量組比低劑量組的細胞增殖活力更弱，呈一定的濃度相關(guān)性。結(jié)果如表5所示。

表5給藥處理后各組細胞增殖活力比較

3、細胞表面CD133+表型分析

與空白對照組相比，各給藥組CD133+細胞的比率顯著降低(P＜0.05)，且高劑量組降低更明顯，呈一定的濃度相關(guān)性。結(jié)果如表6所示。

表6給藥處理后各組CD133+細胞比率比較

4、各組干細胞特性基因OCT4mRNA和蛋白表達水平

與空白對照組相比，各給藥組干細胞特性基因OCT4mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)，且高劑量組降低更明顯，呈一定的濃度相關(guān)性。結(jié)果如表7所示。

表7給藥處理后干細胞特性基因OCT4mRNA和蛋白表達水平比較

上述實驗結(jié)果表明，雪膽素甲、雪膽素乙和辛夷脂素可以顯著降低hsa-miR-448表達，抑制肺腺癌細胞增殖，抑制其干細胞特性。

實施例3靶向下調(diào)hsa-miR-448表達的小分子化合物對肺腺癌的體內(nèi)抑瘤作用

一、實驗材料

SPF級BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，7周齡，體重19.5～22.5g。所有小鼠置于溫度(22±2)℃、濕度(60±5)℃、12h明暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)。

二、實驗方法

1、動物模型的建立、分組和給藥

取對數(shù)生長期肺腺癌SPCA-1細胞用0.25％胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，臺盼藍拒染法記數(shù)活細胞數(shù)占95％以上，將細胞密度調(diào)至1×10⁷/ml，每只裸鼠取0.2ml細胞懸液接種于右大腿背側(cè)皮下，術(shù)前測量體重。接種后每日觀察，待出現(xiàn)肉眼可見移植瘤后，用游標卡尺測量移植瘤，待移植瘤體積達100mm³左右將裸鼠按瘤體積和荷瘤鼠體重均衡原則隨機分為空白對照組、雪膽素甲組、雪膽素乙組和辛夷脂素組，空白對照組給予等體積生理鹽水，給藥組給藥劑量為10mg/kg/d，經(jīng)皮下注射給藥，隔天一次，連續(xù)十次。藥物處理結(jié)束后一天，頸椎脫臼法處死裸鼠，照相，記錄裸鼠包塊形態(tài)大小，將腫塊剝出、稱重，-80℃冷藏備用。

抑瘤率的測定：

用游標卡尺測量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b)1次，腫瘤體積＝0.5×a×b²，按照如下公式計算各化合物的體內(nèi)抑瘤率：

抑瘤率(％)＝(對照組腫瘤體積-給藥組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100％。

2、RT-PCR法檢測腫瘤組織中hsa-miR-448表達水平

液氮磨組織，按照miRcute miRNA提取分離試劑盒所提供的步驟提取miRNA。用紫外分光光度儀測定所提取RNA的濃度及純度，之后按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所提供的步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA為模板，按照TaKaRa RT-PCR試劑盒提供的步驟加入相關(guān)試劑及hsa-miR-448引物，以U6為內(nèi)參，在ABI-7300實時熒光定量儀上進行PCR擴增。反應條件：95℃×3min，(95℃×12s，62℃×40s)×40循環(huán)。實驗結(jié)果采用2^-ΔΔCt法進行表達量相對定量分析。

hsa-miR-448序列：5'-UUGCAUAUGUAGGAUGUCCCAU-3'

hsa-miR-448逆轉(zhuǎn)錄引物：5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGGGACA-3'

hsa-miR-448RT-PCR上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTTGCATATGTAGGATGT-3'

hsa-miR-448RT-PCR下游引物：5'-CGCCGCAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'

三、實驗結(jié)果

1、各化合物對腫瘤生長的影響

與空白對照組相比，雪膽素甲組、雪膽素乙組和辛夷脂素組腫瘤體積明顯較小，表明雪膽素甲、雪膽素乙和辛夷脂素具有體內(nèi)抑瘤作用，各組抑瘤率如表8所示。

表8各化合物對腫瘤生長的影響

2、各化合物對腫瘤組織中hsa-miR-448表達水平影響

與空白對照組相比，雪膽素甲組、雪膽素乙組和辛夷脂素組腫瘤組織中hsa-miR-448表達水平顯著下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)果如表9所示。

表9各化合物對腫瘤組織中hsa-miR-448表達水平影響

上述結(jié)果表明，雪膽素甲、雪膽素乙和辛夷脂素對肺腺癌移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，移植瘤組織中hsa-miR-448表達水平顯著下調(diào)。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)hsa-miR-448的表達有助于肺腺癌SPCA-1細胞的增殖，有助于維持肺腺癌SPCA-1干細胞特性；通過靶向下調(diào)hsa-miR-448的表達可以有效抑制肺腺癌SPCA-1細胞的增殖，同時降低其干細胞特性。雪膽素甲、雪膽素乙和辛夷脂素為hsa-miR-448的有效抑制劑，體內(nèi)外均可以有效抑制肺腺癌SPCA-1細胞的增殖。