本發(fā)明涉及pet/mri雙模態(tài)顯像劑spio-nota-⁶⁸ga及其制備方法與用途，屬于醫(yī)學領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在腫瘤的臨床診斷中，正電子發(fā)射斷層成像(positronemissiontomography，pet)與核磁共振成像(magneticresonanceimaging，mri)發(fā)揮著越來越重要的作用，但單一模式的pet及mri在診斷中均有一定的局限性，因此，pet/mri的融合技術(shù)已成為當前影像技術(shù)不可避免的趨勢。2011年pet/mri掃描儀已進入臨床，但到目前為止仍未有用于臨床的雙模態(tài)顯像藥物問世。故而設(shè)計一種有效的雙模態(tài)顯像藥物就成為了一項重要的研究工作。本文報道了一種新的pet/mri雙模態(tài)藥物的合成和初步性質(zhì)的研究。

超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagneticironoxidenanoparticles，spion)因優(yōu)良的磁學性質(zhì)以及良好的生物相容性而廣泛用于醫(yī)學領(lǐng)域的研究，對其進行修飾后，可以將發(fā)射正電子的核素、多肽等靶向分子連接在其上面，達到靶向載藥、mrit2wi陰性造影劑、細胞磁性分離以及純化dna的效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷而提供一種新型的pet/mri雙模態(tài)探針，所述探針具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，可在活體血液中循環(huán)，為pet/mri雙模態(tài)顯像提供了良好的基礎(chǔ)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種化合物spio-nota-⁶⁸ga。

另外，本發(fā)明公開了化合物spio-nota-⁶⁸ga的制備方法：采用⁶⁸ga對前體spio-peg2000-nota進行放射性標記，即得化合物spio-nota-⁶⁸ga。

⁶⁸ga(t1/2＝68min，β⁺＝89％，ec＝11％)作為優(yōu)良的正電子顯像核素，其可直接由⁶⁸ge/⁶⁸ga發(fā)生器制備，操作簡便，半衰期68min，血液清楚快，病人受到的輻射較少，⁶⁸ga離子半徑(0.062nm)大小合適，適合nota的三氮環(huán)配體空穴，二者螯合形成的產(chǎn)物熱力學和動力學穩(wěn)定性比較高，在體內(nèi)可長期保持完整，因此本申請發(fā)明人使用⁶⁸ga對spio進行放射性標記，得到化合物spio-nota-⁶⁸ga。

優(yōu)選的，前體spio-peg2000-nota的制備方法為：使用peg2000修飾的spio將nota偶聯(lián)入納米表面，即得前體spio-peg2000-nota。

本申請發(fā)明人以spio為基礎(chǔ)將正電子核素和mri造影劑相結(jié)合形成一種新型顯像探針，其使用聚乙二醇衍生物(peg2000)修飾的spio利用表面的氨基將雙功能螯合劑1,4,7-三氮環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triaceticacid，nota)偶聯(lián)入納米表面，獲得標記前體spio-peg2000-nota。

優(yōu)選的，前體spio-peg2000-nota的制備方法包括以下步驟：(1)將nota-nhs溶解于去離子水中，攪拌混勻，至nota-nhs完全溶解；(2)將spio-peg2000-nh2溶于去離子水中，加入naoh調(diào)節(jié)ph至弱堿性；(3)將步驟(1)中溶解好的nota-nhs加入步驟(2)中的spio-peg2000-nh2溶液中，加熱、超聲，反應(yīng)結(jié)束即得前體spio-peg2000-nota。

優(yōu)選的，步驟(2)中加入naoh調(diào)節(jié)ph至9.0-10.0。

優(yōu)選的，步驟(3)中加熱溫度為40℃，超聲時間為5min。

優(yōu)選的，前體spio-peg2000-nota的制備方法還包括步驟(4)使用超濾管提純、離心，即獲得純前體spio-peg2000-nota。

優(yōu)選的，超濾管的大小為30k，離心時間為24h。

另外，本發(fā)明公開了化合物spio-nota-⁶⁸ga在腫瘤臨床診斷中的用途。

優(yōu)選的，spio-nota-⁶⁸ga在pet/mri雙模態(tài)顯像中的用途。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述化合物spio-nota-⁶⁸ga具有很高的放化純度、良好的體外穩(wěn)定性和水溶性，有利于spio-nota-⁶⁸ga在小鼠活體中的血液循環(huán)，為活體內(nèi)的生物學分布提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明所述spio-nota-⁶⁸ga的制備方法，通過在spio表面連接大環(huán)配體nota，成功合成了標記前體spio-peg2000-nota，并使用正電子放射性核素⁶⁸ga對其進行了標記，此反應(yīng)合成時間更短(10min)，反應(yīng)步驟簡單，一步合成，條件溫和(70℃)，且標記率高達99％，無需進一步純化即可用于下一步實驗，具有轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的潛質(zhì)。

附圖說明

圖1為標記前體spio-peg2000-nota的合成路線；

圖2為產(chǎn)物spio-nota-⁶⁸ga的合成路線；

圖3為spio-peg2000-nota納米粒子的粒徑和形貌(tem)圖；

圖4為spio-peg2000-nh2(a)和spio-peg2000-nota(b)的水合動力學直徑分布圖；

圖5為spio-peg2000-nh2(a)和spio-peg2000-nota(b)的zeta電位圖；

圖6為spio-peg2000-nh2(a)、spio-peg2000-nota(b)的紅外光譜圖；

圖7為spio-peg2000-nota的磁滯回線，其中橫坐標為外磁場強度，縱坐標為納米粒子磁化強度；

圖8為產(chǎn)物spio-nota-⁶⁸ga的itlc圖譜；

圖9為spio-nota-⁶⁸ga在pbs和小牛血清(fbs)中的穩(wěn)定性比較圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為放射化學純度；

圖10為spio-nota-⁶⁸ga在正常昆明小鼠的體內(nèi)分布圖(n＝3)，其中橫坐標依次為血液、心臟、肺、肝臟、脾、腎、胃、十二指腸、胰腺、腦、肌肉、骨、皮膚；

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。

1.材料與方法

1.1試劑與儀器

spio-peg2000-nh2(1mg/ml，南京先豐納米材料科技有限公司)，nota-nhs(法國chematech公司)，稀鹽酸(12.5mol/l，德國默克公司)乙酸鈉、冰乙酸等(上海百靈威化學技術(shù)有限公司)，mem培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶、pbs液等(美國gibco公司)，正常昆明小鼠，雄性，18～22g(南方醫(yī)科大學實驗動物中心)。

jem-200cx透射電鏡(日本jeol公司)，nanozs納米粒度電位儀(英國malvern公司)，振動樣品磁強計vsm7407(美國lakeshore公司)，iraffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀(日本shimadazu公司)，鍺-鎵發(fā)生器(德國itg公司)，radio-tlc(日本島津公司)，fc-3200放射檢測器(美國bioscan公司)，sn-695γ放射免疫計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)，df-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)，水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司dk-s22型)；電子天平(瑞士mettlertoledo)。

1.2前體spio-peg2000-nota的合成

前體spio-peg2000-nota的合成路線示于圖1。取3mgnota-nhs溶解于適量去離子水中，攪拌混勻，待nota-nhs完全溶解；取磁納米顆粒(spio-peg2000-nh2)5mg溶于水中，加入naoh調(diào)節(jié)ph至9.0；通n2，將溶解好的nota-nhs加入調(diào)好ph的納米顆粒中，加溫40℃，超聲分散5min，攪拌過夜，反應(yīng)24h后反應(yīng)停止；使用超濾管(30k)提純，離心24h,獲得標記前體spio-peg2000-nota。

1.3基本性質(zhì)檢測

1.3.1透射電鏡(tem)測定：取適量spio-peg2000-nota納米粒子進行研磨，以乙醇作分散劑，超聲分散后，取部分懸浮液置于銅網(wǎng)，自然干燥，采用高分辨透射電子顯微鏡觀測粒子的形態(tài)、粒徑。

1.3.2動態(tài)光散射(dls)檢測：取1％(ω/v)的spio-peg2000-nh2及spio-peg2000-nota水溶液加入石英比色皿中，使用633nm的he/ne激光在nanozs納米粒度電位分析儀樣品室中進行掃描測定。

1.3.3zeta電位測定：使用nanozs納米粒度電位分析儀測量spio-peg2000-nh2及spio-peg2000-nota電位。

1.3.4磁性分析：取適量spio-peg2000-nh2及spio-peg2000-nota裝入約7mm的棉簽管中，兩端封口于振動樣品磁強計(vsm7407)樣品艙中測試。

1.3.5傅里葉變換紅外光譜(ft-ir)測定：取適量凍干后的spio-peg2000-nh2及spio-peg2000-nota粉末分別與kbr混合后，研磨壓片，在iraffinity-1樣品艙中測定。

1.4spio-nota-⁶⁸ga的制備

產(chǎn)物spio-nota-⁶⁸ga的合成路線示于圖2。取200μlfe濃度為1mg/ml的spio-peg2000-nota于2ml小反應(yīng)瓶中，并加入500μl0.05n稀鹽酸淋洗下來的68ga(148mbq)，再加入32.5μl乙酸鈉(1mol/l),渦旋均勻后，在70℃條件下反應(yīng)10min，完成標記。

1.5標記率的測定

標記率采用快速薄層層析法(itlc)測定。取2μl反應(yīng)液點樣于itlc-sg紙(10mm×150mm上)，于超純水中上行展開，空氣中自然晾干。用bioscan放射性薄層掃描儀進行掃描，計算標記率(％)。

1.6穩(wěn)定性評價

取100ul反應(yīng)液，分別加入到500μl的小牛血清和500μl的pbs(ph＝7.24,0.02mol/l)中。置于37℃的水浴箱中孵育0.5、1、1.5、2h，分別于不同時間點取約2ul樣品用itlc法測定其放化純度，重復(fù)三次，取平均值。

1.7脂水分配系數(shù)測定

分別取10μl反應(yīng)液于1.5ml離心管中(含500μl正辛醇和500μlpbs)，用膠膜密封，充分渦旋2min后，高速離心3min(10000rpm/min)，至兩相平衡。用移液槍從有機相和水相各取樣10μl分置于兩支γ計數(shù)管中，測量其放射性計數(shù)。按下式計算脂水分配系數(shù)(logp)。重復(fù)取樣測定3次，取平均值。

logp＝log(cts正辛醇/ctspbs)，其中，cts正辛醇和ctspbs分別為正辛醇和pbs中的γ計數(shù)。

1.8正常小鼠體內(nèi)的生物分布

分別取100μl反應(yīng)液(7.4mbq)，經(jīng)尾靜脈注射入12只昆明鼠體內(nèi)，分別于注射后5min、30min、60min、120min眼球靜脈取血后，斷頸處死并解剖，分別取血液、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、胃、小腸、胰腺、腦、肌肉、骨骼、皮膚等器官或組織，稱重，γ計數(shù)，經(jīng)衰減校正后測定其每克組織的百分注射劑量率(％id/g)。

1.9結(jié)果分析與處理統(tǒng)計學分析應(yīng)用spss13.0軟件包，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，圖形均使用graphpadprism5.0制作得到。

2.結(jié)論

2.1前體spio-peg2000-nota的合成參考jarrettbr的報道，經(jīng)過設(shè)計的spio-peg2000-nh2末端含有大量氨基，其與nota-nhs酯上的羰基(堿性條件下解離出游離羧基)進行反應(yīng)，如圖1紅線所示，得到前體spio-peg2000-nota。此反應(yīng)步驟簡單，條件溫和，快速、高效。

2.2基本表征檢測

2.2.1前體spio-peg2000-nota可溶于超純水中，為淺棕色透明溶液。

2.2.2前體spio-peg2000-nota透射電鏡(tem)圖像示于圖3，電鏡下納米粒徑為8～12nm左右，呈球形，大小均勻，分散均一。

2.2.3dls分析結(jié)果如圖4，連接nota前(a)與后(b)的dls圖均顯示為單峰，連接前后納米的達爾文粒徑分別約34nm和89nm，連入nota后，達爾文粒徑明顯增大，且分布范圍較窄。

2.2.4zeta電位結(jié)果如圖5，連接nota前(a)與后(b)，由于納米表面大量氨基為羧基所取代，電位形成了翻轉(zhuǎn)(11.6mv～-29mv)。

2.2.5紅外檢測結(jié)果如圖6，nota修飾后紅外光譜(曲線b)1632.2cm^-1處(圖6b中紅線)出現(xiàn)了新的吸收峰，考慮是由新形成酰胺鍵中nh-co內(nèi)的n-h彎曲振動和c-n的伸縮振動相互作用而產(chǎn)生的。

2.2.6磁性分析結(jié)果如圖7，磁滯回曲線示，隨外磁場強度增大，納米粒子磁化強度增大，外加磁強度達到一定值(2000oe)時，磁強度增速趨于緩慢，漸達磁飽和狀態(tài)。spio-peg2000-nota比飽和磁化強度為56.04emu/g，具有良好的超順磁性，提示此前體可作為mri顯像劑的潛力。

2.3標記率測定

標記產(chǎn)物spio-nota-⁶⁸ga經(jīng)itlc分離后，用薄層放射性掃描儀檢測，結(jié)果如圖8，顯示在此展開體系中，spio-nota-⁶⁸ga保留在原點附近(rf為0～0.1)，游離的⁶⁸ga離子隨溶劑移動到層析紙前沿，其rf為0.8～1.0，系統(tǒng)自動積分測得其標記率約為99％。

2.4穩(wěn)定性評價

37℃的環(huán)境下，產(chǎn)物spio-nota-⁶⁸ga在pbs和fbs中分別孵育0.5、1、1.5、2h后，用radio-tlc測定其放射化學純度，結(jié)果見圖9。由圖知，直至120min，spio-nota-⁶⁸ga無論在pbs還是fbs中均具有良好的穩(wěn)定性，放化純度均在95％以上，表明其具有良好的體外穩(wěn)定性

2.5脂水分配系數(shù)

spio-nota-⁶⁸ga的脂水分配系數(shù)logp＝-2.60±0.13(n＝3)，表現(xiàn)為親水性。這與其表面修飾有大量peg有關(guān)，其親水特性可提高納米在活體內(nèi)的分布運轉(zhuǎn)，延長體內(nèi)循環(huán)時間。

2.6正常小鼠體內(nèi)的生物學分布

spio-nota-⁶⁸ga在正常昆明小鼠體內(nèi)生物學分布數(shù)據(jù)見圖10及表1，結(jié)果示spio-nota-⁶⁸ga主要為肝脾攝取，且隨時間延長，攝取增高，120min達最高。腎臟內(nèi)僅見少量放射性積聚，隨時間延長，放射性明顯減低。探針在血液中的廓清速度很快，隨時間延長，血液中的放射性明顯減低。在其他臟器中均未見明顯攝取。

表1spio-nota-⁶⁸ga在正常昆明小鼠的體內(nèi)分布結(jié)果

3.結(jié)論分析

本實驗制備了水溶性極佳的標記前體spio-peg2000-nota。通過tem、dls等手段表征，表明制備的前體形貌較好，分散性好，粒徑小且均一，本實驗測得的spio-peg2000-nota的tem粒徑為10nm左右，dls粒徑達89nm，其與文獻描述一致，主要由于電鏡測量的為顆粒核心粒徑，而納米粒度儀測量的是水合粒徑，包含了納米外層的水溶性包膜。弛豫率測試表明所得的納米顆粒有較高的r2弛豫率，可作為構(gòu)建pet/mri雙模態(tài)顯像劑的良好平臺。史旭東等使用⁶⁴cu對spio-dopa-peg-dota/rgd進行了標記，得到了pet/mri的雙模態(tài)探針，但其標記率相對較低，只有71％，需要dtpa進行進一步的純化；madrur使用⁹⁹tc^m標記了spio，得到了spect/mri雙模態(tài)探針用于淋巴結(jié)顯像；卻少有使用⁶⁸ga標記spio的報道，本研究采用⁶⁸ga標記spio得到spio-nota-⁶⁸ga，此反應(yīng)合成時間更短(10min)，反應(yīng)步驟簡單，一步合成，條件溫和(70℃)，且標記率高達99％，無需進一步純化即可用于下一步實驗，具有轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的潛質(zhì)。

spio-nota-⁶⁸ga在pbs與fbs中均表現(xiàn)了很高的放化純度，表明其具有良好的體外穩(wěn)定性，為進一步的體內(nèi)生物學評價奠定了良好的基礎(chǔ)。由于該納探針表面修飾有peg，其表面親水，內(nèi)核親脂，良好的水溶性和生物相容性有利于納米在小鼠活體中的血液循環(huán)，為活體內(nèi)的生物學分布提供了基礎(chǔ)。

正常小鼠體內(nèi)分布示，血液中放射性攝取在5min時最高((31.87±2.89)％id/g)，隨時間延長迅速下降，30min時即達((2.85±0.82)％id/g)，120min即降至((1.83±0.72)％id/g)表明其在血液廓清迅速；放射性標記物主要聚集于肝臟和脾臟，且隨時間延長，放射性攝取進一步升高，120min達最高，肝臟為((68.00±7.78)％id/g)，脾臟為((52.24±8.32)％id/g)；而其他器官的攝取相對較低，表明該標記物主要通過肝、脾代謝。這與粒徑＜100nm的納米體內(nèi)生物分布和代謝途徑基本一致。網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res，包括肝臟、脾臟、肺及骨髓組織)含豐富巨噬細胞，可將特定大小的納米作為異物吞噬，截留于肝脾等臟器中。laurents報道粒徑100～200nm的顆粒很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細胞吞噬而清除，到達kupffer氏細胞的溶酶體中；粒徑50～100nm顆?？蛇M入肝實質(zhì)，＜50nm的則主要分布于脾和骨髓中，本發(fā)明中spio-nota-⁶⁸ga的粒徑約為89nm，因此主要被肝、脾攝取。

4.結(jié)論

通過在spio表面連接大環(huán)配體nota，成功合成了標記前體spio-peg2000-nota，并使用正電子放射性核素⁶⁸ga對其進行了標記，反應(yīng)時間10min，反應(yīng)溫度70℃，標記率可達99％。該標記物具有較高的體外穩(wěn)定性且具有良好的水溶性。正常小鼠體內(nèi)的生物學分布揭示了其主要通過肝脾代謝，可用于后續(xù)的pet/mri雙模態(tài)顯像。

最后所應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)。