本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料領(lǐng)域，具體為一種用于修復(fù)因創(chuàng)傷、骨折、腫瘤等原因引起的骨膜損傷、缺損，或配合骨移植材料植入防止材料脫出的骨膜修補(bǔ)片、制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由于老齡化、創(chuàng)傷、腫瘤等原因造成骨折、骨不連、骨延遲愈合、骨缺損等是臨床上常見的骨科疾病，其治療研究關(guān)注于骨移植材料，而忽視骨膜重修復(fù)的重要性。而事實上，骨膜具有豐富的微血管能讓骨組織重新恢復(fù)血供，從而促進(jìn)骨缺損部位愈合，提高骨修復(fù)成功率高；并且可作為骨組織與周圍組織的重要界面，防止肌肉、肌腱、筋膜等組織長入骨缺損處，為成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞提供生長微環(huán)境，促進(jìn)骨組織再生與重建。因此一旦骨膜缺失無法恢復(fù)，骨缺損將難以自愈合。目前報道的骨膜修復(fù)材料都存在不足之處，采用脫細(xì)胞基質(zhì)材料基質(zhì)破壞較大，dna殘留過高，免疫原性去除不徹底，易引起免疫排斥反應(yīng)；采用殼聚糖、絲素蛋白等天然生物材料多采用電紡絲技術(shù)構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，無法達(dá)到天然細(xì)胞外基質(zhì)的多孔網(wǎng)絡(luò)效果；采用人工合成可降解高分子材料則會在降解過程中造成局部酸性過強(qiáng)，易引起炎癥反應(yīng)；而膠原蛋白膜則力學(xué)強(qiáng)度不足，降解過快，使用化學(xué)交聯(lián)劑會造成組織感染、炎癥與纖維包裹；或者基質(zhì)中需要添加bmp、vegf、bfgf等生長因子提高材料對組織的誘導(dǎo)再生能力。因此還沒有一種較好的骨膜修復(fù)材料，既能起到屏障作用，可將骨損傷部位與周圍組織有效隔離，防止周圍組織中的成纖維細(xì)胞侵入骨損傷部位和骨移植材料脫出，又能引導(dǎo)骨膜組織再生修復(fù)，形成血管化組織為骨再生提供營養(yǎng)物質(zhì)與氧氣，為成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞重建骨組織提供生長微環(huán)境。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種具有多層結(jié)構(gòu)、低免疫原性、降解可控、保留細(xì)胞外基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與生長因子的引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片，該修補(bǔ)片包括高孔隙率的疏松活性層與低孔隙率的致密基底層，疏松活性層和致密基底層均包括膠原蛋白、多糖物質(zhì)和活性因子，疏松活性層還包括引導(dǎo)骨再生活性因子，所述骨膜修補(bǔ)片植入體內(nèi)能被降解吸收。本發(fā)明上述的疏松活性層和致密基底層是從結(jié)構(gòu)角度的描述，實際上二者都是由小腸粘膜下層制造，包括的膠原蛋白、多糖物質(zhì)和活性因子均是制造過程從小腸粘膜下層本身保留的物質(zhì)，疏松活性層還包括引導(dǎo)骨再生活性因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白是另行加入的物質(zhì)。本發(fā)明所述的高孔隙率的疏松活性層為孔隙率75～90％的三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述的低孔隙率的致密基底層為孔隙率45～70％的三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)。上述特定的孔隙率的限定是因為：致密層用于隔離保護(hù)，防止軟組織長入骨創(chuàng)面；而疏松層適于血管化、成骨細(xì)胞長入，致密層與疏松層各自的孔隙率范圍最大程度上保證了上述效果的實現(xiàn)。本發(fā)明所述的膠原蛋白為包含i型、iii型、iv型和vi型膠原蛋白的組合物，這些組合物是小腸粘膜下層基質(zhì)材料的基本組分。本發(fā)明所述的多糖物質(zhì)為包含硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸的組合物。本發(fā)明所述的活性因子包含纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素及生長因子。本發(fā)明所述的引導(dǎo)骨再生活性因子包括誘導(dǎo)骨形成活性物質(zhì)，優(yōu)選骨形態(tài)發(fā)生蛋白。本發(fā)明所述的骨膜修補(bǔ)片植入體內(nèi)能被降解吸收，具體的能降解吸收的時間為3-6個月。軟組織創(chuàng)面恢復(fù)通常在兩周左右恢復(fù)，而硬組織創(chuàng)面(例如骨創(chuàng)面)恢復(fù)通常在三個月以上，六個月是骨重建完成的時間。因此，在3個月時仍需要骨膜修復(fù)材料存在以實現(xiàn)軟組織的隔離。至少在3個月內(nèi)不能完全降解；且在6個月以后完成降解即可。作為一些實施方式，本發(fā)明所述引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片，長1-20cm，寬1-10cm，厚度1-3mm。本發(fā)明還提供一種上述引導(dǎo)組織再生的骨膜修補(bǔ)片的制備方法，包括以下步驟：采用動物小腸粘膜下層組織(動物小腸粘膜下層)作為原料，然后經(jīng)過包括組織前置處理、病毒滅活、清洗、免疫原消除、清洗、漿料制備、活性層制備、干燥、復(fù)合成型和真空冷凍干燥的步驟，獲得清除動物源病毒風(fēng)險、細(xì)胞成分、dna成分和α-gal抗原，保留細(xì)胞外基質(zhì)成分的引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片。所述動物為哺乳動物，優(yōu)選豬或牛。本發(fā)明上述具體的引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片的制備方法，其特征在于：步驟包括：(1)原料的前置處理：取小腸粘膜下層組織材料進(jìn)行前置處理；(2)病毒滅活：采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡小腸粘膜下層組織進(jìn)行病毒滅活；(3)清洗過程：清洗步驟(2)獲得的小腸粘膜下層組織；(4)免疫原去除：采用的免疫原去除液進(jìn)行免疫原去除，免疫原去除液為溶有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，免疫原去除過程在多頻超聲環(huán)境下進(jìn)行；(5)清洗過程：進(jìn)行清洗，清洗過程在超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行，得到小腸粘膜下層基質(zhì)材料；(6)小腸粘膜下層基質(zhì)漿料制備：使用低溫破碎裝置破碎由步驟(5)得到的小腸粘膜下層基質(zhì)材料，向破碎后的所述基質(zhì)材料加入醋酸溶液，形成小腸粘膜下層基質(zhì)材料漿料；(7)活性層材料制備：將由步驟(6)得到的漿料冷凍干燥后破碎并過篩，得到小腸粘膜下層基質(zhì)顆粒，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液(bmp)與所述顆?；旌?，形成膏狀混合物；(8)干燥：將步驟(5)中得到的小腸粘膜下層基質(zhì)材料固定于成型模具并與成型模具一同放入烘箱中干燥；(9)復(fù)合成型：在由步驟(8)得到的小腸粘膜下層材料上覆蓋由步驟(7)中得到的已經(jīng)加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白的小腸粘膜下層基質(zhì)漿料；(10)真空冷凍干燥：將步驟(9)中得到的復(fù)合材料置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥。本發(fā)明步驟(2)的過氧乙酸-乙醇溶液，其中過氧乙酸的體積百分比濃度為0.1％-5％、乙醇的體積百分比濃度為5％-40％(用水配置成溶液)，過氧乙酸-乙醇溶液與小腸粘膜下層組織材料的體積比為(3-20)︰1，滅活時間2-4小時，溫度范圍為10-40℃。所述步驟(3)中清洗過程為：在超聲波清洗機(jī)中用ph值為7.2-7.4的pbs溶液清洗，然后用水清洗至檢測電導(dǎo)率為10μs/cm以下終止，得到小腸粘膜下層基質(zhì)材料，其中pbs溶液ph值范圍為6-8，所使用的水為經(jīng)過純化處理的純化水，超聲頻率優(yōu)選40khz，功率優(yōu)選3000w以上。所述步驟(4)中的免疫源去除液包括：溶解有胰蛋白酶和edta的ph值為6-8的pbs溶液；所述免疫源去除液中胰蛋白酶質(zhì)量百分比濃度為0.01-0.2％，edta的濃度0.1-1mmol/l；進(jìn)一步包括：免疫源去除液中胰蛋白酶的質(zhì)量百分比濃度為0.02-0.05％，edta的濃度為0.4-0.8mmol/l，免疫源去除液的ph值為7.0-8.0，優(yōu)選為7.2-7.5；所述免疫源去除液與小腸粘膜下層組織材料體積比為(20-40)︰1；所述步驟(4)中多頻超聲至少包括兩個超聲頻率，低頻頻率范圍為20-40khz，高頻頻率為60-90khz，其中低頻處理5-40min，高頻處理5-40min，溫度范圍為20-35℃。所述步驟(5)中清洗過程為：在超聲波清洗機(jī)中用pbs溶液清洗，然后用降溫的注射用水清洗至檢測清洗前后的注射用水電導(dǎo)率差為1μs/cm以下終止，得到小腸粘膜下層基質(zhì)材料。其中pbs溶液ph值范圍為6-8，超聲頻率優(yōu)選40khz，功率優(yōu)選3000w以上。所述步驟(6)中的小腸粘膜下層基質(zhì)漿料制備，具體的為：使用低溫破碎裝置破碎由步驟(5)處理得到的小腸粘膜下層基質(zhì)材料，向破碎后的所述基質(zhì)材料加入醋酸溶液形成小腸粘膜下層基質(zhì)材料漿料；其中所述醋酸溶液的質(zhì)量百分比濃度0.1％-0.8％，優(yōu)選0.2％-0.3％，小腸粘膜下層基質(zhì)材料與醋酸溶液質(zhì)量比為1:25-1:500，優(yōu)選1:50-1:100。所述步驟(7)的活性層材料制備包括：將上述獲得的漿料進(jìn)行冷凍干燥，然后用破碎裝置將已經(jīng)凍干的小腸粘膜下層基質(zhì)蓬松塊體破碎成顆粒，過篩篩選出粒徑400μm以下顆粒；將質(zhì)量百分比為0.01％-0.1％的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein,bmp)溶液加入到所述顆粒中，顆粒質(zhì)量與骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液的質(zhì)量比為1:1-5:1，溫度20℃，混合后靜置24小時備用，得到膏狀混合物。本發(fā)明上述步驟(8)所述的成型模具由帶針底板、蓋板與壓塊三部分組成，將一或多層小腸粘膜下層基質(zhì)材料平鋪于所述帶針底板上，覆蓋所述蓋板，所述蓋板上壓5-10公斤的壓塊，使得材料平整、水分從四周溢出并且材料上下層之間緊密接觸；開啟烘箱風(fēng)機(jī)，預(yù)熱至25-40℃，將小腸粘膜下層基質(zhì)材料和模具放于烘箱中，時間8-16小時，將用于提供壓力的蓋板和重物板緩緩取下，再次放于烘箱中干燥，時間需2-6小時后干燥完成。烘干后的小腸粘膜下層基質(zhì)作為基底層；本發(fā)明提到的模具的結(jié)構(gòu)可以參考發(fā)明專利zl201310203588.6和zl201310203602.2。所述步驟(9)包括：在步驟(8)處理獲得的烘干型的小腸粘膜下層基質(zhì)上覆蓋步驟(7)中得到的膏狀混合物，使所述膏狀混合物均勻平鋪在烘干的小腸粘膜下層基質(zhì)的上表面，漿料厚度為1-3mm。本發(fā)明步驟(10)所述的真空冷凍干燥，具體為：將由步驟(9)得到的復(fù)合材料放置于真空冷凍干燥機(jī)中；先預(yù)凍至-45℃，保溫1-2小時；然后開啟真空泵，調(diào)節(jié)溫度至-15℃，保溫5-7小時，再調(diào)節(jié)溫度至0℃，保溫2小時，最后調(diào)節(jié)溫度至25℃，保溫4小時，冷凍干燥裝置的腔室內(nèi)的壓強(qiáng)為1-50pa，完成真空冷凍干燥，得到最終目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明上述的引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片的制備方法，步驟還包括：(11)包裝，(12)滅菌解析。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片的應(yīng)用。具體為：可用于填充拔牙窩、牙槽嵴的擴(kuò)展與重建、牙周骨缺損充填、牙槽嵴骨增量術(shù)、上頜竇提升術(shù)、竇底抬高、水平向骨增量、垂直向骨增量的骨膜缺損修復(fù)，隔離周圍組織，引導(dǎo)骨組織再生；也可用于各類骨折、骨缺損、脊柱融合、骨腫瘤、骨不連、關(guān)節(jié)融合等造成骨膜缺損時的骨膜缺損修復(fù)，隔離周圍組織，引導(dǎo)骨組織再生。本發(fā)明的引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片，其中的基底層提供組織隔離作用、保護(hù)受損組織，活性層促進(jìn)骨膜修復(fù)，引導(dǎo)骨組織再生。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點和有益效果：(1)采用胰蛋白酶和edta，使細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接被破壞；采用低頻超聲對細(xì)胞進(jìn)行破碎，同時使用高頻超聲作用于破碎的細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步使細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)，達(dá)到脫細(xì)胞目的。采用上述方式，對整個細(xì)胞脫離基質(zhì)過程中的各個步驟進(jìn)行強(qiáng)化，使細(xì)胞被從基質(zhì)上完全脫離，到達(dá)最佳的免疫原去除效果。(2)成型工藝技術(shù)：本發(fā)明引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片為雙層結(jié)構(gòu)，起到物理隔離與為骨膜再生提供微環(huán)境的雙重作用，采用烘干與凍干相結(jié)合的方式，形成了上層疏松、下層致密的雙層復(fù)合結(jié)構(gòu)。二者孔隙率的控制非常關(guān)鍵，特定的孔隙率使得疏松層為含有引導(dǎo)骨再生的活性層，孔隙率大，有利于細(xì)胞的長入，能提高組織的修復(fù)速度，致密層為免疫原去除基質(zhì)基底層有隔離作用，有效保護(hù)被修復(fù)的組織；(3)基質(zhì)破碎技術(shù)：首先采用低溫破碎裝置將小腸粘膜下層組織粉碎碎，然后通過醋酸膨化處理，再經(jīng)過凍干形成蓬松狀、可大量吸水的疏松結(jié)構(gòu)，制備過程中形成漿料便于涂布成型；(4)添加骨形態(tài)發(fā)生蛋白技術(shù)：利用小腸微粉的強(qiáng)力吸水能力，加入含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白的溶液，可以使溶液迅速充分的進(jìn)入微粉顆粒內(nèi)部，再經(jīng)過凍干，使骨形態(tài)發(fā)生蛋白存在于小腸微粉孔徑表面并在植入體內(nèi)后釋放；(5)本發(fā)明補(bǔ)片用于骨膜損傷與缺損修復(fù)：既能起到屏障作用，可將骨損傷部位與周圍組織有效隔離，防止周圍組織中的成纖維細(xì)胞侵入骨損傷部位和骨移植材料脫出，又能引導(dǎo)骨膜組織再生修復(fù)，形成血管化組織為骨再生提供營養(yǎng)物質(zhì)與氧氣，為成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞重建骨組織提供生長微環(huán)境。附圖說明圖1所示的是本發(fā)明一種引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片的層結(jié)構(gòu)示意圖。具體實施方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述，但不局限于此。實施例1：一種引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片，按如下述方法制備：(1)組織前置處理：取小腸粘膜下層組織材料(如可以是豬小腸粘膜下層sis，或者牛小腸粘膜下層，均適應(yīng)于本發(fā)明的實施例)分割成規(guī)定尺寸，剔除無用組織(例如淋巴組織)，用水清洗，然后將清洗后的小腸粘膜下層組織材料置于篩網(wǎng)等濾水裝置上，靜置五分鐘以上，將水濾干。(2)病毒滅活：采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡小腸粘膜下層組織材料，該過程可在不銹鋼桶中進(jìn)行，濃度過氧乙酸采用體積百分比0.1％，乙醇采用體積百分比5％，滅活時間2小時，溶液與小腸粘膜下層組織材料體積比為8：1，溫度范圍為20℃。(3)清洗過程：完成病毒滅活后在超聲波清洗機(jī)中用pbs溶液清洗，然后用水清洗至檢測電導(dǎo)率為10μs/cm以下終止。其中pbs溶液ph值為7.2-7.4，水為經(jīng)過純化處理的純化水，超聲頻率40khz，超聲功率3000w。(4)免疫原去除：采用的免疫原去除液為含有質(zhì)量百分比濃度0.1％的胰蛋白酶和濃度為0.4mmol/l的edta的ph值為7.2-7.4的pbs溶液，超聲振蕩處理30min，溫度20℃，溶液與小腸粘膜下層組織材料體積比為20：1；多頻超聲包括至少兩個超聲頻率，低頻頻率范圍為25khz，高頻頻率為65khz，其中低頻處理10min，高頻處理15min，溫度范圍為20-35℃，超聲波功率在5000w以上。(5)清洗過程：完成免疫原去除后在超聲波清洗機(jī)中用pbs溶液(磷酸鹽緩沖溶液)清洗，然后用22℃的注射用水清洗至清洗前后檢測注射用水電導(dǎo)率差值為1μs/cm以下終止，得到小腸粘膜下層基質(zhì)材料。其中pbs溶液ph值為7.2-7.4。(6)小腸粘膜下層基質(zhì)漿料制備：低溫破碎裝置破碎由步驟(5)得到的小腸粘膜下層基質(zhì)材料；低溫破碎裝置可用液氮冷凍破碎裝置，將液氮與小腸粘膜下層材料送入液氮冷卻破碎裝置，小腸粘膜下層材料被液氮冷凍，利用破碎裝置的高速旋轉(zhuǎn)刀頭進(jìn)行破碎。向破碎后的所述基質(zhì)材料加入醋酸溶液形成小腸粘膜下層基質(zhì)材料漿料；其中所述醋酸溶液質(zhì)量百分比濃度為0.3％，小腸粘膜下層基質(zhì)材料與醋酸溶液質(zhì)量比為1:60。形成小腸粘膜下層漿料。(7)活性層材料制備：將由步驟(6)得到的漿料冷凍干燥后破碎并過篩，得到小腸粘膜下層基質(zhì)顆粒；將質(zhì)量百分比濃度為0.02％的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)水溶液與所述顆?；旌?，顆粒與骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液的質(zhì)量比為1:1，溫度20℃，混合后靜置24小時備用，得到膏狀混合物。(8)干燥將由步驟(5)處理得到的一層或多層小腸粘膜下層基質(zhì)材料平鋪于成型模具的帶針底板上，覆蓋蓋板，所述蓋板上壓5-10公斤的壓塊，使得材料平整、水分從四周溢出并且材料上下層之間緊密接觸。開啟烘箱風(fēng)機(jī)，預(yù)熱至25-40℃，將小腸粘膜下層基質(zhì)材料和模具放于烘箱中，時間10小時，將用于提供壓力的蓋板和重物板緩緩取下，再次放于烘箱中干燥，3小時后干燥完成。(9)復(fù)合成型在(8)步驟中烘干的小腸粘膜下層基質(zhì)材料上覆蓋步驟(7)中得到的膏狀混合物，使用刮平工具將膏狀混合物均勻平鋪在烘干的小腸粘膜下層基質(zhì)材料的上表面，厚度為1～3mm。(10)真空冷凍干燥將步驟(9)中得到的復(fù)合材料放置于真空冷凍干燥機(jī)中，關(guān)閉凍干室的門，打開循環(huán)泵約1min，開啟壓縮機(jī)對凍干箱致冷，將產(chǎn)品預(yù)凍至-45℃，保溫2小時，開啟真空泵，調(diào)節(jié)產(chǎn)品溫度約-15℃升華，6小時后，調(diào)節(jié)產(chǎn)品溫度0℃，保溫2小時，調(diào)節(jié)產(chǎn)品溫度25℃，保溫4小時，真空冷凍干燥完成。真空干燥過程中凍干室氣壓為1-50pa。通過以上方法可以得到引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片。修補(bǔ)片中包括經(jīng)歷先烘干再冷凍得到的小腸粘膜下層基質(zhì)材料形成的致密層以及經(jīng)歷先破碎后凍干的小腸粘膜下層基質(zhì)材料形成的疏松層。實施例2本發(fā)明制備方法還可以進(jìn)一步包括以下步驟：(11)包裝烘干的產(chǎn)品取出后，在模具上切割，采用雙層特衛(wèi)強(qiáng)包裝袋包裝，該過程需要無菌轉(zhuǎn)運(yùn)與操作。(12)滅菌解析：產(chǎn)品采用環(huán)氧乙烷滅菌，滅菌條件：溫度40℃，保溫時間4h，濕度70％，濃度為500mg/l，滅菌時間6h；解析過程：通風(fēng)的解析室中，溫度控制在20℃之間，時間約14天。由圖1可以看到，引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片包括兩個部分：凍干的疏松部分1和烘干的致密部分2。凍干的疏松部分1包括小腸粘膜下層凍干顆粒，并包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白；而致密部分2包括一層或多層小腸粘膜下層材料。對本實施例所得材料進(jìn)行化學(xué)成分檢測，結(jié)果如下表1所示：蛋白(％)碳水化合物(％)脂類(％)水分％灰分％生長因子％75-8515-25<1<5<1<2對實施例中樣品進(jìn)行性能檢測，檢測項目與結(jié)果如下：1)膠原蛋白亞型鑒別：采用免疫組化染色法檢測i、iii、iv型和vi型膠原蛋白，3μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。將切片移入電飯煲水浴中(內(nèi)含0.01mol/l，ph6.0的枸櫞酸三鈉緩沖液)，溫度保持在95-100℃，煮20min，進(jìn)行抗原修復(fù)，取出后在室溫下自然冷卻。磷酸鹽緩沖液(pbs)洗滌，5min×3次。二步法免疫組化：分別滴加i、iii、iv型和vi型膠原蛋白單克隆抗體一抗，濃度1：100，4℃冰箱過夜室溫下孵育60min，pbs洗滌3次。滴加envision反應(yīng)液，室溫下孵育30min。pbs洗滌3次。0.05％的3，3一二氨基聯(lián)苯胺+0.03％的h2o2顯色5-10min。流水洗，蘇木精襯染。遞增梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)樹脂封固。結(jié)果表明，顯微鏡下觀察四種染色標(biāo)本皆可見棕黃染色，為陽性，表明樣品中可檢測到i、iii、iv型和vi型膠原蛋白。2)多糖物質(zhì)含量檢測：取10個樣品，取樣，浸提，用biocolor硫酸軟骨素檢測試劑盒測試硫酸軟骨素含量，樣品中硫酸軟骨素含量平均值為5627±243μg/g；用透明質(zhì)酸檢測試劑盒測試透明質(zhì)酸(ha)含量，結(jié)果顯示，樣品的透明質(zhì)酸(ha)保留量平均值為302±73μg/g。3)活性因子種類鑒別：將樣品裁剪成20×20mm尺寸的3個樣品，pbs浸泡24h后,固定于4％多聚甲醛5-10min，用0.1mol/lpbs洗3次，每次5min，然后用玻璃細(xì)管轉(zhuǎn)至涂有多聚賴氨酸的玻片上,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。ln抗體、fn抗體和整合素效價均為1∶100，0.5％胰酶消化3-5min暴露抗原，0.1％tritonx100作用10min增加抗體的穿透性。免疫組織化學(xué)染色顯陽性，表面樣品中包含纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素及其配體的等物質(zhì)。4)生長因子殘留量：對實施例中樣品采用elisa法檢測樣品中堿性生長因子(bfgf)和血管內(nèi)皮生長因子(vegf)含量，并對免疫原去除前動物組織作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性生長因子(bfgf)免疫原去除前后含量分別為2312±202ng/l、1142±124ng/l，保留生長因子45％以上；血管內(nèi)皮生長因子(vegf)含量免疫原去除前后含量分別為810±66ng/l、341±23ng/l，保留生長因子30％以上。5)病毒檢測：選擇偽狂犬病毒為指示病毒，采用實時定量pcr法檢測病毒的dna拷貝數(shù)，檢測3批樣品。結(jié)果：病毒dna拷貝數(shù)為0。6)dna殘留：依據(jù)生物制劑殘留dna檢測方法《中國藥典》2015年版第四部，采用熒光染色法檢測實施例所提供的樣品dna殘留量，結(jié)果：實施例所提供的樣品的dna殘留量平均為3.15±0.42ng/mg。7)半乳糖苷酶(α-gal)清除率：取動物源性生物材料gal陽性參考品，gal抗原陰性參考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的gal標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，測試免疫原去除前后的測試品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液與m86抗體反應(yīng)后的上清液，加入96孔板，加二抗，加顯色劑，采用elisa方法450nm檢測吸光度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的gal值，免疫原去除處理前材料的gal值為22.61±2.40×1014/mg，實施例中樣品的gal值為0.13±0.01×1014/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.43％。8)細(xì)菌內(nèi)毒：按照gb/t14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學(xué)試驗方法》進(jìn)行檢測，共3批樣品，結(jié)果：細(xì)菌內(nèi)毒小于20eu/包裝。9)孔隙率：按照阿基米德原理，以乙醇作為浸提介質(zhì)，計算樣品致密基底層孔隙率為48.09±5.12％，疏松活性層孔隙率為85.23±6.89％10)縫合抗拉強(qiáng)度：按照實施例制備樣品，用3-0非吸收縫合線在修補(bǔ)片一端邊緣2毫米處，將縫合線與修補(bǔ)片的另一端固定在拉力儀上，以20mm/min的速度進(jìn)行拉伸，直到縫合點被撕裂，記錄最大力值，結(jié)果顯示，最大值可達(dá)13n。11)抗張強(qiáng)度：按照實施例制備樣品，將樣品裁剪成2×5cm尺寸，在相對濕度為40％-60％，溫度為22℃±2℃的條件下放置2h后立即進(jìn)行試驗。將試樣兩端固定在拉伸試驗機(jī)的夾頭上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到試樣斷裂，縱向試樣和橫向試樣分別進(jìn)行試驗。最后的測定結(jié)果顯示縱向抗張強(qiáng)度可達(dá)78n，橫向抗張強(qiáng)度可達(dá)65n。12)環(huán)氧乙烷殘留量：按gb/t14233.1-2008《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學(xué)分析法》中9的規(guī)定的方法試驗，結(jié)果：產(chǎn)品環(huán)氧乙烷殘留量不超過10μg/包裝。13)重金屬檢查：鉛、鉻按gb/t14233.1-2008中5.9.1《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學(xué)分析法》規(guī)定的方法試驗，汞、砷按gb/t14233.1-2008中5.9.3《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學(xué)分析法》規(guī)定的方法試驗，產(chǎn)品檢驗液中鉛、鉻、汞、砷總重金屬含量少于1μg/g。對實施例中樣品進(jìn)行生物相容性實驗，檢測項目包括：熱原、細(xì)胞毒性、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、皮內(nèi)反應(yīng)、急性全身毒性、ames試驗、小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變試驗、染色體畸變、植入、亞慢性毒性1)熱原按質(zhì)量比1：5浸提介質(zhì)的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質(zhì)：生理鹽水。按gb/t14233.2-2005規(guī)定的方法進(jìn)行，產(chǎn)品無熱原反應(yīng)。2)細(xì)胞毒性按質(zhì)量比1：5浸提介質(zhì)的比例，37±1℃，24±2hr制備試驗液，浸提介質(zhì)：含血清的mem培養(yǎng)基。取試驗液按照gb/t16886.5-2003中規(guī)定的試驗方法進(jìn)行試驗，結(jié)果產(chǎn)品的細(xì)胞毒性反應(yīng)不大于1級。3)遲發(fā)型超敏反應(yīng)按質(zhì)量比1：5浸提介質(zhì)的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質(zhì)：生理鹽水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分:刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗方法規(guī)定進(jìn)行試驗，結(jié)果產(chǎn)品無遲發(fā)型超敏反應(yīng)。4)皮內(nèi)反應(yīng)按質(zhì)量比1：5浸提介質(zhì)的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質(zhì)：生理鹽水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分:刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗試驗方法規(guī)定進(jìn)行試驗，結(jié)果：試驗樣品與溶劑對照平均記分之差小于1.0。5)急性全身毒性按質(zhì)量比1：5浸提介質(zhì)的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質(zhì)：生理鹽水和棉籽油。取試驗液按照gb/t16886.11-2011規(guī)定的試驗方法進(jìn)行試驗，結(jié)果：產(chǎn)品無急性全身毒性反應(yīng)。6)ames試驗按質(zhì)量比1：5浸提介質(zhì)的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質(zhì)：生理鹽水和dmso。按gb/t16886.3-2008規(guī)定的方法進(jìn)行，結(jié)果：產(chǎn)品的ames試驗為陰性。7)小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變試驗按質(zhì)量比1：5浸提介質(zhì)的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質(zhì)：生理鹽水和dmso。按gb/t16886.3-2008規(guī)定的方法進(jìn)行，結(jié)果：產(chǎn)品的小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變試驗為陰性結(jié)果8)染色體畸變試驗按質(zhì)量比1：5浸提介質(zhì)的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質(zhì)：生理鹽水和dmso，按gb/t16886.3-2008規(guī)定的方法進(jìn)行，結(jié)果：產(chǎn)品的染色體畸變試驗為陰性9)植入按gb/t16886.6-1997規(guī)定的方法進(jìn)行，結(jié)果：肌肉植入1周：樣品周圍可見嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，應(yīng)無囊腔形成；肌肉植入4周：樣品周圍可見少量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，膠原纖維和纖維母細(xì)胞增生，有纖維囊腔形成；肌肉植入12周：樣品周圍可見少量淋巴細(xì)胞、膠原纖維、纖維囊腔較致密規(guī)整。10)亞慢性毒性按gb/t16886.11規(guī)定的方法進(jìn)行，結(jié)果：無亞慢性毒性反應(yīng)。對實施例中樣品進(jìn)行動物實驗，觀察骨膜生長、材料降解、引導(dǎo)骨生成效果。選擇beagle犬在前肢造橈骨骨膜缺損，并取皮質(zhì)骨作骨缺損模型，覆蓋補(bǔ)片，對側(cè)腿為空白對照。動物實驗過程：用速眠新注射液1.5ml+鹽酸氯胺酮注射液0.19+阿托品0.5mg混合液按0.4ml/kg，行肌肉注射麻醉。麻醉成功后，將動物仰臥，用繃帶將其雙后腿及嘴巴系住固定，褪毛(注意避免損破皮膚)、碘伏消毒、鋪無菌巾。于前臂中段掌側(cè)取弧形切口，切開皮膚及皮下組織，暴露腿骨，造骨膜、骨缺損模型。實驗組骨缺損處嵌插植入實施例中樣品，對照組不植入任何材料，術(shù)中不予固定，無菌生理鹽水沖洗后，逐層縫合。術(shù)后未予外固定，為預(yù)防感染，每只犬給予青霉素80萬單位肌肉注射，1次/天，連續(xù)3天，分籠喂養(yǎng)。實驗結(jié)果如下表2所示。he病理切片結(jié)果表明骨膜形成血供良好，未發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。表2本發(fā)明實施例樣品使用效果綜上，本發(fā)明的引導(dǎo)骨再生的骨膜修補(bǔ)片，具有如下的優(yōu)勢：(1)保留細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白纖維的三維空間結(jié)構(gòu)；(2)雙層結(jié)構(gòu)，起到物理隔離與為骨膜再生提供微環(huán)境的雙重作用，采用烘干與凍干相結(jié)合的方式，形成了上層疏松、下層致密的雙層復(fù)合結(jié)構(gòu)。疏松層為含有引導(dǎo)骨再生的活性層，孔隙率大，有利于細(xì)胞的長入，能提高組織的修復(fù)速度，致密層為免疫原去除基質(zhì)基底層有隔離作用，有效保護(hù)被修復(fù)的組織；(3)力學(xué)強(qiáng)度高，可控降解，與骨組織再生周期同步；(4)促進(jìn)組織血管化，降低引起感染、炎癥或纖維包裹的風(fēng)險；(5)dna殘留能夠達(dá)到10ng/mg以下，較同類產(chǎn)品低30-50ng/mg、半乳糖苷酶去除率較高，能夠達(dá)到99％以上；(6)保留細(xì)胞外基質(zhì)中活性生長因子，添加骨形態(tài)蛋白(bmp)。本發(fā)明的上述實施例是對本發(fā)明的說明而不能用于限制本發(fā)明，與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12