本發(fā)明涉及一種牛舌草提取物的制備方法和用途，該提取物可用于制備提高或改善學(xué)習(xí)記憶力藥物中的應(yīng)用，屬于中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

記憶障礙（memorydisorders），指?jìng)€(gè)人處于一種不能記住或回憶信息或技能的狀態(tài)，有可能是由于病理生理性的或情境性的原因引起的永久性或暫時(shí)性的記憶障礙。學(xué)習(xí)記憶障礙是指機(jī)體在一定誘因下出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶能力下降的一種病理狀態(tài)，根據(jù)其誘因不同可以將其分為兩類(lèi)。一類(lèi)屬于衰老性學(xué)習(xí)記憶障礙，主要誘因?yàn)槠鞴倩蚬δ艿乃ネ嗽斐傻膶W(xué)習(xí)和記憶功能的下降，常見(jiàn)的有衰老、更年期、老年癡呆、腦供血不足等；另一類(lèi)屬于疲倦性學(xué)習(xí)記憶障礙，主要是由于長(zhǎng)期或緩慢的應(yīng)激損害造成的學(xué)習(xí)和記憶功能的下降，常見(jiàn)得有亞健康，慢性疲勞，長(zhǎng)期用腦過(guò)度等。近年來(lái)科學(xué)研究證明，自由基與記憶障礙有著密切相關(guān)，體內(nèi)過(guò)多自由基在腦細(xì)胞中堆積，會(huì)引起記憶力減退或智力障礙，甚至出現(xiàn)老年癡呆。中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，乙酰膽堿（acetylcholine，ach）是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其中主要功能是維持意識(shí)的清醒，在學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用。而乙酰膽堿酯酶（acetylcholineesterase，ache）能使ach水解成膽堿和乙酸，引起中樞ach缺失，ach缺失導(dǎo)致認(rèn)知功能喪失，記憶能力減退。但目前尚無(wú)有效的方法治療記憶障礙，主要是找出原發(fā)病，針對(duì)原發(fā)病進(jìn)行治療，含卵磷脂食品、神經(jīng)遞質(zhì)的前體、利他林、雙氫麥角堿類(lèi)的擴(kuò)血管藥等療效難定。

牛舌草為紫草科植物意大利牛舌草anchusaitaliceretz.或琉璃苣borageofficinalesl.的地上部分。夏季花盛期，一般割取地上部分曬干。氣微芳香，味淡，具粘性，是維吾爾醫(yī)治療心腦血管疾病的常用藥材之一，維藥名高孜萬(wàn)。此種藥材多由巴基斯坦進(jìn)口，現(xiàn)在新疆南疆喀什地區(qū)大量人工栽培。牛舌草具有生濕生熱，調(diào)節(jié)異常黑膽質(zhì)，生濕補(bǔ)腦，祛寒補(bǔ)心，爽心悅志，潤(rùn)燥消炎，止咳平喘等功效。主治干寒性或黑膽質(zhì)性疾病，如平性腦虛，寒性心虛、心悸，抑郁癥，干性腦膜炎、肺炎及結(jié)核疾病，寒性咳嗽、感冒、氣喘等。全草經(jīng)預(yù)試有皂昔，黃酮類(lèi)，氨基酸，揮發(fā)油，勃液質(zhì)，糖類(lèi)和微量生物堿反應(yīng)。

牛舌草屬的植物在土耳其、印度和約旦民間用于治療創(chuàng)傷，胃潰瘍和尿路感染等疾患。土耳其的學(xué)者（helveticachimicaacta,93:457,2010）研究了牛舌草的化學(xué)成分，從中分離鑒定了11個(gè)化學(xué)成分，主要為三萜皂苷，黃酮類(lèi)，脂肪酸和酚酸類(lèi)化合物，并且發(fā)現(xiàn)其正丁醇萃取部位及一個(gè)黃酮類(lèi)化合物quercetin3-（a-rhamnopyranosyl-β-glucopyranoside）和一個(gè)酚酸類(lèi)化合物rosmarinicacid具有很強(qiáng)的抗dpph(2,2–diphenyl-l-picrylhydrazyl)自由基的作用。公開(kāi)號(hào)為cn103463163a的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種意大利牛舌草活性部位在具有抗氧化作用藥物、化妝品和保健品中的應(yīng)用，意大利牛舌草乙酸乙酯和正丁醇部位具有良好的抗氧化作用。

綜合現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，未發(fā)現(xiàn)牛舌草及其提取物或其所含成分提高或改善學(xué)習(xí)記憶力活性的文獻(xiàn)和專(zhuān)利報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種牛舌草提取物的制備方法和用途，用制備的牛舌草提取物加工成提高或改善學(xué)習(xí)記憶力藥物和保健品，能夠顯著提高學(xué)習(xí)記憶力活性，改善或提高學(xué)習(xí)記憶力。

本發(fā)明提供的一種牛舌草提取物的制備方法，包括如下步驟：

（1）、取干燥、粉碎的牛舌草，加入質(zhì)量比為1:10～15的75%的乙醇，浸泡8h，再加熱回流提取2～4次，每次提取時(shí)間為2～3小時(shí)，合并提取液，真空抽慮，除去不溶性物質(zhì)，濾液經(jīng)減壓濃縮至提取液無(wú)醇味，得到濃縮粗提液；

（2）、將步驟1得到的粗提液與石油醚體積比為1:3～5混合進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直至石油醚層無(wú)色，棄去石油醚層，合并水層，減壓濃縮，至0.25～1.0g生藥/ml時(shí)備用。

（3）將步驟2中濃縮液加3倍量水稀釋、靜置12h后，真空抽慮，除去不溶性物質(zhì)，濾液經(jīng)濃縮至0.25～1.0g生藥/ml時(shí)備用；

（4）、將步驟3中的濃縮液與ab-8大孔吸附樹(shù)脂以1:5～10重量比實(shí)施吸附，樹(shù)脂柱徑高比為1:1～1:6，上樣量為0.1mg/ml/毫升柱體積，吸附后先用水洗脫至流出液無(wú)色，將水洗脫液棄去后，再用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，洗脫體積為3倍柱體積，洗脫流量均為1ml/min;得到的洗脫物進(jìn)行減壓濃縮，然后真空干燥，即得所述的牛舌草提取物。

一種牛舌草提取物的用途，所述的牛舌草提取物與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑按比例混合，制成適用于臨床上使用的不同劑型的藥物組合物，再根據(jù)需要加入適當(dāng)?shù)南♂寗⒎稚?、?rùn)濕劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、增溶劑、抗氧化劑、矯味劑等賦形劑，制成合適給藥的劑型。

通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明本發(fā)明主要功效性作用如下：

可明顯縮短小鼠在水迷宮中尋找平臺(tái)的時(shí)間，增加小鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)的次數(shù)，小鼠學(xué)習(xí)記憶力明顯提高;

可明顯縮短小鼠在自主活動(dòng)儀中站立和活動(dòng)的次數(shù)，證明灌胃牛舌草提取物后的小鼠記憶學(xué)習(xí)能力有明顯的提高;

本發(fā)明的積極效果在于：本發(fā)明的提取物由單味維藥材提取制備而成，具有顯著的提高或改善學(xué)習(xí)記憶力活性，而且相比多味藥組方的中成藥易于質(zhì)量控制，同時(shí)制備工藝簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

牛舌草提取物的制備方法包括如下步驟：

取干燥、粉碎的牛舌草，加入質(zhì)量比為1:10的75%的乙醇，浸泡8h，再加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，合并提取液，真空抽慮，除去不溶性物質(zhì)，濾液經(jīng)減壓濃縮至提取液無(wú)醇味，得到濃縮粗提液。將步驟1得到的粗提液與石油醚體積比為1:3混合進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直至石油醚層無(wú)色，棄去石油醚層，合并水層，減壓濃縮，至0.5g生藥/ml時(shí)備用。將步驟2中濃縮液加3倍量水稀釋、靜置12h后，真空抽慮，除去不溶性物質(zhì)，濾液經(jīng)濃縮至0.5g生藥/ml時(shí)備用；將步驟3中的濃縮液與ab-8大孔吸附樹(shù)脂以1:5重量比實(shí)施吸附，樹(shù)脂柱徑高比為1:4，上樣量為0.1mg/ml/毫升柱體積，吸附后先用水洗脫至流出液無(wú)色，將水洗脫液棄去后，再用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，洗脫體積為3倍柱體積，洗脫流量均為1ml/min;得到的洗脫物進(jìn)行減壓濃縮，然后真空干燥，即得所述的牛舌草提取物。

實(shí)施例2：

牛舌草提取物的制備方法包括如下步驟：

取干燥、粉碎的牛舌草，加入質(zhì)量比為1:12倍體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，浸泡8h，再加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，合并提取液，真空抽慮，除去不溶性物質(zhì)，濾液經(jīng)減壓濃縮至提取液無(wú)醇味，得到濃縮粗提液。將步驟1得到的粗提液與石油醚體積比為1:4混合進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直至石油醚層無(wú)色，棄去石油醚層，合并水層，減壓濃縮，至0.5g生藥/ml時(shí)備用。將步驟2中濃縮液加3倍量水稀釋、靜置12h后，真空抽慮，除去不溶性物質(zhì)，濾液經(jīng)濃縮至1.0g生藥/ml時(shí)備用；將步驟3中的濃縮液與ab-8大孔吸附樹(shù)脂以1:6重量比實(shí)施吸附，樹(shù)脂柱徑高比為1:5，上樣量為0.1mg/ml/毫升柱體積，吸附后先用水洗脫至流出液無(wú)色，將水洗脫液棄去后，再用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，洗脫體積為3倍柱體積，洗脫流量均為1ml/min;得到的洗脫物進(jìn)行減壓濃縮，然后真空干燥，即得所述的牛舌草提取物。

實(shí)施例3：

牛舌草提取物的制備方法包括如下步驟：

取干燥、粉碎的牛舌草，加入質(zhì)量比為1:15的75%的乙醇，浸泡8h，再加熱回流提取2次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，合并提取液，真空抽慮，除去不溶性物質(zhì)，濾液經(jīng)減壓濃縮至提取液無(wú)醇味，得到濃縮粗提液。將步驟1得到的粗提液與石油醚體積比為1:5混合進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直至石油醚層無(wú)色，棄去石油醚層，合并水層，減壓濃縮，至1.0g生藥/ml時(shí)備用。將步驟2中濃縮液加3倍量水稀釋、靜置12h后，真空抽慮，除去不溶性物質(zhì)，濾液經(jīng)濃縮至1.0g生藥/ml時(shí)備用；將步驟3中的濃縮液與ab-8大孔吸附樹(shù)脂以1:4重量比實(shí)施吸附，樹(shù)脂柱徑高比為1:6，上樣量為0.1mg/ml/毫升柱體積，吸附后先用水洗脫至流出液無(wú)色，將水洗脫液棄去后，再用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，洗脫體積為3倍柱體積，洗脫流量均為1ml/min;得到的洗脫物進(jìn)行減壓濃縮，然后真空干燥，即得所述的牛舌草提取物。

本發(fā)明方法獲取牛舌草提取物的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，具有顯著的提高學(xué)習(xí)記憶力活性。

1）小鼠morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

選用體重(18-22g)，昆明雄性小鼠分為5組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、東莨菪堿模型組、牛舌草提取物高劑量組（6.0g/kg），中劑量組（4.0g/kg,）和低劑量組（2.0g/kg）、腦復(fù)康(100mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組。連續(xù)灌服各受試藥物七天后造模，正常對(duì)照組和東莨菪堿模型組每天灌服等劑量生理鹽水。除正常對(duì)照組腹腔注射等劑量生理鹽水外，其余4組小鼠腹腔注射東莨菪堿(1mg/1kg)建立癡呆模型，給予東莨菪堿30minn后進(jìn)行morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。morris水迷宮試驗(yàn)連續(xù)5天，分為定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)，前4天為定位航行試驗(yàn)。平臺(tái)設(shè)于西南象限中心，小鼠每天從東北象限和西北象限入水，記錄找到平臺(tái)時(shí)間。如未找到平臺(tái)潛伏期記錄為120s。第5天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，移去平臺(tái)，小鼠從選定象限入水，記錄小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)。

morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠在定位航行試驗(yàn)中找到平臺(tái)潛伏期顯著高于正常對(duì)照組，提示東莨菪堿所致癡呆小鼠模型復(fù)制成功。與模型組相比，牛舌草提取物低、高劑量組及腦復(fù)康組均可縮短癡呆小鼠找到平臺(tái)潛伏期，其中牛舌草提取物高劑量組和腦復(fù)康組具有顯著性差異（p<0.05）。空間探索實(shí)驗(yàn)中，與模型組小鼠相比，牛舌草提取物高、低劑量組可在一定程度上增加穿越平臺(tái)次數(shù)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腦復(fù)康組可顯著增加癡呆小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)（p<0.05），提示牛舌草提取物對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷有一定的改善作用，見(jiàn)表1、2。

2）小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)

選用體重(18-22g)，昆明小鼠分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、牛舌草提取物高劑量組（6.0g/kg），中劑量組（4.0g/kg,）和低劑量組（2.0g/kg），而空白對(duì)照組受試小鼠經(jīng)口灌胃等體積的生理鹽水，每天都灌胃給藥，連續(xù)灌胃7天后，將小鼠置于自主活動(dòng)箱中，儀器自動(dòng)記錄5min內(nèi)小鼠的自主活動(dòng)站立和活動(dòng)的次數(shù)。

自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛舌草提取物的高、中、低劑量組小鼠在自主活動(dòng)儀中的活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)與空白組相比有顯著性的差異（p<0.05），這說(shuō)明牛舌草提取物能夠改善小鼠活動(dòng)與站立的次數(shù)，使小鼠更加的熟悉并記住了自主活動(dòng)儀黑暗的環(huán)境并無(wú)危險(xiǎn)，說(shuō)明牛舌草提取物具有提高記憶力的作用，見(jiàn)表3。

通過(guò)上述行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，牛舌草提取物具有顯著的提高學(xué)習(xí)記憶力活性，表明牛舌草提取物具有提高或改善學(xué)習(xí)記憶力藥物的用途。所述的牛舌草提取物用于制備提高或改善學(xué)習(xí)記憶力的藥物和保健品。