本申請為國際申請pct/us2010/059367于2012年8月1日進入中國國家階段、申請?zhí)枮?01080062925.9、發(fā)明名稱為“基于聚(dl-乳酸-乙醇酸共聚物)(plga)的用于光動力療法(pdt)的納米粒子載體系統(tǒng)”的分案申請。

發(fā)明人：克勞斯·蘭格爾；托馬斯·克諾布洛赫；比特·羅德；安格萊特·普魯斯；沃科爾·阿爾布萊奇特；蘇珊娜·格拉菲；阿諾·維厄；哈根·馮布里森；卡林·洛和西爾維婭·瓦格內(nèi)。

受讓人：拜萊泰克制藥市場有限公司

根據(jù)35usc119(e)條的優(yōu)先權(quán)

本申請要求由klauslanger等在2009年12月11日提交的序號為61/285,895的美國臨時申請的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，所述申請題為“基于聚(dl-乳酸-乙醇酸共聚物)(plga)的用于光動力療法(pdt)的納米粒子載體系統(tǒng)(nanoparticlecarriersystemsbasedonpoly(dl-lactic-co-glycolicacid)(plga)forphotodynamictherapy(pdt))”，其通過參考結(jié)合于此。

本發(fā)明涉及含有疏水性光敏劑的納米粒子制劑的制備和它們利用靜脈內(nèi)施用在光動力療法、特別是光動力腫瘤療法中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

信息公開狀態(tài)

光動力療法(pdt)是目前正在開發(fā)用于各種醫(yī)療應(yīng)用的最有前途的新技術(shù)之一，其特別是用于破壞腫瘤的公認(rèn)療法。光動力療法利用光和光敏劑(染料)來達到它預(yù)期的醫(yī)療效果。大量天然存在和合成的染料已被評估為用于光動力療法的潛在光敏劑。研究得最廣泛的光敏劑類別也許是四吡咯大環(huán)化合物。其中，特別測試了卟啉和二氫卟酚的pdt功效。

卟啉是具有連接吡咯形成特征性的四吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)的一碳原子橋的大環(huán)化合物。有許多不同類的卟啉衍生物，包括含有一個二氫吡咯單元的二氫卟酚和含有兩個二氫吡咯單元的菌綠素。上述兩種具備用于pdt的潛力的卟啉衍生物可源自于天然來源或源自于全合成。

與卟啉相比，二氫卟酚具有的優(yōu)點為它們具備更有利的吸收譜，即，它們在電磁波譜的紅光區(qū)和近紅外區(qū)域具有更強烈的吸收。由于波長較長的光能更深地穿透入組織中，因此，當(dāng)采用pdt用于腫瘤治療時，有可能處理例如更加擴大的腫瘤。

然而，由于光敏劑(ps)的固有特點，pdt治療各類疾病的應(yīng)用已受到限制。所述光敏劑的固有特點包括它們的高成本、在宿主有機體中的長時間滯留、顯著的皮膚光毒性、在生理溶液中的溶解度低(這還降低了它們用于血管內(nèi)施用的有用性，因為它可引起血栓栓塞意外)、以及低靶向有效性。這些缺點，特別是現(xiàn)有技術(shù)中ps的缺點，已導(dǎo)致施用非常高劑量的光敏劑，這大大增加了光敏劑在非受損組織中蓄積的可能性，并伴隨著在照射時影響非受損部位的風(fēng)險。

減少成本和降低背景毒性的工作已在進行之中，但與本發(fā)明的產(chǎn)生無關(guān)。針對改善在生理溶液中的溶解度、皮膚光毒性效應(yīng)、在宿主有機體中的滯留的工作，以及針對靶向有效性程度較低的工作，在這些領(lǐng)域中，本發(fā)明對于pdt治療各種腫瘤形成、增生、和相關(guān)疾病的應(yīng)用提供了新的和不明顯的改善。

成功應(yīng)用于光動力腫瘤療法的大多數(shù)物質(zhì)是親脂性物質(zhì)，由于所述物質(zhì)固有的在水中的低溶解度，它們需要以適當(dāng)?shù)姆绞竭M行配制。因此，非常需要基于四吡咯的光敏劑的新制劑，以提高它們在體內(nèi)的攝取和它們的生物利用度。

集中研究了納米粒子作為脂溶性藥物載體。事實上，歐洲和美國的監(jiān)管當(dāng)局最近已批準(zhǔn)了抗癌藥物紫杉醇基于人血清白蛋白(hsa)的納米粒子制劑。

納米粒子通常是固體膠態(tài)粒子，典型地在10nm至1000nm的大小范圍內(nèi)。它們由大分子材料組成，活性成分被溶解、包埋、或包裹在所述大分子材料中，和/或活性成分被吸附或連接在所述大分子材料上。已研究了許多不同種類的納米粒子材料，即量子點、基于二氧化硅的納米粒子、光子晶體、脂質(zhì)體、基于天然和合成來源的不同聚合物的納米粒子、和基于金屬的納米粒子。

已研究了與光敏劑組合的納米粒子，即，用于許多應(yīng)用、包括成像方法，例如由sadoqi等在專利公布n°us2007/0148074a1中公開的包含可生物降解聚合物材料的納米粒子，所述可生物降解聚合物材料包埋了近紅外染料以在生物成像中使用它們。此外，將熒光成像與磁共振成像組合在一起的其它納米粒子系統(tǒng)，特別是與基于金屬(鐵)的納米粒子組合的納米粒子系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的(參見mulder等，nanomed.，2007，2，307-324；kim等，nanotechnol.，2002，13，610-614；primo等，j.magnetismmagn.mater.，2007，311，354-357)，但這種開發(fā)與本發(fā)明無關(guān)。另外，本領(lǐng)域已知的基于脂質(zhì)體、量子點、無機材料(包括金屬)的其它納米粒子制劑不干擾本發(fā)明。

作為光敏劑的載體系統(tǒng)，最吸引人的是由生物相容性材料組成的納米粒子。這種載體系統(tǒng)可以顯著改善光動力療法的治療方案。具有這種已知的高生物相容性的載體系統(tǒng)是例如聚(dl-乳酸-乙醇酸共聚物)(plga)。plga材料已被成功配制為納米粒子。

作為光敏劑載體的基于plga的納米粒子在本領(lǐng)域中已知有一些實例(參見gomes等，photomed.lasersurg.，2007，25，428-435；ricci-junior等，j.microencapsul，2006，23，523-538；ricci-junior等，int.j.pharm.，2006，310，187-195；saxena等，int.j.pharm.，2006，308，200-204；mccarthy等，abstractsofpapers，229^thacsmeeting，2005；vargas等，int.j.pharm.，2004，286，131-145；konan等，eur.j.pharm.sci.，2003，18，241-249；konan等，eur.j.pharm.biopharm.，2003，55，115-124；vargas等，eur.j.pharm.biopharm.，2008，69，43-53；pegaz等，j.photochem.photobiol.b：biology，2005，80，19-27)。

然而，上述的一些已知領(lǐng)域集中于其它類型的光敏劑，例如專利申請n°wo9701081a1中公開的包含光敏劑酞菁鋅(ii)和吲哚菁綠的發(fā)明，這與本發(fā)明無關(guān)。

在其他情況下，例如在allemann等的專利公布n°wo03097096a1和專利us7,455,858b2中，被用作光敏劑載體的基于plga的納米粒子旨在將所述納米粒子引入到含有血清蛋白的環(huán)境中之后快速釋放藥物、優(yōu)選在約60秒內(nèi)，因此并不非常適合于將藥物轉(zhuǎn)運到靶細(xì)胞和組織。當(dāng)光敏劑在被引入到含有血清蛋白的環(huán)境后于幾秒鐘內(nèi)釋放時，基于plga的納米粒子缺乏靶向有效性。此外，對于本領(lǐng)域已知的小尺寸和單分散的基于pla或plga的納米粒子的制備來說，采用了在水相中的范圍為約5-20％的高濃度聚乙烯醇(pva)穩(wěn)定劑。

納米粒子制劑在臨床實踐中供胃腸外施用的應(yīng)用要求能確保根據(jù)藥典規(guī)范所述的制劑的無菌性。由于納米粒子基質(zhì)材料的不穩(wěn)定性以及光敏劑的不穩(wěn)定性，包含plga的納米粒子光敏劑制劑的無菌性問題是富有挑戰(zhàn)的。常規(guī)的滅菌方法(高壓蒸汽滅菌、使用環(huán)氧乙烷、γ射線照射)與這些光敏劑制劑不相容(參見athanasiou等，biomaterials，1996，17，93-102；volland等，j.contr.rel.，1994，31，293-305)。對于這種化學(xué)和熱敏感的材料來說，備選方法是通過規(guī)定大小的膜濾器進行無菌過濾。無菌過濾的孔徑通常為0.22μm，而本發(fā)明的納米粒子在100和500nm之間的大小范圍內(nèi)。因此，無菌過濾有它的缺點，并且通常與作為本發(fā)明主題的納米粒子不相容。

此外，對于臨床應(yīng)用來說，高度希望可以將制劑冷凍干燥并在以后復(fù)溶在水性介質(zhì)中。特別是，在本發(fā)明的二氫卟酚或菌綠素型(即攜帶一個或兩個二氫吡咯單元的四吡咯)光敏劑的情況下，開發(fā)無菌納米粒子制劑和適合于冷凍干燥的納米粒子制劑是很困難的，因為這種系統(tǒng)對納米粒子制備中經(jīng)常使用的處理條件所引起的氧化和光化學(xué)改性特別敏感(參見hongying等，dyespigm，1999，43，109-117；hadjur等，j.phoiochem.photobiol.b：biology，1998，45，170-178；bonnett等，j.chem.soc.perkintram：2，1999，325-328)。這些具有一個或兩個二氫吡咯單元的二氫卟酚或菌綠素型光敏劑在它們的化學(xué)和物理行為上分別與相應(yīng)的卟啉顯著不同(參見bonnett等，j.chem.soc.perkintram：2，1999，325-328；bonnett等，j.porphyrinsphihalocyanines，2001，5，652-661)。第二點是，到目前為止僅解決了化學(xué)上更基于四吡咯的光敏劑的無菌和冷凍干燥的問題，這特別適用于allemann等描述的綠卟啉或konan等研究的光敏劑。

本領(lǐng)域已知被用作光敏劑載體的基于plga的納米粒子未解決如無菌性和冷凍干燥這種問題，若是解決了這種問題，則所研究的光敏劑由于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，在這方面是不太成問題的。

專利公布n°wo2006/133271a2的情況就是這樣，所述專利公開了包含形成納米粒子核心芯的光敏劑、可生物降解的聚合物殼、和靶向適配體(例如erbb3受體特異性適配體)的光敏劑納米粒子適配體結(jié)合物(photosensitizernanoparticleaptamerconjugates)，但既不解決納米粒子光敏劑制劑的無菌性問題，也不解決獲得穩(wěn)定的納米粒子光敏劑制劑所需要的冷凍干燥工藝問題。

不管上述缺點，本發(fā)明提供了基于plga的納米粒子制劑和制備適合于胃腸外應(yīng)用的光敏劑的方法，所述方法可制備如二氫卟酚和菌綠素這種敏感的化合物。

本領(lǐng)域中仍存在著這些問題，本發(fā)明解決了這些問題并提供了解決方案。

發(fā)明目的和概要

本發(fā)明的目的是，提供用于光動力療法的疏水性光敏劑基于生物相容性plga材料的納米粒子制劑。

本發(fā)明的另一個目的是提供四吡咯型疏水性光敏劑即二氫卟酚和菌綠素基于聚(dl-乳酸-乙醇酸共聚物)(plga)和穩(wěn)定劑的納米粒子制劑，所述穩(wěn)定劑優(yōu)選選自聚(乙烯醇)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆、和人血清白蛋白等。

本發(fā)明的又一個目的是提供疏水性光敏劑的納米粒子制劑，所述制劑能夠使粒子系統(tǒng)中的光敏劑荷載效率高度變化(2至320μg光敏劑/mg納米粒子)，從而產(chǎn)生藥物藥代動力學(xué)的高變異性的機會。

本發(fā)明的再一個目的是提供疏水性光敏劑的納米粒子制劑，所述制劑能夠?qū)⑺幬镉行У剞D(zhuǎn)運到靶細(xì)胞和組織與在細(xì)胞蓄積后釋放藥物結(jié)合起來。

本發(fā)明的再一個目的是提供平均粒度小于500nm的基于plga的荷載光敏劑的無菌納米粒子的生產(chǎn)方法，所述光敏劑為二氫卟酚或菌綠素。本發(fā)明的納米粒子是穩(wěn)定的，足以允許冷凍干燥和在水性介質(zhì)中復(fù)溶。

本發(fā)明的又一個主題是提供基于plga的納米粒子光敏劑制劑在pdt中的應(yīng)用方法，以用于但不限于治療腫瘤和其它贅生性疾病、皮膚病、眼病、泌尿系病、關(guān)節(jié)炎和類似的炎性疾病。

簡單地說，本發(fā)明提供了儲存穩(wěn)定的組合物和用于光動力療法臨床應(yīng)用的基于藥物的納米微粒制劑的生產(chǎn)方法，所述制劑包含疏水性光敏劑、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、和穩(wěn)定劑。這些納米微粒制劑提供了用于胃腸外施用的治療有效量的光敏劑。具體來說，可以使用四吡咯衍生物作為光敏劑，通過這種納米微粒制劑增強所述四吡咯衍生物的功效和安全性。本發(fā)明還教導(dǎo)了在無菌條件下制備基于plga的納米粒子的方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，基于plga的納米粒子具有小于500nm的平均粒度，并且光敏劑是替莫卟吩5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚(mthpc)。在另一個實施方式中，光敏劑2,3-二羥基-5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚(mthpd-oh)被配制為用于胃腸外施用的納米粒子。另外，在另一個實施方式中，優(yōu)選的光敏劑是5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-卟啉(mthpp)。所述制劑可用于治療增生性和贅生性病癥、炎性問題、和更特別是靶向腫瘤細(xì)胞。

結(jié)合附圖閱讀以下說明，本發(fā)明的上述和其它主題、特點、和優(yōu)點將變得顯而易見。

附圖說明

圖1描繪了本發(fā)明中使用的二氫卟酚和菌綠素的優(yōu)選結(jié)構(gòu)。

圖2描繪了用來配制在本發(fā)明的納米粒子中的特別優(yōu)選的二氫卟酚的結(jié)構(gòu)。

圖3顯示的曲線表明根據(jù)藥物與plga的比率，可以達到在2和320μgmthpp/毫克plga之間的載藥效率。

圖4的a和b顯示了具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-卟啉(mthpp)的基于plga的納米粒子的細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)分布的激光共聚焦掃描顯微鏡圖像。

圖5的a和b顯示了具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚(mthpc)的基于plga的納米粒子的細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)分布的激光共聚焦掃描顯微鏡圖像。

圖6顯示了3μmmthpc和不同的荷載mthpc的plga納米粒子在孵育不同時間后在jurkat細(xì)胞上的光毒性結(jié)果。

圖7顯示了3μmmthpc和不同的荷載mthpc的plga納米粒子在孵育不同時間后被jurkat細(xì)胞攝取入細(xì)胞內(nèi)的結(jié)果。

優(yōu)選實施方式的具體描述

所描述的本發(fā)明納米粒子系統(tǒng)的制備方法提供了即使在血清蛋白存在下也能夠在數(shù)小時期間釋放藥物并因此適合于將藥物轉(zhuǎn)運到靶細(xì)胞和組織的系統(tǒng)。這與在plga納米粒子系統(tǒng)的現(xiàn)有技術(shù)應(yīng)用中粒子立即分解和光敏劑立即釋放相反。此外，取決于在粒子制備期間使用賦形劑的方式，獲得了藥物釋放動力學(xué)的高變異性。

如上所概述，諸如無菌性和冷凍干燥的問題對光敏劑納米粒子制劑的開發(fā)是至關(guān)重要的。目前已發(fā)現(xiàn)，可以通過無菌制造過程制備這種適合于臨床應(yīng)用的基于plga的納米粒子光敏劑制劑。因此，本發(fā)明提供了平均粒度小于500nm的基于plga的荷載光敏劑的無菌納米粒子的生產(chǎn)方法，所述光敏劑為二氫卟酚或菌綠素。此外，本發(fā)明的納米粒子藥物制劑是穩(wěn)定的，足以允許冷凍干燥和在水性介質(zhì)中復(fù)溶。因此，本發(fā)明解決了用于光動力療法的疏水性光敏劑的適當(dāng)?shù)募{米粒子藥物制劑的問題，所述制劑滿足了在臨床實踐中用于胃腸外施用的需要。

基于plga的納米粒子光敏劑制劑在pdt中的治療應(yīng)用包括但不限于皮膚病、眼病、泌尿系病癥、關(guān)節(jié)炎和類似的炎性疾病。更優(yōu)選地，基于plga的納米粒子光敏劑制劑在pdt中的治療應(yīng)用包括治療腫瘤組織、腫瘤形成、增生、和相關(guān)病癥。

可以在存在量減少的穩(wěn)定劑(即10％pva)下制備用于胃腸外應(yīng)用的二氫卟酚和菌綠素基于plga的納米粒子制劑的所述納米系統(tǒng)。所述系統(tǒng)即使在血清蛋白存在下也能夠在數(shù)小時期間釋放藥物并因此適合于將藥物轉(zhuǎn)運到靶細(xì)胞和組織。延長的藥物釋放能夠使藥物靶向配體與粒子表面(例如抗體)連接，以將光敏劑更有利地轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞和組織。

本發(fā)明部分基于出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在粒子制備期間，能夠以某種方式使用賦形劑例如聚乙烯醇(pva)，使得1)將光敏劑通過摻入在粒子基質(zhì)中進行連接，2)通過吸附于粒子基質(zhì)進行連接，3)或通過摻入和吸附于粒子基質(zhì)進行連接，從而導(dǎo)致藥物釋放動力學(xué)的高變異性。

在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，基于plga的納米粒子具有小于500nm的平均粒度，并且光敏劑是替莫卟吩5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚(mthpc)。

在本發(fā)明另一個實施方式中，基于plga的納米粒子具有小于500nm的平均粒度，并且光敏劑是2,3-二羥基-5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚(mthpd-oh)。

在另一個實施方式中，基于plga的納米粒子具有小于500nm的平均粒度，并且光敏劑是5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-卟啉(mthpp)。

本發(fā)明提供了制備含有光敏劑的納米粒子制劑的方法，優(yōu)選使用二氫卟酚和菌綠素型光敏劑。通過下文公開的方法制備的納米粒子具有可預(yù)見的大小和均勻度(用粒度分布表示)。在無菌制造過程中制備納米粒子。優(yōu)選的基于plga的納米粒子具有小于500nm的平均粒度。術(shù)語“直徑”并不旨在表示納米粒子必須具有球形。該術(shù)語是指納米粒子的近似平均寬度。

在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，可以制備基于plga的納米粒子，使得光敏劑荷載量可以在寬的濃度范圍(2至320μg光敏劑/mg納米粒子)內(nèi)變化。

在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，可以制備基于plga的納米粒子，使得將光敏劑通過摻入在粒子基質(zhì)中進行連接、通過吸附于粒子基質(zhì)進行連接、或通過摻入和吸附于粒子基質(zhì)進行連接，從而導(dǎo)致藥物釋放動力學(xué)的高變異性。

可以用一種或多種與plga納米粒子結(jié)合的配體來增強本發(fā)明納米粒子系統(tǒng)的藥物靶向有效性，所述一種或多種配體通過不與光敏劑分子結(jié)合來維持光敏劑的化學(xué)完整性。

可以將本發(fā)明的納米粒子脫水以提高儲存穩(wěn)定性。優(yōu)選的脫水方法是冷凍干燥或凍干。任選地，可以使用低溫保護劑作為添加劑，以提高冷凍干燥期間和在水性介質(zhì)中復(fù)溶期間的穩(wěn)定性。

在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了基于plga的納米粒子光敏劑制劑在pdt中的應(yīng)用方法，所述方法包括施用納米粒子、它們蓄積在靶組織中、和通過特定波長的光激活光敏劑。所述施用優(yōu)選通過胃腸外手段，例如但不限于靜脈內(nèi)注射。

用于制備荷載光敏劑的納米粒子的材料

聚合物

本發(fā)明所使用的聚合物的非限制性實例為聚(dl-乳酸-乙醇酸共聚物)，其優(yōu)選特征為50:50或75:25的共聚物比率。用于本發(fā)明潛在制劑的plga得自boehringeringelheim(resomerrg502h和resomerrg504h)。

光敏劑

本發(fā)明所使用的光敏劑優(yōu)選但不限于二氫卟酚和菌綠素型四吡咯。這種光敏劑可源自于天然來源或通過全合成。通過首先合成卟啉，然后將它轉(zhuǎn)移到二氫卟酚和菌綠素系統(tǒng)中(例如r.bonnett，r.d.white，u.-j.winfield，m.c.berenbaum，作為腫瘤光敏劑的間-四(羥基苯基)卟啉系列的氫化卟啉(hydroporphyrinsofthemeso-tetra(hydroxyphenyl)porphyrinseriesastumorphotosensitizers)，biochem.j.1989，261，277-280)，可以執(zhí)行二氫卟酚和菌綠素的全合成。

本發(fā)明所使用的二氫卟酚和菌綠素具有下面在圖1中所描繪的優(yōu)選結(jié)構(gòu)。

被配制在本發(fā)明的納米粒子中的特別優(yōu)選的二氫卟酚具有圖2所描繪的結(jié)構(gòu)。

使用ultra-turrax分散裝置，通過乳化-擴散-蒸發(fā)過程制備本發(fā)明的基于plga的納米粒子?？梢詫崿F(xiàn)將光敏劑吸附性結(jié)合于粒子基質(zhì)、摻入性結(jié)合于粒子基質(zhì)中、以及吸附性和摻入性結(jié)合于粒子基質(zhì)的組合?？梢栽诘蜏乇Ｗo劑例如葡萄糖、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇等存在下將荷載藥物的納米粒子冷凍干燥。

具體實施方式

通過以下實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受此限制。

實施例1a

制備和表征具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-卟啉(mthpp)的基于plga的納米粒子；吸附和摻入性結(jié)合于粒子基質(zhì)的組合

使用ultra-turrax分散裝置(ultraturraxt25digital，ika，staufen，德國)，通過乳化-擴散-蒸發(fā)過程制備本發(fā)明的基于plga的納米粒子。

將500mg量的plga(resomerrg502h或504h)溶解在5ml乙酸乙酯(fluka，steinheim，德國)中。向該溶液中加入不同量的mthpp。評估了在1至200mg范圍內(nèi)的量。通常，使用50mgmthpp。

將該有機溶液加入到10ml的1％聚乙烯醇(pva)穩(wěn)定的水溶液中。用uitra-turrax分散裝置(17,000rpm，5分鐘)形成水包油納米乳液。在該制備步驟后，將乳液加入到40mlpva穩(wěn)定的水溶液中，以在有機溶劑完全擴散到外部水相中后引起納米粒子形成。保持恒定的機械攪拌(550rpm)18h，以讓乙酸乙酯完全蒸發(fā)。

通過將5個周期的離心(16,100g；8分鐘)和在超聲浴中重新分散在1.0ml水中(5分鐘)，來純化粒子。

用于制備粒子的所有水溶液均是無菌的，并通過孔徑為0.22μm的膜(schleicherundschiill，dassel，德國)預(yù)先過濾。將所使用的所有器械在121℃下高壓蒸汽滅菌超過20分鐘。在空氣層流柜中執(zhí)行用于制備粒子的所有操作步驟。

使用zetasizer3000hsa(malverninstruments，malvern，uk)通過光子相關(guān)光譜法測量平均粒度和多分散性。通過微重力測量法測定納米粒子含量。

直接定量程序：將plga納米粒子溶解在丙酮中，并在512nm以光度計法測量溶液的mthpp，以確定光敏劑的含量。取決于藥物與plga的比率，可以達到在2和320μgmthpp/毫克plga之間的載藥效率(圖3)。

可以根據(jù)以下方案執(zhí)行納米粒子的凍干：將海藻糖以3％(m/v)的濃度加到納米粒子樣品中，用于冷凍干燥過程。將樣品轉(zhuǎn)移到冷凍干燥器中，并以1℃/分鐘的速率將擱架溫度從5℃降低至-40℃。壓力為0.08毫巴。將這些參數(shù)保持6h。將溫度以0.5℃/分鐘從-40℃增加至-25℃來完成初次干燥。壓力保持不變。在初次干燥的加熱升溫結(jié)束時，執(zhí)行壓力上升試驗(prt)。隨著初次干燥的結(jié)束，通過將溫度以0.2℃/分鐘的速率增加至25℃，繼之以二次干燥。在60mt(＝0.08毫巴)的壓力下保持該溫度6h。

實施例1b

制備和表征具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚mthpc的基于plga的納米粒子；吸附和摻入性結(jié)合于粒子基質(zhì)的組合

除了使用mthpc代替mthpp以外，根據(jù)實施例1a制備納米粒子。在517nm以光度計法定量mthpc。取決于藥物與plga的比率，可以達到在2和320μgmthpc/毫克plga之間的載藥效率。

如實施例1a所述，表征荷載mthpc的納米粒子。

實施例1c

制備和表征具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-卟啉(mthpp)的基于plga的納米粒子；僅吸附性結(jié)合于粒子基質(zhì)

使用上述標(biāo)準(zhǔn)方法(實施例1a)制備空的plga納米粒子。除了加入光敏劑mthpp以外，如實施例1a所述執(zhí)行制備步驟。

在接下來的步驟中，制備pva穩(wěn)定的mthpp溶液。因此，將25mgmthpp溶解在5ml乙酸乙酯中，然后加入10ml1％的pva水溶液。用ultra-turrax分散裝置制備乳液。將乳液加入到40mlpva溶液(1％)中。保持恒定的機械攪拌(550rpm)18h，以讓乙酸乙酯完全蒸發(fā)。

將相當(dāng)于10mg納米粒子的plga納米粒子懸浮液體積離心(16,100g；8分鐘)，并棄去上清。使用超聲浴(5分鐘)將納米粒子重新分散在pva穩(wěn)定的mthpp溶液中。

將混合物攪拌(thermomixercomfort，eppendorf，hamburg，德國)18h(500rpm，20℃)，以達到mthpp與粒子表面的吸附平衡。如前所述純化納米粒子。

取決于藥物與plga的比率，可以達到在2和80μgmthpp(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，典型地為20μg)/毫克plga之間的載藥效率。

如實施例1a所述，對荷載(吸附)mthpp的納米粒子進行表征并凍干。

實施例1d

制備和表征具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚mthpc的基于plga的納米粒子；僅吸附性結(jié)合于粒子基質(zhì)

除了使用mthpc代替mthpp以外，根據(jù)實施例1c制備納米粒子。在517nm以光度計法定量mthpc。

取決于藥物與plga的比率，可以達到在2和80μgmthpc(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，典型地為20μg)/毫克plga之間的載藥效率。

如實施例1a所述，對荷載(吸附)mthpc的納米粒子進行表征并凍干。

實施例1e

制備和表征具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-卟啉(mthpp)的基于plga的納米粒子；僅摻入性結(jié)合于粒子基質(zhì)

根據(jù)實施例1a制備plga納米粒子。用5％(m/v)pva水溶液代替純水洗滌所產(chǎn)生的納米粒子，從而將吸附性結(jié)合的mthpp從納米粒子表面移除。在用pva溶液洗滌3個周期后，通過重復(fù)離心和再分散在凈化水中來進一步純化納米粒子。

取決于藥物與plga的比率，可以達到在15和80μgmthpp(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，典型地為50μg)/毫克plga之間的載藥效率。

如實施例1a所述，對荷載(摻入)mthpp的納米粒子進行表征并凍干。

實施例1f

制備和表征具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚mthpc的基于plga的納米粒子；僅摻入性結(jié)合于粒子基質(zhì)

除了使用mthpc代替mthpp以外，根據(jù)實施例1e制備納米粒子。在517nm以光度計法定量mthpc。

取決于藥物與plga的比率，可以達到在15和80μgmthpc(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，典型地為50μg)/毫克plga之間的載藥效率。

如實施例1a所述，對荷載(摻入)mthpc的納米粒子進行表征并凍干。

實施例2a

具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-卟啉(mthpp)的基于plga的納米粒子的相應(yīng)細(xì)胞攝取和細(xì)胞粘附

為了分別顯示基于plga的納米粒子的細(xì)胞攝取和細(xì)胞粘附、以及細(xì)胞內(nèi)分布，使用激光共聚焦掃描顯微鏡。將ht29細(xì)胞培養(yǎng)在玻片(bdbiosciencesgmbh，heidelberg)上，并與納米微粒制劑在37℃下孵育4h。之后，用pbs洗滌細(xì)胞兩次，并用伴刀豆球蛋白aalexafluor350(5μg/ml；invitrogen，karlsruhe)將膜染色2分鐘。用0.4％多聚甲醛將細(xì)胞固定6分鐘。在固定后，將細(xì)胞洗滌兩次，并包埋在vectashieldhardset封固劑(axxora，grünberg)中。用具有510nlometa裝置(zeiss，jena)、chameleon飛秒激光器或氬離子激光器、和lsm圖像檢查軟件的axiovert200m顯微鏡執(zhí)行顯微鏡分析。基于plga的納米粒子由于摻入的lumogenyellow^(r)(basf；ludwigshafen)引起的綠色熒光和光敏劑5,10,10,20-四(3-羥基苯基)卟啉(mthpp)的紅色自發(fā)熒光被用于測定分布。

圖4a和b顯示了通過激光共聚焦掃描顯微鏡研究的具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-卟啉(mthpp)的基于plga的納米粒子的細(xì)胞攝取/粘附和細(xì)胞內(nèi)分布。將ht29細(xì)胞培養(yǎng)在玻片上，并與納米粒子在37℃下孵育4h。使用光敏劑mthpp的紅色自發(fā)熒光。納米粒子含有摻入的lumogenyellow^(r)(綠色)。

(圖4a)顯示了綠色納米粒子通道；(圖4b)顯示了紅色光敏劑通道。比例尺＝20°μm。

實施例2b

具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚(mthpc)的基于plga的納米粒子的相應(yīng)細(xì)胞攝取和細(xì)胞粘附。

圖5a和b顯示了通過激光共聚焦掃描顯微鏡研究的具有光敏劑5,10,15,20-四(3-羥基苯基)-二氫卟酚(mthpc)的基于plga的納米粒子的細(xì)胞攝取/粘附和細(xì)胞內(nèi)分布。將ht29細(xì)胞培養(yǎng)在玻片上，并與納米粒子在37℃下孵育4h。使用光敏劑mthpc的紅色自發(fā)熒光。納米粒子含有摻入的lumogenyellow^(r)(綠色)。

(圖5a)顯示了綠色納米粒子通道；(圖5b)顯示了紅色光敏劑通道。比例尺＝20μm。

實施例3

荷載mthpc光敏劑的plga納米粒子的細(xì)胞內(nèi)攝取和光動力活性

針對mthpc-plga-納米粒子的細(xì)胞內(nèi)攝取和光毒性，測試表1所列的樣品。

在jurkat細(xì)胞懸液中，將所有細(xì)胞樣品與染料濃度為3μm的mthpc在培養(yǎng)基(rpm11640)中孵育1h、3h、5h、24h。

用臺盼藍(lán)試驗和凋亡的細(xì)胞形態(tài)變化評估荷載mthpc的不同plag納米粒子在孵育不同時間后對jurkat細(xì)胞的光毒性。用660nmled光源、120s的暴露時間、和290mj/cm²的光劑量執(zhí)行實驗。

圖6顯示了3μmmthpc和荷載mthpc的不同plga納米粒子在孵育不同時間后對jurkat細(xì)胞的光毒性結(jié)果。左：凋亡率，右：壞死率。(孵育參比細(xì)胞，但不用光敏劑照射)。光源：ledλexe＝660nm；暴露時間：120s；光劑量：290mj/cm²。將實驗重復(fù)2次，對于每次測量來說，在光暴露后2小時將細(xì)胞數(shù)計數(shù)3次，以得到平均值。誤差棒表示6次測量(n＝6)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

還執(zhí)行實驗以定量荷載mthpc的不同plga納米粒子的細(xì)胞內(nèi)攝取。

圖7顯示了3μmmthpc和荷載mthpc的不同plga納米粒子在孵育不同時間后被jurkat細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)攝取的結(jié)果。將實驗重復(fù)2次，對于每次測量來說，將細(xì)胞數(shù)計數(shù)3次，以得到平均值。誤差棒表示6次測量(n＝6)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在孵育后，用血球計對細(xì)胞計數(shù)，洗滌細(xì)胞(pbs，400g，3分鐘，2x)，并將細(xì)胞團冷凍儲存在-20℃過夜，以破壞細(xì)胞膜。

在乙醇中利用超聲從這些細(xì)胞提取mthpc。

利用標(biāo)準(zhǔn)的熒光系列通過熒光測定乙醇提取物中的mthpc濃度。為了計算細(xì)胞內(nèi)濃度，假定細(xì)胞直徑為10μm(測量3次)。

全部3種plga納米粒子均將mthpc轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中。當(dāng)mthpc在np中摻入時，以更快的方式發(fā)生向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運。

在孵育5h后，所有np均引起高光毒性。

已參考附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)理解本發(fā)明不限于嚴(yán)格的實施方式，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員在不背離權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的范圍下可以實現(xiàn)變化和修改。