本發(fā)明涉及神秘果葉提取物的應(yīng)用，特別涉及神秘果葉提取物在制備用于治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(alzheimerdisease，ad)，又叫老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，起病隱襲，病程呈慢性進(jìn)行性，是老年期癡呆最常見(jiàn)的一種類型。主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語(yǔ)言障礙等神經(jīng)精神癥狀，嚴(yán)重影響社交、職業(yè)與生活功能。ad的病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，特征性病理改變?yōu)棣碌矸鄣鞍壮练e形成的細(xì)胞外老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生等。

由于ad的病因及發(fā)病機(jī)制未明，目前尚無(wú)特效療法，以對(duì)癥治療為主。使用的藥物主要有膽堿、卵磷脂、毒扁豆堿和膽堿能激動(dòng)劑等，但這些藥物效果相差迥異，還會(huì)產(chǎn)生惡心、嘔吐、轉(zhuǎn)氨酶升高、灶性肝細(xì)胞壞死及抑郁等副作用。

神秘果(synsepalumdulcificumdaniell)為山欖科神秘果屬的一種奇特水果。該水果原產(chǎn)于西非熱帶地區(qū)，現(xiàn)已在我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植，一年四季均可結(jié)果。其果肉含有豐富奇特的糖蛋白、維生素、有機(jī)酸、黃酮、花青素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?，F(xiàn)階段對(duì)于神秘果的研究表明，其具有調(diào)節(jié)血壓、血脂，減輕痛風(fēng)、尿酸、頭痛等功效。神秘果葉具有治療高血壓、糖尿病以及動(dòng)脈硬化等功效，并且能夠改善胃酸過(guò)多，增強(qiáng)肝膽功能和提高免疫力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于神秘果葉提取物中包含的抗氧化物質(zhì)的活性，提供了神秘果葉提取物在預(yù)防或治療阿爾茲海默病的藥物制備中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的神秘果葉提取物對(duì)于阿爾茲海默病具有良好的預(yù)防或治療作用，同時(shí)由于其中包含的天然抗氧化活性成分，避免了惡心、嘔吐、轉(zhuǎn)氨酶升高、灶性肝細(xì)胞壞死及抑郁等副作用，具有優(yōu)異的生物活性和安全性。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種神秘果葉提取物在制備用于治療阿爾茲海默病的藥物中的應(yīng)用，所述神秘果葉提取物通過(guò)以下步驟提取：將神秘果葉干燥、粉碎，得到神秘果葉粉；向所述神秘果葉粉中加入第一醇溶液，進(jìn)行超聲提取，并離心收集上清液，剩余殘?jiān)僖酝瑯拥姆绞教崛≈辽賰纱?，合并上清液為醇提取液；所述醇提取液?jīng)減壓蒸餾、冷凍干燥得到神秘果葉粗提物；將所述神秘果葉粗提物溶解于水中，并經(jīng)大孔樹脂處理，然后用第二醇溶液洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集醇洗脫液；所述醇洗脫液經(jīng)減壓蒸餾和冷凍干燥得到神秘果葉提取物干粉。

優(yōu)選地，所述第一醇溶液為50～90％(v/v)甲醇水溶液。

根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，所述神秘果葉粉與所述第一醇溶液的比例為每克神秘果葉粉使用15～45ml第一醇溶液。

根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式，所述超聲提取的時(shí)間為0.5～1h，超聲波水浴的溫度為40～60℃。

所述第二醇溶液為10～90％(v/v)的乙醇水溶液。

根據(jù)又一個(gè)具體實(shí)施方式，所述大孔樹脂為ab-8。

優(yōu)選地，在用所述醇類洗脫劑進(jìn)行洗脫之前先用水洗脫，洗脫液棄之不用。

根據(jù)本發(fā)明的神秘果葉提取物對(duì)dpph(1,1-二苯基-2-苦苯肼)自由基具有較強(qiáng)的清除能力(ic50為83～120μg/ml)，清除能力至少是山奈酚的2倍；具有較高的鐵離子還原/抗氧化能力(frap值為6～8mm/gtrolox)，至少是山奈酚的2.5倍。上述神秘果葉提取物能夠明顯抑制線蟲株系cl4176的癱瘓，可以用于抗ad的藥物及保健品的制備。

附圖說(shuō)明

圖1示出了325nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的根據(jù)本發(fā)明的神秘果葉提取物中抗氧化物質(zhì)的uplc色譜圖。

圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的神秘果葉提取物在不同濃度下對(duì)線蟲株系cl4176的癱瘓抑制作用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種神秘果葉提取物在制備用于治療阿爾茲海默病的藥物中的應(yīng)用，所述神秘果葉提取物通過(guò)以下步驟提取：將神秘果葉干燥、粉碎，得到神秘果葉粉；向所述神秘果葉粉中加入第一醇溶液，進(jìn)行超聲提取，并離心收集上清液，剩余殘?jiān)僖酝瑯拥姆绞教崛≈辽賰纱?，合并上清液為醇提取液；所述醇提取液?jīng)減壓蒸餾、冷凍干燥得到神秘果葉粗提物；將所述神秘果葉粗提物溶解于水中，并經(jīng)大孔樹脂處理，然后用第二醇溶液洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集醇洗脫液；所述醇洗脫液經(jīng)減壓蒸餾和冷凍干燥得到神秘果葉提取物干粉。

具體地，神秘果葉通過(guò)常規(guī)方法干燥和粉碎，例如自然晾干。粉碎后的神秘果葉優(yōu)選通過(guò)80目篩，以得到神秘果葉粉。

優(yōu)選地，所述第一醇溶液為50～90％(v/v)，優(yōu)選60～80％(v/v)的甲醇水溶液。

所述超聲提取頻率為40000赫茲，時(shí)間可為0.5～1h，超聲波水浴的溫度為40～60℃。

在超聲提取過(guò)程中，若提取溶液第一醇溶液濃度過(guò)高(即大于90％(v/v))，則無(wú)法提取到極性較大的活性物質(zhì)；若提取溶液第一醇溶液濃度過(guò)低(即小于50％(v/v))，則會(huì)有太多的糖類被提取到提取物中，影響下一步干燥效果。

根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，所述神秘果葉粉與所述第一醇溶液的比例為每克神秘果葉粉使用15～45ml，優(yōu)選30ml第一醇溶液。

根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式，用作洗脫劑的第二醇溶液為10～90％(v/v)，優(yōu)選30～70％(v/v)，更優(yōu)選60％(v/v)的乙醇水溶液。

根據(jù)又一個(gè)具體實(shí)施方式，上述大孔樹脂可為ab-8。優(yōu)選地，在大孔樹脂分離步驟中，神秘果葉粗提物溶液的流速為1～3ml/min，優(yōu)選1.5ml/min。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，在用第二醇溶液洗脫劑進(jìn)行洗脫之前先用水洗脫，丟棄洗脫液，用于除去提取物中的糖類物質(zhì)。

上述冷凍干燥步驟利用常規(guī)方法和條件進(jìn)行，例如冷凍干燥可在零下35±1℃的溫度下進(jìn)行。

在上述提取方法中，使用甲醇水溶液作為提取劑，因其極性大、分子量較低而更易進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)提取活性物質(zhì)。同時(shí)，采用超聲波輔助提取，使得提取時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，所獲得的產(chǎn)品中活性物質(zhì)含量高。

根據(jù)本發(fā)明的神秘果葉提取物具有抗氧化性，其中活性物質(zhì)主要為多酚和黃酮類化合物。具體地，根據(jù)上述方法得到的神秘果葉提取物對(duì)dpph自由基具有較強(qiáng)的清除能力，例如ic50為83～120μg/ml，優(yōu)選100～120μg/ml，清除能力是山奈酚的2倍以上；具有較高的鐵離子還原/抗氧化能力(frap)，例如frap值為6～8mm/gtrolox，優(yōu)選6.5mm/gtrolox，是山奈酚的2.5倍以上；由此能夠明顯抑制線蟲株系cl4176的癱瘓，可以用于抗氧化劑和抗ad的藥物或保健品的制備。

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1：神秘果葉提取物的制備

將神秘果葉自然晾干，粉碎，并過(guò)80目篩，得到神秘果葉粉；

向神秘果葉粉中以每克神秘果葉粉30ml的量加入50％(v/v)的甲醇水溶液，在40℃的水浴溫度下，超聲提取0.5h，離心收集上清液，剩余殘?jiān)韵嗤臈l件重復(fù)提取兩次，合并這些上清液得到醇提取液；

將上述醇提取液經(jīng)40℃減壓蒸餾，在零下35℃下冷凍干燥24h得到神秘果葉粗提物；

將上述神秘果葉粗提物溶解于水中至沒(méi)有顆粒，并經(jīng)大孔樹脂ab-8處理，先水洗脫除雜，再用60％(v/v)乙醇洗脫，收集洗脫液；

上述醇洗脫液經(jīng)40℃減壓蒸餾和零下35℃冷凍干燥得到神秘果葉提取物干粉。

實(shí)施例2至3

根據(jù)與實(shí)施例1相同的步驟制備神秘果葉提取物干粉，區(qū)別在于實(shí)施例2和3中分別采用70％(v/v)甲醇水溶液和90％(v/v)甲醇水溶液作為提取劑。

對(duì)比例1

根據(jù)與實(shí)施例1相同的步驟制備神秘果葉提取物干粉，區(qū)別在于對(duì)比例1中采用水作為提取劑。

神秘果葉提取物中總酚、總黃酮含量的測(cè)定

總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。用100mg/l的沒(méi)食子酸儲(chǔ)備液配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。準(zhǔn)確移取不同體積沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入1ml福林酚試劑(預(yù)先用水稀釋到原始濃度十分之一)，用水補(bǔ)足總體積為2ml。室溫靜止5分鐘后加入1.0ml碳酸鈉溶液(7.5％，w/v)，于黑暗中反應(yīng)30min后在765nm測(cè)定吸光度。其中標(biāo)準(zhǔn)樣品中沒(méi)食子酸的最終濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和4.0mg/l。樣品中的總酚含量用達(dá)到相同量的沒(méi)食子酸的百分比(％)來(lái)表示。

總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品0.0100g，用60％(v/v)乙醇溶液配制成0.2mg/ml的對(duì)照品溶液。分別準(zhǔn)確吸取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25ml容量瓶中，以60％(v/v)乙醇溶液稀釋至15ml，加入5％(w/v)亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，靜置5min。然后加入10％(w/v)硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，靜置5min。再加入1mol/l氫氧化鈉溶液2ml，混勻，用60％(v/v)乙醇溶液稀釋至刻度，室溫靜置15min。以第一管為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度值。樣品中的總黃酮含量用達(dá)到相同量的蘆丁的百分比(％)來(lái)表示。

不同濃度甲醇水溶液提取的神秘果葉提取物中總酚和總黃酮的含量及提取率見(jiàn)表1。

表1

^a：對(duì)醇提取液進(jìn)行的測(cè)定

^b：相對(duì)于原始神秘果葉質(zhì)量

^c：對(duì)神秘果葉提取物干粉進(jìn)行的測(cè)定

由以上結(jié)果可知，根據(jù)實(shí)施例1至3的醇提取液的提取率和總酚、總黃酮含量，顯著高于對(duì)比例1中用水提取的提取液的含量。當(dāng)甲醇水溶液濃度為70體積％時(shí)，醇提取液的提取率和總酚、總黃酮含量最高。

dpph自由基清除能力和鐵離子還原/抗氧化能力測(cè)定(frap)的測(cè)定

用甲醇將根據(jù)實(shí)施例1至3和對(duì)比例1的神秘果葉提取物干粉溶解成1mg/ml的樣品進(jìn)行各項(xiàng)抗氧化能力測(cè)定。

以1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(dpph，美國(guó)sigma公司)為標(biāo)準(zhǔn)物，用dpph自由基清除能力的方法來(lái)測(cè)定上述神秘果葉提取物的抗氧化能力。

取2ml的dpph溶液(濃度為0.5mm)，分別與0.5ml的各神秘果葉提取物甲醇溶液(濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/ml)混合，在37℃恒溫下避光反應(yīng)1h。在波長(zhǎng)525nm處測(cè)定吸光度值。由此計(jì)算神秘果葉提取物的ic50數(shù)值。

frap的測(cè)定。frap利用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。取稀釋10倍后的上述神秘果葉提取物甲醇溶液樣品10μl加入到96微孔板中，然后加入200μl新鮮配制的2,4,6-三吡啶基三嗪(tptz)工作液混勻，37℃水浴反應(yīng)30min后在595nm測(cè)定吸光度，以不同濃度trolox(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mm)為標(biāo)準(zhǔn)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線。神秘果葉提取物樣品的抗氧化活性(frap值)以每克干質(zhì)量達(dá)到同樣吸光度所需的trolox毫摩爾數(shù)(mmtrolox/g)表示。自由基清除能力和frap的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2

以上結(jié)果數(shù)據(jù)表明根據(jù)實(shí)施例1至3的神秘果葉提取物具有很強(qiáng)的抗氧化能力。

神秘果葉提取物的成分分析

采用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(uplc-ms)測(cè)定了上述神秘果葉提取物中的成分組成。其中，超高效液相色譜(uplc)條件為：

watersacquitybehc18色譜柱(50×2.1mm，1.7μm)，柱溫35℃；

watersh-class分離器單元；

watersacquity二極管陣列檢測(cè)器；

watersmasslynx4.1質(zhì)譜管理軟件

流動(dòng)相為乙腈(a)和0.1％甲酸水溶液(b)，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋洪_始濃度為8％a；0-8min升至20％；8-13min升至30％a；13-15min升至30％a；15-18升至50％a；18-20升至90％a；20-21降至8％a；21-25min為8％a。流速為0.4ml/min。

全波長(zhǎng)掃描，掃描范圍為200～600nm。

質(zhì)譜(ms-ms)條件為：

質(zhì)譜采用電噴霧電離源[esi(-)]，全掃描范圍為100～1200da，毛細(xì)管電壓為2.5kv，錐孔電壓為50v。離子源溫度為150℃；脫溶劑氣體(氮?dú)?溫度為500℃，流量為1000l/h；錐孔氣體(氮?dú)?流量為50l/h，碰撞氣為高純氬氣。

根據(jù)標(biāo)樣和質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定目標(biāo)產(chǎn)物中的組成。

以70體積％甲醇提取的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)乙腈和甲酸梯度分離后的uplc見(jiàn)圖1，波長(zhǎng)為325nm，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析神秘果葉提取物中的主要抗氧化物質(zhì)為：

1、沒(méi)食子酸2、綠原酸3、5-o-肉桂?？崴?、4-o-肉桂?？崴?、沒(méi)食子酸甲酯6、苯甲酸甲酯7、楊梅素-3-半乳糖苷8、蘆丁9、楊梅酮10、金絲桃苷11、異槲皮素12、山奈酚3-o-葡萄糖苷13、槲皮素-3-鼠李糖苷14、根皮苷15、槲皮素糖苷

由以上結(jié)果可知神秘果葉中的主要抗氧化物質(zhì)為多酚和黃酮類物質(zhì)。

提取物對(duì)線蟲cl4176株系的癱瘓抑制實(shí)驗(yàn)

平板制備：用雙蒸水將70％甲醇提取物配制成0.0002mg/ml、0.002mg/ml、0.02mg/ml，將咖啡因(caffeine)用水配成濃度為6.27mm(陽(yáng)性對(duì)照)，分別吸取540ul涂布在線蟲生長(zhǎng)體培養(yǎng)基(ngm)的表面(6cm培養(yǎng)皿)。室溫避光放置半小時(shí)后，收入16℃放置過(guò)夜后，涂布50ul(1mg/m)大腸桿菌op50(65℃水浴處理0.5h)。制備好的平板在16℃放置24h用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)程：將cl4176株系在對(duì)照平板及藥物平板上同步化后，15～16℃培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)入25℃誘導(dǎo)，23h開始統(tǒng)計(jì)。

使用log-rank(mantel-cox)test進(jìn)行癱瘓程度差異比較。*代表<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

不同濃度的提取物對(duì)線蟲cl4176株系癱瘓的抑制作用見(jiàn)圖2。

由圖可知，濃度為0.02mg/ml神秘果葉子提取物能夠抑制線蟲株系cl4176的癱瘓，但濃度降低到0.002mg/ml和0.0002mg/ml時(shí)并沒(méi)有抑制癱瘓表型的效果。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，上述神秘果葉提取物在0.02～0.05mg/ml的范圍內(nèi)都能夠抑制線蟲株系cl4176的癱瘓。

多酚類物質(zhì)能夠抑制淀粉蛋白的有毒聚合體，從而可以有效的緩解ad的發(fā)生，這些功效都與多酚類物質(zhì)的抗氧化性能相關(guān)。另外，黃酮類物質(zhì)減緩了人類成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中淀粉樣前蛋白的成熟，進(jìn)一步能夠顯著地降低ad鼠模型中不溶aβ的比例，從而也有助于減少ad的發(fā)生。本發(fā)明提供的神秘果葉提取物中酚類和黃酮類物質(zhì)含量很高，并且具有良好的抗氧化活性。該提取物對(duì)于線蟲株系cl4176癱瘓的抑制表明神秘果葉提取物可用于制備有效治療ad的藥物。