本發(fā)明涉及麥冬寡糖的新用途。
背景技術(shù)：
麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicas(L.f)Ker-Gawl.的干燥塊根，味甘、微苦，性微寒，有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心之功，主要用于肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心煩失眠和腸燥便秘等。麥冬中含有的化學(xué)成分類型主要有皂苷、黃酮、氨基酸和糖類。有研究表明麥冬對(duì)四氧嘧啶、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的高血糖動(dòng)物和自發(fā)性糖尿病小鼠具有顯著的降血糖作用。
肥胖是指人體脂肪組織過(guò)度蓄積導(dǎo)致機(jī)體正常生理功能不同程度損害的一種病理狀態(tài)。肥胖嚴(yán)重影響人類的身心健康，是許多2型糖尿病等代謝性疾病、心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病以及惡性腫瘤等慢性非傳染性疾病的危險(xiǎn)因素，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為影響健康的主要危險(xiǎn)因素之一。隨著全球經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展以及生活方式的變化，世界肥胖問(wèn)題日益嚴(yán)重。全球目前有超過(guò)15億的超重和肥胖人口，預(yù)計(jì)到2030年超重人群將增加到21.6億，肥胖人群將增加到11.2億。因此，肥胖相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率及病死率將不斷增加，肥胖的防治日趨嚴(yán)峻，如何安全有效地治療肥胖成為迫切需要解決的問(wèn)題。
目前，肥胖的治療主要包括改變生活方式、手術(shù)治療和藥物治療3種方法:(1)改變生活方式，包括飲食療法和參加有氧運(yùn)動(dòng)，但生活方式的干預(yù)往往讓人難以堅(jiān)持，大多只能取得短暫的成功；(2)手術(shù)治療，主要包括Bariatric手術(shù)、去脂整形術(shù)和胃內(nèi)水球療法，雖然手術(shù)是目前最有效的治療方法，但其存在很大的風(fēng)險(xiǎn)；(3)目前可選的減肥藥物非常有限，如化學(xué)藥物利莫那班(rimonabant)和西布曲明(sibutramine)已退出歐洲聯(lián)盟的市場(chǎng)。因此，目前可用于減肥的有效措施非常少，迫切需要有新的減肥方法出現(xiàn)。
哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要存在2種類型的脂肪組織，即白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)。其中，白色脂肪組織占正常健康成人體質(zhì)量的10％，主要功能是儲(chǔ)存脂肪以作為人體能源庫(kù)和皮下隔熱墊；棕色脂肪負(fù)責(zé)分解引發(fā)肥胖的白色脂肪，將白色脂肪轉(zhuǎn)化成二氧化碳、水和熱量,它可以加快人體新陳代謝，促進(jìn)白色脂肪消耗，防止肥胖的發(fā)生。棕色脂肪組織產(chǎn)生熱量主要依賴于解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)的活化，UCP1是特異性存在于棕色脂肪細(xì)胞中的一種線粒體蛋白，能將線粒體氧化磷酸化脫偶聯(lián)后，代謝脂肪酸，產(chǎn)生能量，這對(duì)機(jī)體維持體溫非常重要。有關(guān)嚙齒類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉(zhuǎn)化可以減輕該動(dòng)物體質(zhì)量、提高該動(dòng)物機(jī)體的血糖穩(wěn)態(tài)。另有研究表明，在超重和肥胖人群中棕色脂肪組織的數(shù)量明顯減少，棕色脂肪組織的數(shù)量與BMI、脂肪含量呈反比，棕色脂肪組織確實(shí)存在于成人體內(nèi)并發(fā)揮作用，并且肥胖的發(fā)生也與棕色脂肪組織數(shù)量的減少有著密切聯(lián)系。棕色脂肪組織的存在及生理功能提示了一種控制肥胖癥的新策略。通過(guò)調(diào)控棕色脂肪的分化通路，使棕色脂肪增加或促使白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)化可能成為治療肥胖的有效方法，已成為肥胖研究的熱點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明首次公開(kāi)了麥冬寡糖在促進(jìn)棕色脂肪生成，提高棕色脂肪組織UCP1蛋白表達(dá)，以增強(qiáng)棕色脂肪組織分解白色脂肪組織和產(chǎn)熱功能方面的作用。并進(jìn)一步公開(kāi)麥冬寡糖在抑制體重異常增長(zhǎng)、防治肥胖、增強(qiáng)機(jī)體抗寒能力方面的作用。在小鼠急性毒性試驗(yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)出毒性反應(yīng)，療效確切安全。為制備安全減肥、抗寒藥物或保健食品提供了新的原料途徑。
具體為：
1、麥冬寡糖在制備促進(jìn)棕色脂肪生成藥物中的應(yīng)用。
2、麥冬寡糖在制備促進(jìn)白色脂肪組織分解及產(chǎn)熱功能藥物中的應(yīng)用。
3、麥冬寡糖在制備防治肥胖藥物、保健品或食品中的應(yīng)用。
4、麥冬寡糖在制備增強(qiáng)機(jī)體抗寒能力藥物、保健品或食品中的應(yīng)用。
麥冬寡糖來(lái)源優(yōu)選中藥材麥冬的寡糖提取物，優(yōu)選分子量范圍為500～2500之間。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
各實(shí)施例中所涉及的固體混合物中之固體，液體中之液體，以及液體中之固體的百分比分別是以wt/wt、vol/vol、wt/vol計(jì)算，除非另有說(shuō)明。
實(shí)施例1：麥冬寡糖的制備
取麥冬藥材適量，剪碎，加10倍量95％乙醇，回流2小時(shí)，過(guò)濾，棄濾液，揮干乙醇，加10倍量蒸餾水，水浴提取2次，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至密度為1.2g/ml，加乙醇至醇濃度為80％，靜置12小時(shí)，沉淀，分別以無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、丙酮洗滌，55℃烘干，即得麥冬粗提取物。取麥冬粗提取物，溶于適量蒸餾水中，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心，除去沉淀，用Sephadex G-75層析柱上樣，以蒸餾水洗脫，流速為0.5ml/min，以自動(dòng)部分收集器收集，合并洗脫峰，冷凍干燥，得到純化后的麥冬寡糖。采用硫酸-蒽酮法測(cè)定總寡糖含量，得到寡糖含量為97.64％的麥冬寡糖樣品。將Sephadex G-75柱層析所得麥冬寡糖樣品溶于去超純水，配成2μg/ml溶液，分別取0.5μl樣品溶液與5mg/ml的基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸(DHB)互溶揮干溶液，采用MALDI-TOF-MASS進(jìn)樣檢測(cè)麥冬寡糖的分子量范圍。經(jīng)MALDI-TOF-MASS進(jìn)樣檢測(cè)，該麥冬寡糖樣品的分子量范圍在500～2500之間。
實(shí)施例2：麥冬寡糖對(duì)肥胖模型小鼠的體重、棕色脂肪生成及其UCP1蛋白表達(dá)的影響
1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
4-5周齡C57BL/6J雄性小鼠，SPF級(jí)，平均體質(zhì)量(15.5±0.7)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。
2、實(shí)驗(yàn)方法：
2.1動(dòng)物模型建立及分組
將60只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n＝10)和肥胖造模組(n＝50)，正常對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)，肥胖造模組喂飼高脂飼料(含基礎(chǔ)飼料79％、豬油10％、蛋黃粉10％、膽固醇1％)。喂飼10周后，選擇體質(zhì)量高于正常對(duì)照組小鼠平均體質(zhì)量20％的個(gè)體為肥胖模型動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)肥胖模型小鼠38只(成功率為76％)，將肥胖模型小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為肥胖模型對(duì)照組(10只)、麥冬寡糖低劑量組(9只)、麥冬寡糖中劑量組(10只)、麥冬寡糖高劑量組(9只)。除正常對(duì)照組喂飼普通飼料外，其他各組繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，同時(shí)，麥冬寡糖低劑量組、麥冬寡糖中劑量組、麥冬寡糖高劑量組分別按0.1ml/10g灌胃給予濃度為1.5mg/ml、3.0mg/ml、6.0mg/ml的麥冬寡糖混懸液，正常對(duì)照組和肥胖模型對(duì)照組灌胃給予等體積蒸餾水，1次/天，連續(xù)6周。
2.2指標(biāo)監(jiān)測(cè)
最后一次給藥后，動(dòng)物禁食不禁水過(guò)夜，于第2天清晨進(jìn)行空腹體質(zhì)量稱量并記錄，隨后將動(dòng)物麻醉，斷頭處死，迅速取肩胛間區(qū)棕色脂肪組織，除去附著的肌肉及白色脂肪組織，稱重并記錄。隨后，將取出的棕色脂肪組織于10％福爾馬林溶液中固定，按免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)采用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將染色的切片于200倍顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)攝取10個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析UCP1陽(yáng)性表達(dá)的光密度值(IOD)。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，肥胖模型對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量顯著增加(P<0.01)，棕色脂肪重量/體重顯著降低(P<0.01)，UCP1蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。提示該高脂飼料喂養(yǎng)所致的肥胖模型小鼠的體質(zhì)量異常增長(zhǎng)、棕色脂肪組織生成減少、棕色脂肪組織的分解和產(chǎn)熱功能減弱。與肥胖模型組比較，麥冬寡糖中、高劑量組小鼠的體質(zhì)量顯著降低(P<0.05或0.01)，棕色脂肪重量顯著增加(P<0.01)，棕色脂肪重量/體重顯著提高(P<0.01)，UCP1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。提示麥冬寡糖可以促進(jìn)肥胖模型小鼠棕色脂肪的生成，提高棕色脂肪組織UCP1蛋白的表達(dá)以增強(qiáng)肥胖模型小鼠棕色脂肪組織分解白色脂肪組織和產(chǎn)熱功能，明顯抑制肥胖模型小鼠的體重異常增長(zhǎng)。
表1麥冬寡糖對(duì)小鼠體質(zhì)量、棕色脂肪組織重量及UCP1蛋白表達(dá)的影響
注：與正常對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型對(duì)照組比較：*P＜0.05**P＜0.01
實(shí)施例3:SD大鼠經(jīng)口給予麥冬寡糖急性毒性試驗(yàn)
1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
SPF級(jí)SD大鼠24只，雌雄各半，體重130～150g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。
2、實(shí)驗(yàn)方法：
試驗(yàn)設(shè)給藥組及空白對(duì)照組，每組12只動(dòng)物，雌雄各半。麥冬寡糖給藥組給藥劑量為36g/kg，按可通過(guò)灌胃針的最大濃度1.8g/ml、給藥容積20ml/kg灌胃給藥。對(duì)照組灌胃給予等體積滅菌注射用水。
每日觀察并記錄大鼠的外觀、精神狀態(tài)、呼吸、皮膚被毛、糞尿、眼、耳、鼻、口腔、生殖器等一般情況及其它中毒表現(xiàn)和死亡情況。每?jī)商鞙y(cè)定大鼠體重一次，每周測(cè)定大鼠攝食量一次，連續(xù)觀察14天。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
(1)一般狀況及死亡情況觀察
給藥后直至第14天，各動(dòng)物精神及行為活動(dòng)狀況良好、皮膚被毛清潔、大小便正常，亦未見(jiàn)其他毒性反應(yīng)癥狀。觀察結(jié)束后大體解剖未見(jiàn)臟器明顯異常。
(2)體重
雌、雄大鼠在各時(shí)間點(diǎn)體重與滅菌注射用水對(duì)照組雌、雄大鼠體重相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示麥冬寡糖經(jīng)口灌胃給藥對(duì)大鼠體重?zé)o明顯影響。詳見(jiàn)表2。
表2麥冬寡糖單次經(jīng)口灌胃給藥對(duì)SD大鼠體重的影響
上表中，“對(duì)照組”是指“空白對(duì)照組”，“給藥組”是指“麥冬寡糖給藥組”。
(3)攝食量
麥冬寡糖經(jīng)口灌胃給藥對(duì)雌、雄鼠平均攝食量無(wú)明顯影響。詳見(jiàn)表3。
表3麥冬寡糖單次經(jīng)口灌胃給藥對(duì)SD大鼠平均攝食量的影響
4、結(jié)論：
綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)室條件下，SD大鼠按36g/kg的劑量以最大濃度1.8g/ml、最大體積20ml/kg單次經(jīng)口灌胃給予麥冬寡糖，14天觀察期內(nèi)，大鼠未出現(xiàn)死亡，精神及行為活動(dòng)狀況良好、皮膚被毛清潔、大小便正常，體重增長(zhǎng)正常，攝食量未見(jiàn)異常。觀察結(jié)束后大體解剖未見(jiàn)臟器異常。表明麥冬寡糖對(duì)雌雄大鼠經(jīng)口LD50均>36g·kg-1，按急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)物質(zhì)。