本發(fā)明屬于蜂產品制備方法領域，涉及一種水溶性蜂膠及其制備方法。
背景技術：
：蜂膠是蜜蜂采集植物樹脂，并混入蜂蠟和其它分泌物加工而成的一種芳香物質。蜂膠具有廣泛的藥理活性，如抑菌、抗氧化、抗病毒、消炎、保肝和抗癌等。蜂膠作為功能性成分已廣泛應用于食品、藥品及保健品行業(yè)。目前，由于蜂膠是醇溶性的，限制了蜂膠在食品及醫(yī)藥領域的應用。蜂膠的水溶性很差，應用蜂膠時主要采用有機溶劑和乳化劑來制備蜂膠溶液，如乙醇、聚乙二醇等溶解或通過吐溫、大豆磷脂、卵磷酯等乳化。以乙醇作為溶劑制備的蜂膠乙醇水溶液有很強的刺激味道，粘度大，從而限制其應用。采用乳化劑乳化后的蜂膠與水混合時形成乳濁液，難以在水為介質的產品中應用。而蜂膠水提取物大多提取蜂膠中水溶性物質，而主要活性成分黃酮類物質難以提取。因此，如果增加蜂膠的水溶性是當前迫切需要解決的問題。公開號cn200510049326.4的發(fā)明專利申請公開了蜂膠水溶液的制備工藝及應用，該專利是采用95％乙醇提取后加入50-100度熱水中得到混合液，然后蒸發(fā)除去乙醇得到的，所提物質大多是蜂膠中的水溶性物質，黃酮含量低。公開號cn03150648.8的發(fā)明專利申請公開了一種水溶性蜂膠及提取方法，該專利是采用卵磷脂、大豆磷脂、聚乙二醇6000、吐溫80、甘油酯等表面活性劑增加蜂膠水溶性。但在水比例加大時易沉淀。公開號cn1460512a的發(fā)明專利申請公開了一種水溶性蜂膠液及其制備方法，該專利是采用聚乙二醇增加蜂膠溶解性，但隨水比例加大，蜂膠易析出。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種水溶性蜂膠的制備方法。本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)：(1)在蜂膠原料中加入60％～95％的乙醇水溶液(g/ml)，超聲波提取，過濾，除去不溶物，殘渣反復提取三次，合并濾液得蜂膠提取液r1。蜂膠與乙醇比例限定在1：2～8(g：ml)。(2)在r1中按與蜂膠質量比1：0.5～3加入增溶劑聚氧乙烯醚氫化蓖麻油，攪拌使其完全溶解，然后旋轉蒸發(fā)回收乙醇至液體無醇味得r2。(3)將r2置于熱水中溫浴，按與蜂膠質量比1：1～5加入助溶劑丙二醇，充分攪拌使蜂膠完全溶解。濾液冷卻至室溫、靜置，過濾，即得蜂膠水溶液m。(4)將m干燥蒸出水份即得水溶性蜂膠流浸膏。其中：步驟(1)中超聲波處理時間為15～45分鐘。步驟(2)中的旋轉蒸發(fā)濃縮是在溫度45～70℃條件下進行。步驟(3)溫浴溫度為65～85℃。本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法制備獲得的水溶性蜂膠在化妝品、醫(yī)藥、保健食品領域中的應用。本發(fā)明制備的水溶性蜂膠的性能進行了如下項目測試：1、總黃酮含量(1)蘆丁標準曲線的繪制精密吸取蘆丁對照品使用溶液(0.2g/l)1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分別置于50ml容量瓶中。加無水乙醇至總體積為15ml，依次加人硝酸鋁溶液(100g/l)1ml，醋酸鉀溶液(9.8g/l)1ml，搖勻，加水至刻度，搖勻。靜置1h。用1cm比色杯于415nm處，以30％乙醇溶液為空白，測定吸光度。以50ml中蘆丁質量(mg)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線或按直線回歸方程計算。線性工作范圍0mg-1.2mg(50ml)。(2)空白試驗精密稱待測水溶性蜂膠樣品1.0g，置于50ml容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15ml，加水稀釋至刻度，搖勻。(3)測定總黃酮含量精密稱待測水溶性蜂膠樣品1.0g，置于50ml容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15ml，依次加人硝酸鋁溶液(100g/l)1ml，醋酸鉀溶液(9.8g/l)1ml，搖勻，加水至刻度，搖勻。靜置1h。以空白試液(2.2.2.3.3.2)作參比，用1cm比色杯，在波長415nm處測定試料溶液的吸光度。查標準曲線或通過回歸方程計算，求出水溶性蜂膠中的黃酮類化合物含量(mg)。2、抗氧化能力dpph自由基清除活性測定將本發(fā)明水溶性蜂膠樣品用無水乙醇稀釋一系列的濃度梯度，蜂膠樣品：20～200μg/ml。取上述稀釋液100μl加入100μl新配置的0.1mg/mldpph工作液，同時以不加dpph(以100μl無水乙醇代替dpph)的供試品溶液各濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結果的干擾，并設dpph陰性對照(以100μl無水乙醇代替供試品)，每組設2個平行復孔。室溫避光反應30min后，在517nm處測定吸光度，使其讀數(shù)在0.2～0.8之間。dpph清除率(％)＝(a0-as)/a0*100％as：加入樣品提取液的dpph溶液的吸光度；a0：加入無水乙醇的dpph溶液的吸光度。3、抑菌能力配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基，進行金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、白色念珠菌的活化及純化，制備菌懸液和濾紙片。采用抑菌圈法測定本發(fā)明水溶性蜂膠對金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、白色念珠菌的抑菌圈大小，重復3次實驗，進行顯著性分析。本發(fā)明克服蜂膠水溶性難的缺點，提供一種水溶性蜂膠的制備方法。所獲得的水溶性蜂膠提取物無醇味，無異味，蜂膠原有活性成分不會損失，與水以任意比例混溶。與現(xiàn)有的水溶性蜂膠相比，本發(fā)明的水溶性蜂膠具有下述特點：(1)制得的水溶性蜂膠加入任意量的水均可完全溶解。(2)總黃酮含量可高達18％，而現(xiàn)有水溶性蜂膠總黃酮含量低于5％。(3)不含乙醇，無刺激作用。(4)無刺激性氣味，口感佳，受眾廣。具體實施方式本發(fā)明結合實施例作進一步的說明。通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。實施例1：本發(fā)明水溶性蜂膠的制備該實施例的實施步驟如下：(1)在蜂膠原料中按重量體積比1:3加入體積比95％的乙醇水溶液(g/ml)，超聲波提取，過濾，除去不溶物，殘渣反復提取三次，合并濾液得蜂膠提取液r1。(2)在r1中按與蜂膠質量比1：3加入聚氧乙烯醚氫化蓖麻油，攪拌使其完全溶解，然后旋轉蒸發(fā)回收乙醇至液體無醇味得r2。(3)將r2置于熱水中溫浴，按與蜂膠質量比1：1加入丙二醇，充分攪拌使蜂膠完全溶解。濾液冷卻至室溫、靜置，過濾，即得蜂膠水溶液m。(4)將m干燥蒸出水份即得水溶性蜂膠流浸膏。采用本申請說明書描述的方法對本實施例制備的水溶性蜂膠進行了下述性能測試：1、總黃酮含量(1)蘆丁標準曲線的繪制精密吸取蘆丁對照品使用溶液(0.2g/l)1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分別置于50ml容量瓶中。加無水乙醇至總體積為15ml，依次加人硝酸鋁溶液(100g/l)1ml，醋酸鉀溶液(9.8g/l)1ml，搖勻，加水至刻度，搖勻，靜置1h。用1cm比色杯于415nm處，以30％乙醇溶液為空白，測定吸光度。以50ml中蘆丁質量(mg)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線或按直線回歸方程計算。線性工作范圍0mg-1.2mg(50ml)。(2)空白試驗精密稱待測水溶性蜂膠樣品1.0g，置于50ml容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15ml，加水稀釋至刻度，搖勻。(3)測定總黃酮含量精密稱待測水溶性蜂膠樣品1.0g，置于50ml容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15ml，依次加人硝酸鋁溶液(100g/l)1ml，醋酸鉀溶液(9.8g/l)1ml，搖勻，加水至刻度，搖勻。靜置1h。以空白試液(2.2.2.3.3.2)作參比，用1cm比色杯，在波長415nm處測定試料溶液的吸光度。查標準曲線或通過回歸方程計算，求出水溶性蜂膠中的黃酮類化合物含量。2、抗氧化能力dpph自由基清除活性測定將本發(fā)明水溶性蜂膠樣品用無水乙醇稀釋一系列的濃度梯度，蜂膠樣品：20～200μg/ml。取上述稀釋液100μl加入100μl新配置的0.1mg/mldpph工作液，同時以不加dpph(以100μl無水乙醇代替dpph)的供試品溶液各濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結果的干擾，并設dpph陰性對照(以100μl無水乙醇代替供試品)，每組設2個平行復孔。室溫避光反應30min后，在517nm處測定吸光度，使其讀數(shù)在0.2～0.8之間。dpph清除率(％)＝(a0-as)/a0*100％as：加入樣品提取液的dpph溶液的吸光度；a0：加入無水乙醇的dpph溶液的吸光度。表1總黃酮含量、抑菌能力及dpph自由基清除活性3、抑菌能力配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基，進行金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、白色念珠菌的活化及純化，制備菌懸液和濾紙片。采用抑菌圈法測定本發(fā)明水溶性蜂膠對金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、白色念珠菌的抑菌圈大小，重復3次實驗，進行顯著性分析。表2蜂膠乙醇提取物對不同供試菌的抑菌圈直徑實施例2：本發(fā)明水溶性蜂膠的制備該實施例的實施步驟如下：(1)在蜂膠原料中按重量體積比1:8加入體積比60％的乙醇水溶液(g/ml)，超聲波提取，過濾，除去不溶物，殘渣反復提取三次，合并濾液得蜂膠提取液r1。(2)在r1中按與蜂膠質量比1：0.5加入聚氧乙烯醚氫化蓖麻油，攪拌使其完全溶解，然后旋轉蒸發(fā)回收乙醇至液體無醇味得r2。(3)將r2置于熱水中溫浴，按與蜂膠質量比1：2加入丙二醇，充分攪拌使蜂膠完全溶解。濾液冷卻至室溫、靜置，過濾，即得蜂膠水溶液m。(4)將m干燥蒸出水份即得水溶性蜂膠流浸膏。采用本申請說明書描述的方法對本實施例制備的水溶性蜂膠進行了下述性能測試：1、總黃酮含量(1)蘆丁標準曲線的繪制精密吸取蘆丁對照品使用溶液(0.2g/l)1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分別置于50ml容量瓶中。加無水乙醇至總體積為15ml，依次加人硝酸鋁溶液(100g/l)1ml，醋酸鉀溶液(9.8g/l)1ml，搖勻，加水至刻度，搖勻。靜置1h。用1cm比色杯于415nm處，以30％乙醇溶液為空白，測定吸光度。以50ml中蘆丁質量(mg)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線或按直線回歸方程計算。線性工作范圍0mg-1.2mg(50ml)。(2)空白試驗精密稱待測水溶性蜂膠樣品1.0g，置于50ml容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15ml，加水稀釋至刻度，搖勻。(3)測定總黃酮含量精密稱待測水溶性蜂膠樣品1.0g，置于50ml容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15ml，依次加人硝酸鋁溶液(100g/l)1ml，醋酸鉀溶液(9.8g/l)1ml，搖勻，加水至刻度，搖勻。靜置1h。以空白試液(2.2.2.3.3.2)作參比，用1cm比色杯，在波長415nm處測定試料溶液的吸光度。查標準曲線或通過回歸方程計算，求出水溶性蜂膠中的黃酮類化合物含量。表3總黃酮含量、抑菌能力及dpph自由基清除活性2、抗氧化能力dpph自由基清除活性測定將本發(fā)明水溶性蜂膠樣品用無水乙醇稀釋一系列的濃度梯度，蜂膠樣品：20～200μg/ml。取上述稀釋液100μl加入100μl新配置的0.1mg/mldpph工作液，同時以不加dpph(以100μl無水乙醇代替dpph)的供試品溶液各濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結果的干擾，并設dpph陰性對照(以100μl無水乙醇代替供試品)，每組設2個平行復孔。室溫避光反應30min后，在517nm處測定吸光度，使其讀數(shù)在0.2～0.8之間。dpph清除率(％)＝(a0-as)/a0*100％as：加入樣品提取液的dpph溶液的吸光度；a0：加入無水乙醇的dpph溶液的吸光度。3、抑菌能力配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基，進行金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、白色念珠菌的活化及純化，制備菌懸液和濾紙片。采用抑菌圈法測定本發(fā)明水溶性蜂膠對金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、白色念珠菌的抑菌圈大小，重復3次實驗，進行顯著性分析。表4蜂膠乙醇提取物對不同供試菌的抑菌圈直徑mm實施例3：本發(fā)明水溶性蜂膠的制備該實施例的實施步驟如下：(1)在蜂膠原料中按重量體積比1:5加入體積比75％的乙醇水溶液(g/ml)，超聲波提取，過濾，除去不溶物，殘渣反復提取三次，合并濾液得蜂膠提取液r1。(2)在r1中按與蜂膠質量比1：1.5加入聚氧乙烯醚氫化蓖麻油，攪拌使其完全溶解，然后旋轉蒸發(fā)回收乙醇至液體無醇味得r2。(3)將r2置于熱水中溫浴，按與蜂膠質量比1：5加入丙二醇，充分攪拌使蜂膠完全溶解。濾液冷卻至室溫、靜置，過濾，即得蜂膠水溶液m。(4)將m干燥蒸出水份即得水溶性蜂膠流浸膏。采用本申請說明書描述的方法對本實施例制備的水溶性蜂膠進行了下述性能測試：1、總黃酮含量(1)蘆丁標準曲線的繪制精密吸取蘆丁對照品使用溶液(0.2g/l)1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分別置于50ml容量瓶中。加無水乙醇至總體積為15ml，依次加人硝酸鋁溶液(100g/l)1ml，醋酸鉀溶液(9.8g/l)1ml，搖勻，加水至刻度，搖勻。靜置1h。用1cm比色杯于415nm處，以30％乙醇溶液為空白，測定吸光度。以50ml中蘆丁質量(mg)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線或按直線回歸方程計算。線性工作范圍0mg-1.2mg(50ml)。(2)空白試驗精密稱待測水溶性蜂膠樣品1.0g，置于50ml容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15ml，加水稀釋至刻度，搖勻。(3)測定總黃酮含量精密稱待測水溶性蜂膠樣品1.0g，置于50ml容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15ml，依次加人硝酸鋁溶液(100g/l)1ml，醋酸鉀溶液(9.8g/l)1ml，搖勻，加水至刻度，搖勻。靜置1h。以空白試液(2.2.2.3.3.2)作參比，用1cm比色杯，在波長415nm處測定試料溶液的吸光度。查標準曲線或通過回歸方程計算，求出水溶性蜂膠中的黃酮類化合物含量。2、抗氧化能力dpph自由基清除活性測定將本發(fā)明水溶性蜂膠樣品用無水乙醇稀釋一系列的濃度梯度，蜂膠樣品：20～200μg/ml。取上述稀釋液100μl加入100μl新配置的0.1mg/mldpph工作液，同時以不加dpph(以100μl無水乙醇代替dpph)的供試品溶液各濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結果的干擾，并設dpph陰性對照(以100μl無水乙醇代替供試品)，每組設2個平行復孔。室溫避光反應30min后，在517nm處測定吸光度，使其讀數(shù)在0.2～0.8之間。dpph清除率(％)＝(a0-as)/a0*100％as：加入樣品提取液的dpph溶液的吸光度；a0：加入無水乙醇的dpph溶液的吸光度。表5總黃酮含量、抑菌能力及dpph自由基清除活性3、抑菌能力配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基，進行金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、白色念珠菌的活化及純化，制備菌懸液和濾紙片。采用抑菌圈法測定本發(fā)明水溶性蜂膠對金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、白色念珠菌的抑菌圈大小，重復3次實驗，進行顯著性分析。表6蜂膠乙醇提取物對不同供試菌的抑菌圈直徑實施例4：本發(fā)明水溶性蜂膠在皮膚清潔劑中的應用所述的皮膚清潔劑含有1.0重量份蜂膠提取物、2.0重量份膠原蛋白、1.0重量份果膠、0.1重量份透明質酸、3重量份吡咯烷酮羧酸鈉、0.3重量份月桂酰胺丙基甜菜堿與0.5重量份椰子油起泡劑以及補充至總量為100重量份的蒸餾水。采用本申請說明書描述的方法對本實施例制備的皮膚清潔劑進行了下述性能測試：a、貯存穩(wěn)定性：采用如下方法進行高低溫穩(wěn)定性實驗：(1)在溫度40℃-50℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中放置30-50天，恢復室溫后觀察；(2)24小時之內，在溫度0℃-50℃之間反復頻繁變化，如此反復處理15-30天，恢復室溫后觀察；(3)在溫度-5℃及40℃下循環(huán)存放3次，分別每次存放24h，即在-5℃存放24h后，在室溫下存放24h，再放入40℃恒溫箱中存放24h，依次循環(huán)3次，觀察其穩(wěn)定性；(4)在-5℃下存放1周，觀察其穩(wěn)定性。這些實驗結果表明，所得產品在各實驗條件下均未出現(xiàn)沉淀、斷層、析水、粗粒、褪色等現(xiàn)象，產品穩(wěn)定性好。b、衛(wèi)生性能：微生物學指標包括菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、糞大腸菌群、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，其測定結果列于表7中。表7微生物檢測結果檢驗項目檢驗結果限值菌落總數(shù)(cfu/g)＜10≤500霉菌和酵母菌總數(shù)(cfu/g)＜10≤100糞大腸菌群/g未檢出不得檢出金黃色葡萄球菌/g未檢出不得檢出銅綠假單胞菌/g未檢出不得檢出c、衛(wèi)生化學指標采用常規(guī)分析方法對所得產品的汞、砷、鉛含量進行了測定，其測定結果列于表8中。表8衛(wèi)生化學檢驗結果檢驗項目單位檢驗結果方法檢出濃度限值汞mg/kg未檢出0.3≤1砷mg/kg未檢出1≤10鉛mg/kg未檢出2≤10d、毒理學試驗根據(jù)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)標準進行多次皮膚刺激性試驗，其試驗結果列于表9中。表9受試物對家兔多次皮膚刺激性試驗結果檢測結論：受試物對家兔多次皮膚刺激檢驗結果為無刺激性，未見其他毒性。實施例5：本發(fā)明水溶性蜂膠在創(chuàng)傷修復中的應用所述的創(chuàng)傷修復材料含有5.0重量份蜂膠提取物、4.0重量份明膠、6.0重量份殼聚糖、3.0重量份羧甲基纖維素鈉與余量為至100重量份的蒸餾水。該實施例制備得到的創(chuàng)傷修復材料性能評價如下：a按照本說明書描述的方法測試了體外凝血指數(shù)，其結果列于表10中。表10凝血指數(shù)測試結果敷料種類bci紗布90.42明膠海綿50.62實驗組41.30從表10可以看出，本發(fā)明蜂膠敷料的凝血效果明顯優(yōu)于明膠海綿組。b按照本說明書描述的方法測試了抑菌作用，其結果列于表11中。表11抑菌活性測試結果表11結果表明，本發(fā)明敷料對兩種菌均有抑菌作用,且隨著與細菌作用時間的延長，抑菌率呈增長趨勢。處理20min時對金黃色葡萄球菌的抑菌率已達到52.4％,而對銅綠假單胞菌的抑菌率為37.3％，至80min時抑菌率分別達到89.3％和79.6％。當前第1頁12