本發(fā)明涉及重樓總皂苷技術(shù)，具體為一種重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的制備方法。

背景技術(shù)：

重樓(pariispolyphylla)屬百合科(jiliaceae)，又名蚤體，近年來藥理學(xué)研究表明重樓具有廣泛的抑制腫瘤效果，而甾體皂苷是重樓抗腫瘤的主要有效成分，現(xiàn)階段分離得到的皂苷中，許多都具有很強(qiáng)的藥理活性，以重樓皂苷i和重樓皂苷ii的細(xì)胞毒活性最高。目前，臨床應(yīng)用的重樓制劑有散劑、配劑、洗劑、氣霧劑、膏劑等多種劑型，但多為藥材粉末或提取物直接入藥，劑型落后，制劑中有效成分含量低，生物利用度差。由于重樓總皂苷為脂溶性成分，其普通的溶液制劑存在吸收差，生物利用度低等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了藥物的臨床療效。因此本研究考慮采用質(zhì)量源于設(shè)計(qualitybydesign，qbd)理念設(shè)計和開發(fā)重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒，希望能夠設(shè)計出理想的重樓總皂苷載藥系統(tǒng)，以改善生物相容性和提高生物利用度，從而為能夠更加合理地利用重樓資源，充分發(fā)揮重樓的藥效做出貢獻(xiàn)，同時為研制成分、療效明確的中藥新藥奠定理論基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的制備方法，基于質(zhì)量源于設(shè)計(qbd)理念設(shè)計和開發(fā)重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的制備方法，采用熱熔乳化-高壓均質(zhì)技術(shù)制備重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒；其特征在于方法步驟如下：

(1)先將處方量的大豆磷脂、表面活性劑加入到適量的純化水中，恒溫水浴(70℃)攪拌溶解，制成水相；

(2)再依次將處方量的重樓總皂苷、單硬脂酸甘油酯加入到適量的無水乙醇中，恒溫水浴(70℃)攪拌溶解，制成油相；

(3)將油相緩慢加入到含藥水相中，開啟高剪切分散乳化機(jī)，速度設(shè)置為15000rpm，持續(xù)剪切分散10min，得到乳白色溶液；

(4)最后，將溶液經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)均質(zhì)后用純化水稀釋定容至全量，過0.22μm濾膜，冷水浴處理，即制備得到重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒。

本發(fā)明通過魚骨圖法風(fēng)險評估工具確定影響重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒制劑學(xué)性質(zhì)的處方因素，具體為：藥物濃度、單硬脂酸甘油酯濃度、大豆磷脂濃度、表面活性劑種類；制備工藝因素為：均質(zhì)壓力、均質(zhì)溫度、均質(zhì)次數(shù)。

本發(fā)明采用低溫高速離心法分離重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒中的游離藥物并采用hplc法測定包封率。

本發(fā)明測定包封率具體步驟為：

(1)平行取3份重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒溶液各2.0ml，加入到超速離心管中，設(shè)定離心速度為50000rpm，離心時間為1h，離心結(jié)束后仔細(xì)吸取上清液1ml至10ml容量瓶中，加流動相稀釋，定容；

(2)同時精密移取重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒溶液1.0ml于50ml容量瓶中，加入5ml甲醇破壞納米粒，加流動相稀釋，定容，分別取上述兩種溶液續(xù)濾液采用hplc法測定重樓總皂苷含量；按下式計算包封率：

ee(％)＝(1-w游離/w總)×100％

其中：w游離為重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒中未被包封的重樓總皂苷質(zhì)量；

w總為重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒中重樓總皂苷的總量。

本發(fā)明在設(shè)定的處方用量和參數(shù)范圍內(nèi)，單硬脂酸甘油酯濃度、大豆磷脂濃度和均質(zhì)壓力對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的粒徑分布影響較大；隨著單硬脂酸甘油酯濃度的增加粒徑增加，隨著大豆磷脂濃度的增加粒徑降低，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加粒徑降低。

本發(fā)明在設(shè)定的處方用量和參數(shù)范圍內(nèi)，單硬脂酸甘油酯濃度、大豆磷脂濃度對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的包封率影響較大；隨著單硬脂酸甘油酯濃度的增加包封率增加，隨著大豆磷脂濃度的增加包封率降低。

本發(fā)明給出的最佳制備條件：單硬脂酸甘油酯濃度為5.5％，大豆磷脂濃度為8.0％，均質(zhì)次數(shù)為6次；固定藥物濃度為5.0％、表面活性劑種類為tween80、均質(zhì)壓力為600bar，均質(zhì)溫度為65℃。

本發(fā)明的工作方法：根據(jù)重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒劑型及給藥特點(diǎn)確立了目標(biāo)產(chǎn)品概況，并根據(jù)之前的知識和經(jīng)驗，通過風(fēng)險評估工具確定影響固體脂質(zhì)納米粒制劑學(xué)性質(zhì)的關(guān)鍵性變量。首先應(yīng)用plackett-burman實驗設(shè)計篩選出對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒制劑學(xué)性質(zhì)影響顯著的關(guān)鍵變量，然后對篩選出的變量應(yīng)用box-behnken效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化。評價了重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的粒徑分布、pdi、zeta電位、微觀形態(tài)等理化性質(zhì)，考察了固體脂質(zhì)納米粒體外釋藥情況。

本發(fā)明的工作方法所作出的結(jié)果：重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒平均粒徑為(116.5±32.1)nm，多聚分散系數(shù)(pdi)為(0.198±0.018)，zeta電位為(-23.6.5±0.9)mv，透射電鏡顯示固體脂質(zhì)納米粒呈球狀分布，體外釋放結(jié)果表明具有緩釋效果，24h累積釋藥為63.5％。

本發(fā)明的工作方法所作出的結(jié)論：運(yùn)用質(zhì)量源于設(shè)計(qbd)理念設(shè)計和開發(fā)重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒是可行的，可確保其產(chǎn)品質(zhì)量符合要求。

本發(fā)明所采用的儀器與材料：agilent-1200高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司)；bp211d電子天平(德國賽多利斯集團(tuán)公司)；df2101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南鞏義英峪予華儀器廠)；ah-100d高壓均質(zhì)機(jī)(加拿大ats工業(yè)系統(tǒng)有限公司)；ikat18ultra-turrax高速剪切機(jī)(德國ika集團(tuán)公司)；mastersizer粒度分析儀(英國馬爾文公司)；zetasizernano電位分析儀(英國馬爾文公司)；jm21200ex透射電鏡(日本電子公司)；gc2120gx日立冷凍離心機(jī)(日本日立公司)。

陜產(chǎn)重樓總皂苷(實驗室提取純化，批號：sx20140502，純度＞90.0％)；重樓皂苷1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111590-201604，純度：93.6％)，重樓皂苷ii對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111593201303，純度：92.5％)；單硬脂酸甘油酯(glycerylmonostearate，巴斯夫中國有限公司，批號：m271930827)；大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)，批號：20150125)；泊洛沙姆188(f68，南京威爾化工有限公司，批號：150124)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本研究是在已有實驗、文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上借鑒qbd藥物開發(fā)新理念對陜產(chǎn)重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的處方及制備工藝參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，通過對之前固體脂質(zhì)納米粒的研究經(jīng)驗，采用魚骨圖法找出了可能會影響重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒性質(zhì)的關(guān)鍵因素，并采用plackett-burman實驗設(shè)計篩選出對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米性質(zhì)影響較為顯著的因素，采用box-behnken效應(yīng)面法優(yōu)化得到最優(yōu)制備處方和生產(chǎn)工藝參數(shù)，最終得到了制備重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的最優(yōu)處方和生產(chǎn)工藝參數(shù)。另外，應(yīng)用本研究摸索成熟后的基于qbd藥物開發(fā)新理念制備重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米?？蓱?yīng)用于其他性質(zhì)相似的藥物，給中藥制劑現(xiàn)代化提供一定的理論支持。通過提高中藥制藥過程的質(zhì)量控制水平，從而達(dá)到提升中藥制劑產(chǎn)品的質(zhì)量和競爭力的目的。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒魚骨圖。

圖2為本發(fā)明的重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒固體脂質(zhì)納米粒透射電鏡圖(×20000)。

圖3為本發(fā)明的重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒體外釋放曲線(n＝6)。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。

1.方法與結(jié)果；

2.1確立重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒目標(biāo)產(chǎn)品概況；

通過相關(guān)參考文獻(xiàn)以及考慮到臨床給藥特點(diǎn)，確定本制劑的劑型、給藥途徑、規(guī)格、容器密閉系統(tǒng)等信息，確立了重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒目標(biāo)產(chǎn)品概況。

表1重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的目標(biāo)產(chǎn)品概況

2.2重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒風(fēng)險分析；

如圖1所示，根據(jù)之前的知識和經(jīng)驗，并對各因素進(jìn)行排列和比較，通過魚骨圖法風(fēng)險評估工具確定影響重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒制劑學(xué)性質(zhì)的處方因素為：藥物濃度、單硬脂酸甘油酯濃度、大豆磷脂濃度、表面活性劑種類；制備工藝因素為：均質(zhì)壓力、均質(zhì)溫度、均質(zhì)次數(shù)。

2.3重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的制備；

通過制備工藝的預(yù)實驗研究，本文確定采用熱熔乳化-高壓均質(zhì)技術(shù)制備重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒。制備工藝操作如下：先將處方量的大豆磷脂、表面活性劑加入到適量的純化水中，恒溫水浴(70℃)攪拌溶解，制成水相；再依次將處方量的重樓總皂苷、單硬脂酸甘油酯加入到適量的無水乙醇中，恒溫水浴(70℃)攪拌溶解，制成油相；將油相緩慢加入到含藥水相中，開啟高剪切分散乳化機(jī)，速度設(shè)置為15000rpm，持續(xù)剪切分散10min，得到乳白色溶液；最后，將溶液經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)均質(zhì)后用純化水稀釋定容至全量，過0.22μm濾膜，冷水浴處理，即制備得到重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒。

2.4重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒包封率的測定；

采用低溫高速離心法分離重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒中的游離藥物并采用hplc法測定包封率。平行取3份重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒溶液各2.0ml，加入到超速離心管中，設(shè)定離心速度為50000rpm，離心時間為1h，離心結(jié)束后仔細(xì)吸取上清液1ml至10ml容量瓶中，加流動相稀釋，定容；同時精密移取重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒溶液1.0ml于50ml容量瓶中，加入5ml甲醇破壞納米粒，加流動相稀釋，定容，分別取上述兩種溶液續(xù)濾液采用hplc法測定重樓總皂苷含量。按下式計算包封率：

ee(％)＝(1-w游離/w總)×100％

其中：w游離為重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒中未被包封的重樓總皂苷質(zhì)量；

w總為重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒中重樓總皂苷的總量。

2.5實驗優(yōu)化；

2.5.1plackett-burman實驗設(shè)計篩選變量通過對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒處方及制備工藝的分析，以藥物濃度(x1，％)，單硬脂酸甘油酯濃度(x2，％)、大豆磷脂濃度(x3，％)、表面活性劑種類(x4)、均質(zhì)壓力(x5，bar)、均質(zhì)溫度(x6，℃)、均質(zhì)次數(shù)(x7)為考察對象，以平均粒徑(y1，nm)和包封率(y2，ee％)作為評價指標(biāo)，利用plackett-burman實驗設(shè)計篩選上述實驗變量，確定影響重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒性質(zhì)的關(guān)鍵性變量，實驗結(jié)果見表3。

表2plackett-burman實驗設(shè)計

表3實驗設(shè)計表與效應(yīng)值

有實驗結(jié)果可知，單硬脂酸甘油酯濃度、均質(zhì)次數(shù)對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的粒徑分布具有顯著影響(p＜0.05)；單硬脂酸甘油酯濃度、大豆磷脂濃度對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的包封率具有顯著性影響(p＜0.05)；而藥物濃度、表面活性劑種類、均質(zhì)次數(shù)和均質(zhì)溫度對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的粒徑分布和包封率均無顯著影響(p＞0.05)，因此，本研究固定藥物濃度、表面活性劑種類、均質(zhì)次數(shù)和均質(zhì)溫度4個變量(表4)，以單硬脂酸甘油酯濃度為2％～8％(w/v)，大豆磷脂濃度為5％～10％(w/v)，均質(zhì)次數(shù)為3～9次，應(yīng)用box-behnken效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化三個變量。

表4box-behnken實驗設(shè)計優(yōu)化過程中固定的處方和工藝參數(shù)

2.5.2box-behnken效應(yīng)面法優(yōu)化變量對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒性質(zhì)影響較顯著的3個因素進(jìn)行優(yōu)化：山單硬脂酸甘油酯濃度(x1，％)，大豆磷脂濃度(x2，％)、均質(zhì)次數(shù)(x1)為考察對象，以平均粒徑(y2，nm)和包封率(y1，ee％)作為評價指標(biāo)，利用box-behnken效應(yīng)面法對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化，實驗安排及結(jié)果見表6。

表5box-behnken實驗設(shè)計

表6實驗設(shè)計表與效應(yīng)值

2.5.3數(shù)據(jù)處理及方差分析采用“minitab17”實驗設(shè)計軟件中的“box-behnken”實驗設(shè)計對表6中的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果見表7；

表7二次多元方程的方差分析

通過方差分析結(jié)果和等值線圖可知，在設(shè)定的處方用量和參數(shù)范圍內(nèi)，單硬脂酸甘油酯濃度、大豆磷脂濃度和均質(zhì)壓力對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的粒徑分布影響較大。隨著單硬脂酸甘油酯濃度的增加粒徑增加，隨著大豆磷脂濃度的增加粒徑降低，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加粒徑降低。

通過方差分析結(jié)果和等值線圖可知，在設(shè)定的處方用量和參數(shù)范圍內(nèi)，單硬脂酸甘油酯濃度、大豆磷脂濃度對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的包封率影響較大。隨著單硬脂酸甘油酯濃度的增加包封率增加，隨著大豆磷脂濃度的增加包封率降低。

2.5.4優(yōu)化變量驗證；

根據(jù)“minitab17”實驗設(shè)計軟綜合評價后給出的最佳制備條件：單硬脂酸甘油酯濃度為5.5％，大豆磷脂濃度為8.0％，均質(zhì)次數(shù)為6次。固定藥物濃度為5.0％、表面活性劑種類為tween80、均質(zhì)壓力為600bar，均質(zhì)溫度為65℃，采用優(yōu)化的最優(yōu)變量制備3批重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒，測定固體脂質(zhì)納米粒包封率和平均粒徑，對模型預(yù)測進(jìn)行驗證。實驗觀察值和模型預(yù)測值偏差的絕對值均小于10％，說明模型預(yù)測性良好。

2.6重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的質(zhì)量評價；

2.6.1粒徑分布和zeta電位評價；

取重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒溶液少量，加蒸餾水稀釋，分別采用mastersizer粒度分析儀和zetasizernano電位分析儀測定粒徑分布、pdi和zeta電位。實驗結(jié)果：重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的粒徑呈單峰成分布，平均粒徑為(116.5±32.1)nm，pdi為(0.198±0.018)，zeta電位為(-23.6.5±0.9)mv。

2.6.2微觀形態(tài)表征；

取重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒溶液少量，加蒸餾水稀釋，吸取少量液體滴加到銅絲網(wǎng)表面，再滴加2.0％磷鎢酸負(fù)染15min，揮干水分，在透射電子顯微鏡下觀察微觀形態(tài)，并拍攝電鏡照片(如圖2所示)。電鏡照片顯示重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒固體脂質(zhì)納米粒表面光滑，呈規(guī)則球形或類球形分布。

2.6.3釋藥行為評價；

采用透析法考察重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒體外的釋放行為。釋放介質(zhì)為ph6.8磷酸鹽緩沖液(含0.5％tween80)，介質(zhì)體積為250ml，介質(zhì)溫度為(37±0.5)℃，槳轉(zhuǎn)速為50rpm。精密移取2.0ml重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒置經(jīng)預(yù)先處理的透析袋(截留分子量12,000～14,000道爾頓)中，扎緊袋口，固定在槳葉底部，分別在0.5、1、2、4、6、8、12、16、24h吸取5ml釋放介質(zhì)(同時補(bǔ)加等溫釋放介質(zhì)5ml)經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，采用hplc法測定重樓總皂苷含量；(如圖3所示)。

釋藥行為研究表明，重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒具有延緩藥物釋放的作用，在前2.0h藥物釋放較快，釋藥達(dá)到近20％，后期釋藥較為緩慢，24h藥物釋放達(dá)60％。

3.討論；本研究是在已有實驗、文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上借鑒qbd藥物開發(fā)新理念對陜產(chǎn)重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的處方及制備工藝參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，通過對之前固體脂質(zhì)納米粒的研究經(jīng)驗，采用魚骨圖法找出了可能會影響重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒性質(zhì)的關(guān)鍵因素，并采用plackett-burman實驗設(shè)計篩選出對重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米性質(zhì)影響較為顯著的因素，采用box-behnken效應(yīng)面法優(yōu)化得到最優(yōu)制備處方和生產(chǎn)工藝參數(shù)，最終得到了制備重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒的最優(yōu)處方和生產(chǎn)工藝參數(shù)。另外，應(yīng)用本研究摸索成熟后的基于qbd藥物開發(fā)新理念制備重樓總皂苷固體脂質(zhì)納米粒可應(yīng)用于其他性質(zhì)相似的藥物，給中藥制劑現(xiàn)代化提供一定的理論支持。通過提高中藥制藥過程的質(zhì)量控制水平，從而達(dá)到提升中藥制劑產(chǎn)品的質(zhì)量和競爭力的目的。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其實用新型構(gòu)思加以等同替換或改變，部應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。