本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是一種多功能高分子納米粒及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

很多研究顯示，腫瘤的異質(zhì)性是惡性腫瘤重要的特征之一，同一腫瘤中可以存在有很多不同的基因亞型或者細(xì)胞亞型，同一種腫瘤在不同的個(gè)體身上呈現(xiàn)也許不一樣，甚至同一個(gè)體身上的腫瘤細(xì)胞也存在不同的特性和差異，正因?yàn)檫@點(diǎn)，治療時(shí)腫瘤對(duì)藥物的反應(yīng)也相應(yīng)不同，而目前臨床上大部分還是“one-size-fits-all”，導(dǎo)致治療效果差異很大。

因此，為了解決上述問題，早在2004年美國(guó)fda就強(qiáng)烈建議科學(xué)界采用個(gè)體化治療。但是目前在個(gè)體化治療實(shí)施中，面臨巨大的問題和挑戰(zhàn)：(1)早期診斷不方便、不準(zhǔn)確；(2)治療后不能對(duì)病灶部位效果進(jìn)行實(shí)時(shí)反饋。因此為了盡早實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，迫切需要提供安全、便捷、可實(shí)施的診療一體化藥物。

近年來快速發(fā)展的“診療一體化”藥物，為腫瘤個(gè)體化治療提供了一種方便有效的手段，已經(jīng)成為癌癥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。所謂的“診療一體化”藥物是指同時(shí)包含藥物和造影劑的遞藥系統(tǒng)，進(jìn)入體內(nèi)可以同時(shí)達(dá)到診斷和治療的雙重效果，縮短診療間隔時(shí)間，提高患者就醫(yī)質(zhì)量和療效。

現(xiàn)在臨床試驗(yàn)中mri是最強(qiáng)的非入侵式診斷工具之一，相比于其他影像技術(shù)，他具有更高的空間分辨率和軟組織造影。目前mri應(yīng)用的造影劑有g(shù)d-dtpa、金納米粒、氧化鐵等。其中由于非入侵式毒性小、能透過人體骨骼成像、造影效果顯著的超順磁氧化鐵造影劑被廣泛應(yīng)用。目前超順磁氧化鐵造影劑已經(jīng)進(jìn)入早期臨床研究階段，典型的研究有l(wèi)umiren用于腸道造影,feridexiv用于肝臟和脾臟造影等，但是鐵氧化物用于腦膠質(zhì)瘤的臨床研究還沒有。所以，利用超順磁氧化鐵能透過骨頭造影、以及對(duì)生物體內(nèi)毒性極小等特點(diǎn)，可以對(duì)腫瘤臨床造影進(jìn)行更深入全面的研究。

想要讓超順磁氧化鐵在體內(nèi)有很好的造影效果，其外部包裹的載體則顯得尤為重要。目前，高分子是包載氧化鐵造影劑最普遍的載體，它的功能包括：(1)不同包裹材料、以及厚度不同可能影像造影劑的r2值；(2)可以在造影同時(shí)提供化學(xué)鍵相連的藥物，以及靶向分子；(3)由于可以制備不同粒徑大小，所以根據(jù)epr效應(yīng)可以減少非目標(biāo)組織的毒性；(4)提高生物相容性，增加納米粒在血液中的半衰期。但是大多數(shù)高分子需要修飾之后才能作為包覆材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多功能高分子納米粒。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于，提供一種所述納米粒的制備方法，利用該方法制備出的納米粒子，能夠提高藥物在體內(nèi)的水溶性以便達(dá)到更好的效果，同時(shí)此納米粒具有藥物實(shí)時(shí)定位檢測(cè)、分析腫瘤細(xì)胞藥物代謝等特點(diǎn)。

最后，將所述納米粒用于制備治療、診斷腦膠質(zhì)瘤藥物中。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)方案是：

一種多功能高分子納米粒，特點(diǎn)是：該納米粒由中心核以及核外包裹的囊殼組成，中心核為超順磁性四氧化三鐵spion造影劑，外部囊殼為聚谷氨酸修飾后含有兩個(gè)羧基的聚合物偶聯(lián)紫杉醇構(gòu)成的高分子偶聯(lián)藥物pgg-ptx；其中，pgg與ptx由酯鍵相連；其pgg-ptx的載藥量為35％；所述高分子偶聯(lián)藥物pgg-ptx具有以下結(jié)構(gòu)：

一種上述納米粒的制備方法，該方法包括以下具體步驟：

步驟1：常溫下，將凍干的高分子偶聯(lián)藥物溶于0.5％乙酸鈉溶液中，配制成2-6mg/ml高分子載藥水溶液，該高分子偶聯(lián)藥物在水中自組裝形成外部親水內(nèi)部疏水球形納米粒；粒徑為66.62±1.36nm，粒徑分布pdi為0.21；

步驟2：常溫下，將5mg/ml的超順磁四氧化三鐵甲苯溶液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使得甲苯溶劑完全蒸發(fā)，加入分析純的二氯甲烷和分析純的丙酮混合溶液，配制成1-4mg/ml超順磁四氧化三鐵二氯甲烷丙酮有機(jī)溶液；其中，分析純的二氯甲烷和分析純的丙酮體積比為1:2；測(cè)得粒徑為8.02±1.07nm，粒徑分布pdi為0.22；

步驟3：將步驟2的溶液逐滴加入到步驟1的溶液中，同時(shí)伴有常溫?cái)嚢?；其中步驟2的溶液與步驟1的溶液體積比為1:2-3；

步驟4：將步驟3的混合溶液進(jìn)行超聲3-10分鐘，頻率65％，時(shí)間間隔1s，溶液變?yōu)榈S色澄清溶液；

步驟5：將步驟4的溶液放置于室溫下攪拌20-30分鐘；攪拌后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，溫度控制在30-50℃,直至液體不再沸騰，無氣泡冒出；

步驟6：將步驟5的溶液放置冷凍干燥箱中，7-9天取出，得到所述納米粒。

一種上述納米粒在制備治療、診斷腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。

對(duì)本發(fā)明的診療一體化納米粒分別做了如下測(cè)定：

測(cè)定此納米粒的粒徑；

測(cè)定此納米粒的形態(tài)；

測(cè)定此納米粒的t2值；

測(cè)定此納米粒的包封率；

測(cè)定此納米粒的熱重分析；

測(cè)定此納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性；

測(cè)定此納米粒h&e組織切片分析；

測(cè)定此納米粒體內(nèi)動(dòng)物腫瘤模型藥效；

測(cè)定此納米粒體內(nèi)動(dòng)物t2成像。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的納米粒在水中溶解性好，提高ptx溶解度，pgg高分子骨架生物相容性好，可降解，提高了納米粒的安全性，納米?？梢酝ㄟ^靜脈注射給藥，利用腫瘤組織中的epr效應(yīng)被動(dòng)靶向到腫瘤組織，從而減小正常組織的毒性，同時(shí)具備影像功能，實(shí)時(shí)反饋藥物進(jìn)展，為未來臨床醫(yī)生縮短診斷與治療之間的時(shí)間，準(zhǔn)確判斷病情，合理化個(gè)性用藥提供有力的支持。

附圖說明

圖1為本發(fā)明納米粒制備流程圖；

圖2為本發(fā)明納米粒pgg-ptx/spion的粒徑圖；

圖3為本發(fā)明納米粒透射電鏡下觀察的形態(tài)圖；

圖4為本發(fā)明納米粒t2測(cè)試圖；

圖5為本發(fā)明納米粒腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)圖；

圖6為本發(fā)明化納米粒h&e染色圖；’

圖7為本發(fā)明納米粒體內(nèi)成像圖；

圖8為本發(fā)明納米粒動(dòng)物體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)圖。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面用實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面實(shí)例。

聚谷氨酸高分子化學(xué)鍵連接紫杉醇合成方法以及載藥量可參閱《yang,d.,etal.,effectofmolecularweightofpgg-paclitaxelconjugatesoninvitroandinvivoefficacy.jcontrolrelease,2012.161(1):p.124-131》。

實(shí)施例1

制備pgg-ptx/spion納米粒

將25mgpgg-ptx溶于10ml0.5％膽酸鈉溶液中，玻璃棒均勻攪拌，得高分子偶聯(lián)ptx水溶液；將超順磁氧化鐵溶于20ml二氯甲烷和丙酮的混合液中，得造影劑有機(jī)相溶液；將油相溶液逐滴加入水相溶液中，并用玻璃棒不斷攪拌；超聲1.5min，功率65％間隔超聲時(shí)間1s，乳狀小液滴逐漸消失，逐漸由褐色變?yōu)闇\黃色溶液；置于圓底燒瓶中室溫?cái)嚢?0-30min，400rpm；攪拌之后，倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，溫度設(shè)為35℃，蒸發(fā)20min-30min至不再沸騰；最后取出溶液放入冷凍干燥機(jī)中，7天，得乳白色絮狀固體pgg-ptx/spion納米粒。

實(shí)施例2

將凍干后的pgg-ptx/spion納米粒溶于蒸餾水中，加入適量強(qiáng)酸，降解高分子，通過icp定量測(cè)量pgg-ptx/spion中spion的含量6.34wt％。

實(shí)施例3

pgg-ptx/spion納米粒配置成1.5mg/ml溶液，超聲10分鐘后用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)量粒徑大小，結(jié)果如圖2所示，粒徑分散性良好，平均粒徑為113.03±0.6nm。

實(shí)施例4

通過tem觀察pgg-ptx/spion納米粒微觀形態(tài)，將pgg-ptx/spion納米粒溶液小心滴加在銅網(wǎng)上面，在室溫或白熾燈烘烤條件下讓銅網(wǎng)表面水分蒸發(fā)，再滴加1％磷鎢酸于銅網(wǎng)上，覆蓋pgg-ptx/spion納米粒，室溫水分干燥蒸發(fā)盡后，置于透射電鏡下觀察其形態(tài)，如圖3所示，其形態(tài)呈圓球形，中間清晰可見超順磁氧化鐵納米粒包裹在其中。

實(shí)施例5

在室溫條件下，通過3tmri測(cè)量pgg-ptx/spion納米粒的t2值。根據(jù)超順磁氧化鐵含量，配置不同濃度梯度溶液，并以pbs溶液作為對(duì)照組。將樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，并用一下參數(shù)測(cè)量t2值：fov＝120×54.6mm,matrixsize＝204×448,slicethickness＝5mm；numberofslice＝1；1average,tr＝3000ms；te＝15.2,30.4,45.6,60.8,76.0,91.2,106.4,121.6,136.8,152.0and167.2ms。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，此納米粒子具有濃度依賴的漸暗性質(zhì)，r2為132.53mm^-1s^-1，通常用r2來評(píng)估m(xù)r造影劑的性能，表明可以用t2信號(hào)作為mri的檢測(cè)。

實(shí)施例6

pgg-ptx/spion、pgg-ptx、ptx三者體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)以u(píng)87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用cck-8試劑盒，通過三個(gè)實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞抑制率來測(cè)定三種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性。具體方法：將u87細(xì)胞種于96孔板中，密度為1×10⁵個(gè)/ml，放置于5％co2的培養(yǎng)箱中，37℃恒溫培養(yǎng)36-48小時(shí)，顯微鏡觀察，待細(xì)胞長(zhǎng)滿視野80％時(shí)，移去液體，每孔重新加入100μl培養(yǎng)基和10μlcck-8試劑，將96孔板放置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)，最后用酶標(biāo)儀測(cè)量樣品在450nm處的od值。如圖5所示，pgg-ptx/spion和ptx效果相近，說明相比于pgg-ptx抑制腫瘤效果更好。

實(shí)施例7

pgg-ptx/spion納米粒進(jìn)行組織h&e染色實(shí)驗(yàn)。給健康裸鼠通過尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)組納米粒藥物和對(duì)照組生理鹽水，兩周后摘取心、肺、腎、肝、脾組織切片，用于實(shí)驗(yàn)分析。組織切片一般規(guī)格為8mm×8mmμm，用h&e試劑按照說明說染色，所有的結(jié)果用olympus(dp71,olympus)來觀察分析。如圖6所示，此納米粒藥物對(duì)正常組織沒有損害，相反腫瘤組織出現(xiàn)壞死部分，說明此納米粒對(duì)于健康組織具有一定的安全性。

實(shí)施例8

核磁共振體內(nèi)成像用特制的小鼠線圈通過3t影像設(shè)備測(cè)定。實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過尾靜脈注釋把實(shí)驗(yàn)藥物pgg-ptx/spion納米粒溶液注入老鼠體內(nèi)。具體參數(shù)如下tr＝3500，te＝76ms，imagematrix＝256×256,fieldofview(fov)70×70mm²,slicethickness＝0.8mm，averages＝8，掃描時(shí)間為5分13秒。如圖7所示，可以清楚看到腫瘤內(nèi)部隨時(shí)間的變化逐漸變暗，說明pgg-ptx/spion納米粒進(jìn)入腫瘤組織，并隨著時(shí)間的推移而逐漸代謝。由此，可以清晰看到藥物在體內(nèi)的聚集情況，以及代謝。

實(shí)施例9

用裸鼠進(jìn)行此納米粒體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)。裸鼠接種u87細(xì)胞，注射腋窩皮下部位，大約15天長(zhǎng)出腫瘤，大小約為100mm³。以ptx含量相同的情況下，通過尾靜脈分別注射pgg-ptx/spion、pgg-ptx實(shí)驗(yàn)組和pbs對(duì)照組，腫瘤體積沒兩天測(cè)量一次，一直持續(xù)15天。游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬度值。按照特定公式v＝1/2(長(zhǎng)×寬²)計(jì)算出腫瘤體積。由圖8所示，pgg-ptx/spion、pgg-ptx兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組來說都有抑制腫瘤體積增長(zhǎng)作用，并且pgg-ptx/spion抑制效果更好一些。說明pgg-ptx/spion在體內(nèi)有很好的藥效。