本申請為分案申請，其原申請的申請日為2009年7月14日，申請?zhí)枮?00980136013.9，名稱為“包含tb10.4的疫苗”。

本發(fā)明公開了一種具有低劑量抗原的人用疫苗，包含佐劑中的融合于抗原85-復(fù)合體(如ag85b)的多肽的tb10.4；以及結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)的免疫和治療方法。

背景技術(shù)：

全世界正致力于開發(fā)出比當(dāng)前使用的卡介苗(bcg)疫苗更有效的結(jié)核分枝桿菌疫苗，這包括不同的策略，例如活的減毒疫苗(9)、病毒載體化的結(jié)核分枝桿菌疫苗(11)和亞單位疫苗(12,14)。亞單位疫苗方法擁有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如，安全性和穩(wěn)定性增加，以及經(jīng)證實(shí)的加強(qiáng)之前的bcg接種的能力(4,7)。另外，由于亞單位疫苗似乎不受環(huán)境中分枝桿菌的影響，因此這類疫苗可能在發(fā)展中國家中特別有用(3)。然而，該領(lǐng)域的進(jìn)展已因缺乏引起細(xì)胞介導(dǎo)的強(qiáng)免疫(cmi)應(yīng)答的佐劑而被延誤。因此，仍然需要能形成多功能免疫細(xì)胞從而提供更強(qiáng)的抵御結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)作用的免疫原性組合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本研究檢查了作為抵御結(jié)核分枝桿菌感染的新疫苗的ag85b-tb10.4(hyvac4)和佐劑的結(jié)合物。結(jié)果顯示，ag85b-tb10.4和佐劑誘導(dǎo)了大量的多功能cd4⁺t細(xì)胞，并提供了抵御結(jié)核分枝桿菌的顯著保護(hù)作用。令人意外地是，ag85b-tb10.4抗原和佐劑的結(jié)合物對抗原劑量敏感。因此，盡管在小鼠中的標(biāo)準(zhǔn)劑量5.0μg中的ag85b-tb10.4不會(huì)引起抵御結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)作用，但是0.5μg中的ag85b-tb10.4卻誘發(fā)了與bcg相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種人用免疫原性組合物，包含tb10.4蛋白和ag85-復(fù)合蛋白，所述tb10.4蛋白和ag85-復(fù)合蛋白任選地可融合在一起或作為分開的蛋白提供，其中蛋白總量少于約25.0μg、優(yōu)選地少于10.0μg或者等于約0.5μg/抗原劑量。

所公開的免疫原性組合物可以額外地包含佐劑。本發(fā)明的優(yōu)選佐劑具有至少一種聚陽離子肽和至少一種寡核苷酸，優(yōu)選地，所述寡核苷酸為tlr9激動(dòng)劑。

本發(fā)明的優(yōu)選佐劑為并且ag85-復(fù)合體的優(yōu)選蛋白為ag85b蛋白。

本發(fā)明公開了一種人用疫苗，包含上述免疫原性組合物。

本發(fā)明還公開了一種在人中誘導(dǎo)抵御結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)作用的方法，所述方法包括將一種如上所述的免疫原性組合物引入該人中。

本研究檢查了作為抵御結(jié)核分枝桿菌感染的新疫苗的ag85b-tb10.4(hyvac4)融合蛋白和的結(jié)合物。佐劑包含陽離子肽和tlr9受體激動(dòng)劑。

在形成抵御結(jié)核分枝桿菌感染的有效疫苗的嘗試中，ag85b-tb10.4融合蛋白和的結(jié)合物因以下原因而具有吸引力：

(1)可促進(jìn)強(qiáng)th1應(yīng)答；

(2)在臨床試驗(yàn)中具有前景光明的特點(diǎn)；已經(jīng)在臨床1期試驗(yàn)中結(jié)合三價(jià)流感疫苗以及結(jié)合結(jié)核病疫苗對它進(jìn)行了成功測試(50μg中的ag85b-esat-6；臨床數(shù)據(jù)尚未公布)。用中的ag85b-esat6進(jìn)行的動(dòng)物研究記載于(1)；

(3)ag85b-tb10.4融合蛋白具有的優(yōu)點(diǎn)是它不含可用于診斷目的的任何蛋白例如esat-6。esat-6是一種極有價(jià)值的診斷試劑，并且是諸多商業(yè)化診斷測試的基礎(chǔ)(5,10,13)。將esat-6排除在日后的疫苗之外將使得診斷測試和疫苗可平行使用，因?yàn)閍g85b-tb10.4融合蛋白不會(huì)影響任何具體的診斷測試；

(4)由于ag85b和tb10.4兩者均由bcg表達(dá)，因此本發(fā)明的疫苗還可用作bcg的加強(qiáng)疫苗。

結(jié)果表明，ag85b-tb10.4和的結(jié)合物誘導(dǎo)了大量的多功能cd4⁺t細(xì)胞，并提供了抵御結(jié)核分枝桿菌的顯著保護(hù)作用。令人意外地，ag85b-tb10.4融合蛋白和佐劑的結(jié)合物對抗原劑量極為敏感。因此，盡管劑量為5.0μg的中的ag85b-tb10.4不會(huì)引起抵御結(jié)核分枝桿菌的顯著保護(hù)作用，但是0.5μg的中的ag85b-tb10.4卻誘發(fā)了與bcg相當(dāng)?shù)膹?qiáng)保護(hù)作用(實(shí)施例3和圖4)。相比之下，之前用其他抗原例如在mpl-dda中的ag85b-esat6的研究顯示，該融合蛋白的最佳抗原劑量為大約10.0μg(16)，并且劑量為5μg的mpl-dda中的ag85b-tb10.4提供了與bcg相當(dāng)?shù)娘@著保護(hù)(8)，表明ag85b-tb10.4是一種不尋常的免疫原性分子。

這是證明佐劑中的ag85b-tb10.4融合蛋白形成抵御結(jié)核分枝桿菌感染的有效疫苗的首份研究。

在整篇說明書中，除非上下文另有要求，否則措辭“包含”或其變化形式例如“含有”或者“包括”將被理解為意味著包括所述要素、整數(shù)、要素組或整數(shù)組，但是并不排除任何其他要素、整數(shù)、要素組或整數(shù)組。

抗原

本發(fā)明的抗原可以包含融合于tb10.4蛋白的ag85-復(fù)合體的蛋白，包括例如ag85-復(fù)合體的蛋白ag85a、ag85b或ag85c。

ag85b-tb10.4是一種不尋常的免疫原性分子，該分子必須以低劑量給予，以引發(fā)最大量的多功能免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)更多的干擾素-γ表達(dá)和增加的抵御結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)作用。在本說明書中，ag85b-tb10.4融合蛋白與術(shù)語h4和hyvac4可互換。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原可包含ag85復(fù)合體的蛋白和tb10.4蛋白，其中所述ag85復(fù)合蛋白沒有融合于所述tb10.4蛋白。

優(yōu)選的所述ag85復(fù)合體的蛋白為ag85b。

每種蛋白均可通過糖基化或脂質(zhì)化進(jìn)行修飾(mowatetal.1991；lustigetal.1976)。每種蛋白均可通過添加輔基、純化部分或者信號(hào)肽進(jìn)行修飾。每種蛋白均可被修飾一次或多次，或者不進(jìn)行任何修飾。每種蛋白均可被單獨(dú)地或者組合地修飾。每種蛋白均由具體的氨基酸進(jìn)行表征，并可由具體的核酸序列編碼。在本發(fā)明范圍內(nèi)的是這樣的序列以及通過重組方法或者合成方法產(chǎn)生的類似序列和變化序列，其中這些氨基酸序列已通過在重組蛋白中置換、插入、添加或者缺失一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基而被修飾，同時(shí)保留其免疫原性，這通過本文所述的任何一種或者全部生物學(xué)分析法得到確認(rèn)。

置換優(yōu)選地是“保守”的。這樣的置換通過下表定義。第二列同一區(qū)塊、優(yōu)選第三列同一行的氨基酸可以彼此置換。第三列中的氨基酸表示為單字母代碼。

佐劑

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗原可以包含佐劑中的融合于tb10.4蛋白的ag85復(fù)合蛋白。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原可以包含佐劑中的ag85復(fù)合蛋白和tb10.4蛋白(即非融合的)。

ag85b-tb10.4是一種不尋常的免疫原性分子，該分子必須以低劑量給予，以引發(fā)最大量的多功能免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)更多的干擾素-γ表達(dá)和增加的抵御結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)作用。實(shí)例有包含聚陽離子肽[如聚賴氨酸(klk肽)或者聚精氨酸]和寡脫氧核酸分子的佐劑，但是不限于該佐劑。

本發(fā)明的優(yōu)選佐劑為聚陽離子肽[如聚賴氨酸(klk肽)或者聚精氨酸]和寡脫氧核酸分子[i-odn]的混合物。適合與本發(fā)明一起使用的i-odn的實(shí)例為寡聚dic如5`-icicicicicicicicicicicicic-3`。對適合與本發(fā)明一起使用的i-odn的完整綜述提供于pct國際申請公開文本no.wo0193905和wo0193903，這兩份申請均通過援引納入本文。適合與本發(fā)明一起使用的klk肽的一個(gè)實(shí)例為nh2klklllllklk-cooh或klklllllklk-nh2。適合的聚陽離子肽的其他實(shí)例為rlrlllllrlr-nh2、rlklllllklr-nh2、kfkfffffkfk-nh2、kwkwwwwwkwk-nh2或kvkvvvvvkvk-nh2。對適合與本發(fā)明一起使用的聚陽離子肽的完整綜述提供于pct國際申請公布文本no.wo0232451，這份申請通過援引納入本文。

佐劑包含肽nh2-klklllllklk-cooh(獲自multiplepeptidesystems,sandiego,ca,usa)和寡核苷酸5`-icicicicicicicicicicicicic-3`(購自proligo,boulder,usa)的混合物。

此前的研究已經(jīng)證明，陽離子脂質(zhì)體中的ag85b-tb10.4融合蛋白或者ag85b-esat-6融合蛋白誘發(fā)了抵御結(jié)核分枝桿菌的有效保護(hù)作用，并且在小鼠結(jié)核分枝桿菌動(dòng)物模型中，中的ag85b-esat-6的保護(hù)性與bcg的一樣(1,8,12)。在這其中的每份研究中，均采用了標(biāo)準(zhǔn)抗原劑量5.0μg。

在本研究中，劑量為0.5μg的ic31[100nmol肽(nh2-klklllllklk-cooh)和5nmol寡核苷酸(5`-icicicicicicicicicicicicic-3`)]中的ag85b-tb10.4融合蛋白誘發(fā)了強(qiáng)inf-γ應(yīng)答。該強(qiáng)inf-γ應(yīng)答的范圍與5.0μg沒有ic31的ag85b-tb10.4融合蛋白的大致相同。而且，0.5μgic31[100nmol肽(nh2-klklllllklk-cooh)和5nmol寡核苷酸(5`-icicicicicicicicicicicicic-3`)]中的ag85b-tb10.4融合蛋白提供了范圍與bcg的大致相同的強(qiáng)保護(hù)。令人意外地，這要好于僅5.0μg或者15.0μg的ag85b-tb10.4融合蛋白(即沒有ic31)，表明僅ag85b-tb10.4融合蛋白的最佳劑量少于約5.0μg/劑量。

而且，在用任一疫苗組分刺激之后，最低劑量的ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白(0.5μg)產(chǎn)生了最高的ifn-γ應(yīng)答(參見圖1和2)。最后，用ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白進(jìn)行的接種誘導(dǎo)了兩個(gè)主要cd4⁺t細(xì)胞群，一個(gè)表達(dá)ifn-γ、il-2和tnf-α,另一個(gè)表達(dá)il-2和tnf-α。這兩個(gè)t細(xì)胞群均屬于中樞記憶t細(xì)胞，并且均是長期記憶所必需的(17)。重要的是，如通過elisa測量的ifn-γ表達(dá)所觀察到的，使用劑量為0.5μg的ic31中的hyvac4融合蛋白誘導(dǎo)了表達(dá)ifn-γ、il-2和tnf-α的多功能細(xì)胞群中的最大細(xì)胞數(shù)目(參見圖3)。

本發(fā)明證明了以下內(nèi)容：

(1)佐劑ic31和陽離子脂質(zhì)體展現(xiàn)出對抗原劑量的不同敏感性；和

(2)ic31中的最佳抗原劑量是抗原依賴的。

例如，0.5μgic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白誘發(fā)了顯著保護(hù)作用，而5.0μgic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白卻不能(圖4)。

總之，這些結(jié)果突顯了在測試新的佐劑/抗原制劑時(shí)分析抗原劑量的重要性，并且教導(dǎo)了疫苗中的最佳抗原劑量取決于抗原和佐劑兩者。

而且，在本發(fā)明中，所觀察到的多功能t細(xì)胞的量和ic31中的ag85b-tb10.4疫苗誘發(fā)的保護(hù)作用強(qiáng)度之間的相關(guān)性與最近的一項(xiàng)研究相一致，在這項(xiàng)研究中，抵御碩大利什曼原蟲(leishmaniamajor)感染的保護(hù)性免疫性與長期記憶應(yīng)答和產(chǎn)生的多功能t細(xì)胞的數(shù)目呈直接相關(guān)(6)。

附圖說明

圖1.對接種抗原的免疫識(shí)別。用1.0或5.0μg/ml的ag85b、tb10.4或者cfp10刺激從用不同劑量的ic31中的h4接種的小鼠組和鹽水對照組中分離到的pbmc。72小時(shí)之后，通過elisa確定細(xì)胞釋放的ifn-γ的濃度。在第三次接種后一周，從每組的五只小鼠分離并合并pbmc。數(shù)值表示為三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，sem表示為棒。

圖2.對不同器官中的ag85b的識(shí)別。用ag85b或者tb10.4刺激從用不同劑量的在ic31中配制的h4免疫的小鼠組或者鹽水對照組中分離到的pbmc(a)和脾細(xì)胞(b)72小時(shí)，之后通過elisa測量ifn-γ細(xì)胞因子的分泌情況。條棒代表三只個(gè)體小鼠的平均值。給出了sem。在(a)和(b)中，與5.0μg和15.0μg的接種劑量相比，0.5μgh4的接種劑量表現(xiàn)出顯著(p<0.05，單尾anova和tukey事后檢驗(yàn)(tukey’sposttest))更高的抗原應(yīng)答。

圖3.ag85b和tb10.4特異性的t細(xì)胞是多功能的。(a)在接種后2周，對pbmc和脾細(xì)胞進(jìn)行抗原性刺激后通過流式細(xì)胞術(shù)評估ifn-γ、tnf-α和il-2的生產(chǎn)情況。將餅形圖按照接種劑量分組，并根據(jù)細(xì)胞因子生產(chǎn)特點(diǎn)進(jìn)行色彩編碼，該餅形圖總結(jié)了對給定細(xì)胞因子生產(chǎn)特點(diǎn)陽性的cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答的級分。(b)每個(gè)可能的細(xì)胞因子組合示于柱狀圖的x軸，并且對每一免疫組給出了表達(dá)任一細(xì)胞因子組合的hyvac4(h4)特異性的cd4⁺t細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在cd8⁺t細(xì)胞亞群中沒有觀察到應(yīng)答。(c)(a)中的facs分析的點(diǎn)圖，示出來自用0.5μg或5.0μghyvac4接種的小鼠的cd4⁺脾臟細(xì)胞的il-2和ifn-γ表達(dá)情況。給出了在每個(gè)象限中的百分?jǐn)?shù)。

圖4.h4的保護(hù)效力。在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)(a和b)中，將小鼠組用三種不同劑量的在ic31中配制的h4進(jìn)行接種，并與鹽水和bcg-接種的對照相比較。全部組均在首次接種后十周用有毒力的結(jié)核分枝桿菌通過氣霧途徑(aerosolroute)攻擊。攻擊后六周，將所有小鼠處死并通過細(xì)菌計(jì)數(shù)測量肺中的細(xì)菌負(fù)荷(cfu)。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)均表示為每組六只小鼠的平均值，平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤由棒示出。在接種組中的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較通過單尾anova和tukey事后檢驗(yàn)進(jìn)行。僅示出所選組的顯著差異。＊＊＊:p<0.001，＊:p<0.05.

材料和方法

動(dòng)物

用購自丹麥ejby的taconic的8至12周齡c57bl/6xbalb/cf1雌性小鼠進(jìn)行研究。將感染動(dòng)物圈養(yǎng)在放置于bsl-3設(shè)施中層流安全罩內(nèi)的籠子中。根據(jù)丹麥司法部(danishministryofjustice)和動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)推行的條例，并遵從ec指示86/609和的usalac實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保健和使用建議來使用小鼠。

細(xì)菌

將結(jié)核分枝桿菌erdman于37℃在培養(yǎng)基或添加了0.5％丙酮酸鈉和0.5％葡萄糖的sauton培養(yǎng)基懸液中培養(yǎng)。

免疫

以2周的間隔在小鼠后背上以皮下的方式用實(shí)驗(yàn)疫苗將其免疫三次，所述實(shí)驗(yàn)疫苗含有0.5、5.0或15.0μg的ag85b-tb10.4融合蛋白(h4)/劑量，由ic31乳化，總體積為0.2ml/劑量。劑量為100nmol肽和5nmol寡核苷酸。所有的疫苗均使用如前人描述的10mmtris-hcl/270mm山梨糖醇緩沖液(ph7.9)[12]配制，以獲得每只小鼠0.2ml的最終體積。在首次亞單位接種時(shí)，一組小鼠接受了單一劑量的在尾基部皮下注射的bcgdanish1331(2.5×10⁵cfu)，一組接受鹽水注射。在首次接種后10周對所有的小鼠組進(jìn)行攻擊。

實(shí)驗(yàn)性感染

在通過氣霧途徑攻擊時(shí)，將動(dòng)物用大約50cfu的結(jié)核分枝桿菌erdman/小鼠進(jìn)行感染。在攻擊后六周將這些小鼠處死。通過用7h11培養(yǎng)基地系列三倍稀釋各個(gè)全器官勻漿物來確定脾臟或肺中的細(xì)菌數(shù)目，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。將來自bcg接種的動(dòng)物的器官用補(bǔ)充有2.0μg2-噻吩-羧酸酰肼(tch)的培養(yǎng)基培養(yǎng)以選擇性抑制測試器官中殘留bcg細(xì)菌生長。在37℃孵育2-3周后對菌落計(jì)數(shù)。將肺中的細(xì)菌負(fù)荷表示為基于六只動(dòng)物的接種組的細(xì)菌計(jì)數(shù)的log10。

淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物

如前人所述(2)獲得來自脾臟的淋巴細(xì)胞。通過密度梯度純化血液淋巴細(xì)胞(pbmc)。將從每個(gè)實(shí)驗(yàn)中五只小鼠收集到的細(xì)胞培養(yǎng)于微量滴定孔中(96-孔板；nunc,roskilde,denmark)，在體積為200μl補(bǔ)充有以下成分的rpmi1640中含有2×10⁵個(gè)細(xì)胞：5×10^-5m2-巰基乙醇、1％青霉素-鏈霉素、1mm谷氨酰胺和5％(體積/體積)胎牛血清?；谥暗膭┝?應(yīng)答研究，所使用的分枝桿菌抗原全都為15μg/ml或5μg/ml，而所使用的作為細(xì)胞活力的陽性對照的伴刀豆球蛋白a(concanavalina)的濃度為1μg/ml。所有制劑均在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行測試，并發(fā)現(xiàn)在本研究中使用的濃度下是無毒的。在孵育72小時(shí)之后從培養(yǎng)物收集上清，用于對ifn-γ進(jìn)行研究。

ifn-γ酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)

在4℃下，用pbs中的單克隆倉鼠抗小鼠ifn-γ(genzyme,cambridge,mass.)包被微量滴定板(96孔；maxisorb；nunc)。用1％(重量/體積)牛血清白蛋白-0.05％tween20封閉游離結(jié)合位點(diǎn)。對培養(yǎng)物上清進(jìn)行測試，重復(fù)三次，并用生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠單克隆抗體(clonexmg1.2；pharmingen,sandiego,ca)來檢測ifn-γ。將重組ifn-γ(pharmingen,sandiego,ca)用作標(biāo)準(zhǔn)品。

淋巴細(xì)胞的facs分析

胞內(nèi)細(xì)胞因子染色步驟:將來自小鼠的血液、脾臟或肺的細(xì)胞用2μg/mlag刺激1-2小時(shí)，隨后用10μg/ml布雷菲德菌素a(brefeldina)(sigma-aldrich,usa)在37℃孵育6小時(shí)。之后，將細(xì)胞在4℃保存過夜。第二天，用0.5μg/ml抗-cd16/cd32mab(bdpharmingen,usa)將fc受體封閉10分鐘，然后將細(xì)胞用facs緩沖液(含0.1％疊氮化鈉和1％fcs的pbs)洗滌，并使用0.2μg/ml抗-cd4(克隆:rm4-5)、抗-cd8(克隆:53-6,7)單克隆抗體對所指出的表面標(biāo)記進(jìn)行染色。然后用facs緩沖液洗滌細(xì)胞，使用cytofix/cytoperm試劑盒(bdpharmingen,denmark)根據(jù)廠商說明書透化細(xì)胞，并用0.2μg/ml抗-ifn-γ(克隆:xmg1.2)、抗-tnf-α(克隆:mp6-xt22)或抗-il-2(克隆:jes6-5h4)單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。洗滌之后，將細(xì)胞重懸于4％(重量/體積)甲醛溶液(ph7.4)(bie&berntsen,denmark)，并用六色bdfacscanto流式細(xì)胞儀(bdbiosciences,usa)通過流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將所獲得的數(shù)據(jù)通過方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。通過tukey檢驗(yàn)分析平均值之間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。<0.05的p值被認(rèn)為是顯著的。

實(shí)施例1

用ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白免疫之后誘發(fā)的免疫應(yīng)答

本發(fā)明人首先分析了在ic31中遞送的ag85b-tb10.4融合蛋白的免疫原性，并分析了在免疫之后該融合蛋白的兩個(gè)組分是否可為免疫系統(tǒng)所識(shí)別。將各組小鼠用ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白免疫。作為陰性對照，一組小鼠僅接受了佐劑(數(shù)據(jù)未給出)。為了檢查ic31中的最佳抗原劑量，本發(fā)明人使用了15.0、5.0和0.5μg的ag85b-tb10.4融合蛋白。最后一次注射后一周，對小鼠采血，并在用不同濃度的ag85b和tb10.4蛋白(5μg/ml和1μg/ml)對純化的pbmc進(jìn)行體外刺激之后對ifn-γ釋放進(jìn)行評估(圖1a)。用ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白進(jìn)行的免疫誘發(fā)了強(qiáng)的ag85b和tb10.4蛋白特異性的ifn-γ應(yīng)答。令人意外地，該應(yīng)答對抗原免疫劑量敏感。因此，在用ag85b(9401+/-3668pg/mlifn-γ)或者tb10.4(4694+/-3992pg/mlifn-γ)刺激之后，最低劑量的ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白給出了最高的ifn-γ應(yīng)答(圖1a)。相對于用0.5μgag85b-tb10.4融合蛋白接種的小鼠，使用劑量為5.0μg或15.0μg的ag85b-tb10.4融合蛋白顯著地降低了對ag85b和tb10.4蛋白兩者的ifn-γ應(yīng)答(p<0.001)。對于高免疫劑量——15μgag85b-tb10.4融合蛋白/免疫劑量，這一點(diǎn)尤為明顯，其給出的ifn-γ應(yīng)答沒有不同于在非接種小鼠中(或者在ag85b-tb10.4融合蛋白接種的并且用對照抗原cfp10在體外刺激的小鼠中)觀察到的應(yīng)答。相同的劑量依賴性隨后在一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)出現(xiàn)，在這個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中分析了血液和脾臟中的免疫應(yīng)答(圖2)。這些結(jié)果表明，在所測試的抗原劑量中，0.5μg的ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白的最低劑量誘發(fā)了最強(qiáng)的全身性應(yīng)答。

實(shí)施例2

使用ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白進(jìn)行的接種誘導(dǎo)多功能cd4⁺t細(xì)胞

接下來，本發(fā)明人分析了通過用ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白進(jìn)行免疫所誘導(dǎo)的t細(xì)胞表型。具體地，本發(fā)明人的興趣在于該疫苗誘導(dǎo)多功能(ifn-γ⁺il-2⁺tnf-α⁺)cd4⁺t細(xì)胞的能力，因?yàn)檫@些細(xì)胞已被證明與抵御感染(例如碩大利什曼原蟲)的保護(hù)性免疫性有關(guān)，并且已被證明形成了長期記憶應(yīng)答的基礎(chǔ)(6,15)。將來自ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白接種的小鼠的pbmc用ag85b或tb10.4融合蛋白在體外刺激，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析cd4、cd8、ifn-γ、tnf-α和il-2的表達(dá)情況。結(jié)果表明，用ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白進(jìn)行免疫誘導(dǎo)了兩個(gè)主要的多功能t細(xì)胞群：cd4⁺ifn-γ⁺il-2⁺tnf-α⁺和cd4⁺il-2⁺tnf-α⁺t細(xì)胞(圖3)。在ag85b和tb10.4特異性的t細(xì)胞中觀察到了這一現(xiàn)象。值得注意的是，如圖1中所觀察到的，與用5.0μg的ic31中的hyvac4融合蛋白免疫的組相比，在用0.5μg的ic31中的hyvac4免疫的組中有更高的應(yīng)答(參見圖3)，并且主要區(qū)別在于用僅0.5μg接種的組給出了顯著更多的多功能t細(xì)胞?？傊胕c31中的ag85b-tb10.4融合蛋白進(jìn)行免疫誘導(dǎo)了多功能cd4⁺t細(xì)胞，并確認(rèn)，不僅就ifn-γ表達(dá)而言，而且就多功能t細(xì)胞的數(shù)目而言，降低ag85b-tb10.4融合蛋白的量增加了疫苗的免疫原性。

實(shí)施例3

ag85b-tb10.4融合蛋白和ic31在小鼠結(jié)核分枝桿菌感染模型中的保護(hù)效力

最后，本發(fā)明人檢查了ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白的保護(hù)效力，以及關(guān)于疫苗免疫原性的劑量依賴性是否也反映在疫苗的保護(hù)效力中。以兩周的間隔用ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白將小鼠接種三次。作為保護(hù)作用的陽性對照，一組小鼠用bcg免疫一次。首次接種后十周，用有毒力的結(jié)核分枝桿菌erdman通過氣霧途徑攻擊小鼠。攻擊后六周，將小鼠處死并測定肺中的細(xì)菌數(shù)目。正如針對疫苗的免疫原性時(shí)觀察到的一樣，最低的ag85b-tb10.4融合蛋白免疫劑量引起了最高的保護(hù)。因此，用0.5μgic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白接種的小鼠其肺中含有的細(xì)菌數(shù)目為5.0+/-0.2log10cfu。這與在bcg接種小鼠中觀察到的數(shù)目(4.90+/-0.35log10cfu)相等，但是與未接種小鼠中的細(xì)菌數(shù)目(5.83+/-0.12log10cfu)相比顯著較低(p<0.001)(圖4a)。相比之下，用5.0μg或者15.0μgic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白接種的小鼠中的細(xì)菌數(shù)目與未接種小鼠的肺中存在的水平?jīng)]有顯著差異(圖4a)。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)得到了相同的結(jié)論，但是全部組中的細(xì)菌總數(shù)均略低(圖4b)。因此，就inf-γ生產(chǎn)和多功能t細(xì)胞的數(shù)目而論，疫苗——ic31中的ag85b-tb10.4融合蛋白——誘導(dǎo)抵御結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)作用的能力與疫苗的免疫原性有關(guān)，并且在使用最低的抗原劑量時(shí)最高。

來自這些清楚了解的結(jié)核分枝桿菌動(dòng)物模型的出人意料的體內(nèi)結(jié)果，支持將本發(fā)明的免疫原性組合物用作人的結(jié)核分枝桿菌疫苗。

實(shí)施例4

ag85b-tb10.4融合蛋白和ic31在臨床試驗(yàn)中的保護(hù)效力

在人臨床試驗(yàn)中，用少于約5.0μg至25.0μg的ic31中的ag85b-tb10.4接種受試者。

該低劑量的ag85b-tb10.4與在臨床試驗(yàn)中當(dāng)前使用的其他結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗形成了鮮明的對比。例如，40.0μg的as02a中的mtb72f/劑量(19)和50.0μg的ic31中的ag85b-esat-6/劑量(臨床數(shù)據(jù)尚未公布)。

以上公開內(nèi)容大致地描述了本發(fā)明。通過參照以下的具體實(shí)施例可以獲得更為完全的理解。描述這些實(shí)施例的目的僅僅是為了進(jìn)行舉例說明，而無意于限制本發(fā)明的范圍?？紤]到了形式改變和等價(jià)替換，因?yàn)檫@些情形可以想到或者是適宜的。盡管本文采用了下位概念，但是這樣的概念旨在描述而非限制。

參考文獻(xiàn)：

1.agger，e.m.，i.rosenkrands，a.w.olsen，g.hatch，a.williams，c.kritsch，k.lingnau，a.vongabain，c.s.andersen，k.s.korsholm，andp.andersen.2006.protectiveimmunitytotuberculosiswithag85b-esat-6inasyntheticcationicad-juvantsystemic31.vaccine24：5452-5460.

2.brandt，l.，m.elhay，i.rosenkrands，e.b.lindblad，andp.andersen.2000.esat-6subunitvaccinationagainstmycobacteriumtuberculosis.infectimmun68：791-795.

3.brandt，l.，j.feinocunha，a.weinreicholsen，b.chilima，p.hirsch，r.appel-berg，andp.andersen.2002.failureofthemycobacteriumbovisbcgvaccine：so-mespeciesofenvironmentalmycobacteriablockmultiplicationofbcgandinducti-onofprotectiveimmunitytotuberculosis.infectimmun70：672-678.

4.brandt，l.，y.a.skeiky，m.r.alderson，y.lobet，w.dalemans，o.c.turner，r.j.basaraba，a.a.izzo，t.m.lasco，p.l.chapman，s.g.reed，andi.m.orme.2004.theprotectiveeffectofthemycobacteriumbovisbcgvaccineisincreasedbycoadministrationwiththemycobacteriumtuberculosis72-kilodaltonfusionpolypro-teinmtb72finm.tuberculosis-infectedguineapigs.infectimmun72：6622-6632.

5.brock，i.，k.weldingh，e.m.leyten，s.m.arend，p.ravn，andp.andersen.2004.specifict-cellepitopesforimmunoassay-baseddiagnosisofmyeobacteriumtuber-culosisinfection.jclinmicrobiol42：2379-2387.

6.darrah，p.a.，d.t.patel，p.m.deluca，r.w.lindsay，d.f.davey，b.j.flynn，s.t.hoff，p.andersen，s.g.reed，s.l.morris，m.roederer，andr.a.seder.2007.multifunctionalth1ceilsdefineacorrelateofvaccine-mediatedprotectionagainstleishmaniamajor.natmed13：843-850.

7.dietrich，j.，c.andersen，r.rappuoli，t.m.doherty，c.g.jensen，andp.ander-sen.2006.mucosaladministrationofag85b-esat-6protectsagainstinfectionwithmycobacteriumtuberculosisandboostspriorbacilluscalmette-guerinimmunity.jimmunol177：6353-6360.

8.dietrich，j.，c.aagaard，r.leah，a.w.olsen，a.stryhn，t.m.doherty，andp.andersen.2005.exchangingesat6withtb10.4inanag85bfusionmolecule-basedtuberculosissubunitvaccine：efficientprotectionandesat6-basedsensitivemonitoringofvaccineefficacy.jimmunol174：6332-6339.

9.horwitz，m.a.，g.harth，b.j.dillon，ands.maslesa-galic.2000.recombinantbacilluscalmette-guerin(bcg)vaccinesexpressingthemycobacteriumtuberculosis30-kdamajorsecretoryproteininducegreaterprotectiveimmunityagainsttubercu-losisthanconventionalbcgvaccinesinahighlysusceptibleanimalmodel.procnatlacadsciusa97：13853-13858.

10.lalvani，a.，a.a.pathan，h.mcshane，r.j.wilkinson，m.latif，c.p.conlon，g.pasvol，anda.v.hill.2001.rapiddetectionofmycobacteriumtuberculosisinfec-tionbyenumerationofantigen-specifictcells.amjrespircritcaremed163：824-828.

11.lustigjv，riegerhl，kraftsc，hunterr，rothbergrm.1976，cellimmunol24(1)：164-7

12.mcshane，h.，a.a.pathan，c.r.sander，s.m.keating，s.c.gilbert，k.huygen，h.a.fletcher，anda.v.hill.2004.recombinantmodifiedvacciniavirusankaraexpressingantigen85aboostsbcg-primedandnaturallyacquiredantimycobacteri-alimmunityinhumans.natmed10：1240-1244.

13mowatam，donachieam，reidg，jarretto.1991，immunology72(3)：317-22

14.olsen，a.w.，l.a.vanpinxteren，l.m.okkels，p.b.rasmussen，andp.andersen.2001.protectionofmicewithatuberculosissubunitvaccinebasedonafusionprote-inofantigen85bandesat-6.infectionandimmunity69：2773-2778.

15.ravn，p.，a.demissie，t.eguale，h.wondwosson，d.lein，h.amoudy，a.s.mus-tafa，a.k.jensen，a.holm，i.rosenkrands，f.oftung，j.olobo，c.f.von-reyn，andp.andersen.1999.humantcellresponsestotheesat-6antigenfrommyco-bacteriumtuberculosis.j.infect.dis.179：637-645.

16.skeiky，y.a.，m.r.alderson，p.j.ovendale，j.a.guderian，l.brandt，d.c.dil-lon，a.campos-neto，y.lobet，w.dalemans，i.m.orme，ands.g.reed.2004.differentialimmuneresponsesandprotectiveefficacyinducedbycomponentsofatuberculosispolyproteinvaccine，mtb72f，deliveredasnakeddnaorrecombinantprotein.jimmunol172：7618-7628.

17.stockinger，b.，c.bourgeois，andg.kassiotis.2006.cd4+memorytcells：functi-onaldifferentiationandhomeostasis.immunolrev211：39-48.

18.weinreicholsen，a.，l.a.vanpinxteren，l.mengokkels，p.birkrasmussen，andp.andersen.2001.protectionofmicewithatuberculosissubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85bandesat-6.infectimmun69：2773-2778.

19.wu，c.y.，j.r.kirman，m.j.rotte，d.f.davey，s.p.perfetto，e.g.rhee，b.l.freidag，b.j.hill，d.c.douek，andr.a.seder.2002.distinctlineagesoft(h)lcellshavedifferentialcapacitiesformemorycellgenerationinvivo.natureimmu-nology3：852-858.

20.usfda.1995.guidanceforindustry：estimatingthemaximumsafestartingdoseininitialclinicaltrialsfortherapeuticsinadulthealthyvolunteers.u.s.departmentofhealthandhumanservices，foodanddrugadministration，centerfordrugevaluationandresearch.

21.leroux-roelsi，leroux-roelsg，ofori-anyinamoetal.safetyandimmunogenic-ityofthemtb72f/as02atuberculosisvaccineinppd-negativebelgianadults.medicalandhealthinthetrotpics.marseille.france.11-15sept2005(ahstracto-036)

序列表

<110>國家血清研究中心

<120>包含tb10.4的疫苗

<130>15030pc

<160>4

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>338

<212>prt

<213>結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>1

metglnleuvalaspargvalargglyalavalthrglymetserarg

151015

argleuvalvalglyalavalglyalaalaleuvalserglyleuval

202530

glyalavalglyglythralathralaglyalapheserargprogly

354045

leuprovalglutyrleuglnvalproserprosermetglyargasp

505560

ilelysvalglnpheglnserglyglyalaasnserproalaleutyr

65707580

leuleuaspglyleuargalaglnaspasppheserglytrpaspile

859095

asnthrproalapheglutrptyraspglnserglyleuservalval

100105110

metprovalglyglyglnserserphetyrserasptrptyrglnpro

115120125

alacysglylysalaglycysglnthrtyrlystrpgluthrpheleu

130135140

thrsergluleuproglytrpleuglnalaasnarghisvallyspro

145150155160

thrglyseralavalvalglyleusermetalaalaserseralaleu

165170175

thrleualailetyrhisproglnglnphevaltyralaglyalamet

180185190

serglyleuleuaspproserglnalametglyprothrleuilegly

195200205

leualametglyaspalaglyglytyrlysalaseraspmettrpgly

210215220

prolysgluaspproalatrpglnargasnaspproleuleuasnval

225230235240

glylysleuilealaasnasnthrargvaltrpvaltyrcysglyasn

245250255

glylysproseraspleuglyglyasnasnleuproalalyspheleu

260265270

gluglyphevalargthrserasnilelyspheglnaspalatyrasn

275280285

alaglyglyglyhisasnglyvalpheasppheproaspserglythr

290295300

hissertrpglutyrtrpglyalaglnleuasnalametlysproasp

305310315320

leuglnargalaleuglyalathrproasnthrglyproalaprogln

325330335

glyala

<210>2

<211>325

<212>prt

<213>結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>2

metthraspvalserarglysileargalatrpglyargargleumet

151015

ileglythralaalaalavalvalleuproglyleuvalglyleuala

202530

glyglyalaalathralaglyalapheserargproglyleuproval

354045

glutyrleuglnvalproserprosermetglyargaspilelysval

505560

glnpheglnserglyglyasnasnserproalavaltyrleuleuasp

65707580

glyleuargalaglnaspasptyrasnglytrpaspileasnthrpro

859095

alapheglutrptyrtyrglnserglyleuserilevalmetproval

100105110

glyglyglnserserphetyrserasptrptyrserproalacysgly

115120125

lysalaglycysglnthrtyrlystrpgluthrpheleuthrserglu

130135140

leuproglntrpleuseralaasnargalavallysprothrglyser

145150155160

alaalaileglyleusermetalaglyserseralametileleuala

165170175

alatyrhisproglnglnpheiletyralaglyserleuseralaleu

180185190

leuaspproserglnglymetglyproserleuileglyleualamet

195200205

glyaspalaglyglytyrlysalaalaaspmettrpglyproserser

210215220

aspproalatrpgluargasnaspprothrglnglnileprolysleu

225230235240

valalaasnasnthrargleutrpvaltyrcysglyasnglythrpro

245250255

asngluleuglyglyalaasnileproalaglupheleugluasnphe

260265270

valargserserasnleulyspheglnaspalatyrasnalaalagly

275280285

glyhisasnalavalpheasnpheproproasnglythrhissertrp

290295300

glutyrtrpglyalaglnleuasnalametlysglyaspleuglnser

305310315320

serleuglyalagly

325

<210>3

<211>340

<212>prt

<213>結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>3

metthrphephegluglnvalargargleuargseralaalathrthr

151015

leuproargargleualailealaalametglyalavalleuvaltyr

202530

glyleuvalglythrpheglyglyproalathralaglyalapheser

354045

argproglyleuprovalglutyrleuglnvalproseralasermet

505560

glyargaspilelysvalglnpheglnglyglyglyprohisalaval

65707580

tyrleuleuaspglyleuargalaglnaspasptyrasnglytrpasp

859095

ileasnthrproalaphegluglutyrtyrglnserglyleuserval

100105110

ilemetprovalglyglyglnserserphetyrthrasptrptyrgln

115120125

proserglnserasnglyglnasntyrthrtyrlystrpgluthrphe

130135140

leuthrargglumetproalatrpleuglnalaasnlysglyvalser

145150155160

prothrglyasnalaalavalglyleusermetserglyglyserala

165170175

leuileleualaalatyrtyrproglnglnpheprotyralaalaser

180185190

leuserglypheleuasnprosergluglytrptrpprothrleuile

195200205

glyleualametasnaspserglyglytyrasnalaasnsermettrp

210215220

glyproserseraspproalatrplysargasnaspprometvalgln

225230235240

ileproargleuvalalaasnasnthrargiletrpvaltyrcysgly

245250255

asnglythrproseraspleuglyglyaspasnileproalalysphe

260265270

leugluglyleuthrleuargthrasnglnthrpheargaspthrtyr

275280285

alaalaaspglyglyargasnglyvalpheasnpheproproasngly

290295300

thrhissertrpprotyrtrpasngluglnleuvalalametlysala

305310315320

aspileglnhisvalleuasnglyalathrproproalaalaproala

325330335

alaproalaala

340

<210>4

<211>96

<212>prt

<213>結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>4

metserglnilemettyrasntyrproalametleuglyhisalagly

151015

aspmetalaglytyralaglythrleuglnserleuglyalagluile

202530

alavalgluglnalaalaleuglnseralatrpglnglyaspthrgly

354045

ilethrtyrglnalatrpglnalaglntrpasnglnalametgluasp

505560

leuvalargalatyrhisalametserserthrhisglualaasnthr

65707580

metalametmetalaargaspthralaglualaalalystrpglygly

859095