本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)用材料的制備，特別是一種細(xì)菌纖維素/肝素醫(yī)用復(fù)合材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌纖維素（Bacterial Cellulose，簡稱BC），是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的天然高聚物，和植物纖維具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。細(xì)菌纖維素具有許多獨(dú)特的性質(zhì)，如高機(jī)械強(qiáng)度、高結(jié)晶度、高持水性、超細(xì)納米纖維網(wǎng)絡(luò)等，已被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域。另外，良好的生物相容性和生物可降解性，使得BC在相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)方面的應(yīng)用得到人們的廣泛關(guān)注。細(xì)菌纖維素在生物醫(yī)用材料中可作為人工皮膚、人工血管、組織工程支架等，并且有著良好的應(yīng)用前景。細(xì)菌纖維素雖有很多的生物學(xué)特性，但將其具體應(yīng)用于醫(yī)用材料時(shí)，仍需要對其進(jìn)行一些表面改性，以使其有更好的血液相容性和組織相容性。
肝素（Heparin，簡稱Hep）在臨床上作為藥物使用已有60多年歷史，常作為抗凝血、抗血栓的重要方法，推動醫(yī)學(xué)事業(yè)的進(jìn)步。Hep被公認(rèn)為最有效、使用最廣泛的抗凝血藥物之一。肝素分子中含有大量的活性基團(tuán)，如-SO3-、-COO-等負(fù)離子和-OH、-NH-、-COOH等基團(tuán)，大量的負(fù)離子使得肝素分子呈現(xiàn)弱酸性，因此，肝素進(jìn)入生物體后，生物體內(nèi)細(xì)胞表面和血管壁的負(fù)電荷增加，抗聚集作用增強(qiáng)，能促進(jìn)血液流動，預(yù)防血栓的形成。Hep能增加抗凝血酶（AT-III）的活性，從而抑制凝血酶和凝血因子，達(dá)到抗凝血的效果。因此，在材料表面固定肝素，能極大的提高材料的抗凝血性能。
固定肝素的方法可以歸結(jié)為物理法和化學(xué)法兩大類。物理法即將肝素涂覆在材料表面使其具有抗凝血性，雖然方法簡單，但肝素極易脫落，不利于材料具有長期的抗凝血性能。和表面涂覆法相比，化學(xué)法將肝素通過共價(jià)鍵固定到材料上，肝素的穩(wěn)定性好，與材料結(jié)合更加牢固。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了提供一種制備細(xì)菌纖維素/肝素復(fù)合材料的方法，將肝素大量、牢固的固定到細(xì)菌纖維素上。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種醫(yī)用復(fù)合材料，包括細(xì)菌纖維素膜、肝素、硅烷偶聯(lián)劑KH550、交聯(lián)劑EDC和NHS。
本發(fā)明提供的細(xì)菌纖維素/肝素復(fù)合材料制備方法包括如下步驟：
步驟一：配制木醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為7.0wt%葡萄糖、1.5wt%酵母浸膏、1.0%(v/v)無水乙醇，pH=6.8。121℃高溫滅菌20min，接種后，30℃恒溫培養(yǎng)10天，得到細(xì)菌纖維素濕膜，
步驟二：用0.1M NaOH溶液處理細(xì)菌纖維素濕膜，再用去離子水清洗多次至纖維素表面呈中性，
步驟三：將提純處理后的細(xì)菌纖維素濕膜在1wt%的KH550溶液中浸泡10min。再將細(xì)菌纖維素濕膜放入肝素溶液中，加入交聯(lián)劑EDC和NHS，室溫下磁力攪拌1h，轉(zhuǎn)速為500rpm。用0.1M Na2HPO4溶液清洗2次終止反應(yīng)，每1h換液。再用1.0M NaCl溶液清洗4次，每6h換液，最后用大量去離子水沖洗，80℃烘干，得到細(xì)菌纖維素/肝素醫(yī)用復(fù)合干膜。
所述步驟二的0.1M NaOH溶液處理方法為煮沸30min。
所述步驟三中加入的交聯(lián)劑EDC和NHS的摩爾比為1:0.6，肝素溶液的質(zhì)量濃度為0.1%~1.5%。
與現(xiàn)存技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：
(1) 和在培養(yǎng)基中加入肝素制備細(xì)菌纖維素/肝素復(fù)合膜相比，本發(fā)明方法更加簡單方便，
(2) 和不加交聯(lián)劑浸泡法制備的細(xì)菌纖維素/肝素復(fù)合材料相比，化學(xué)交聯(lián)法使得細(xì)菌纖維素/肝素復(fù)合材料中肝素含量更多，肝素結(jié)合的更加牢固，有利于材料具有長期的抗凝血效果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，但保護(hù)范圍并不受此限制。
實(shí)施例1
(1) 稱取7.0g葡萄糖和1.5g酵母浸膏放入燒杯中，加入100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加?.0mL無水乙醇，調(diào)節(jié)溶液pH至6.8。裝入三角燒瓶中，封口后在121℃高溫滅菌20min，接種后，30℃恒溫培養(yǎng)10天，得到細(xì)菌纖維素濕膜。將濕膜放入0.1M NaOH溶液中，加熱煮沸30min后，用大量去離子水沖洗至纖維表面呈中性，
(2) 將提純處理好的細(xì)菌纖維素濕膜放入1.0wt%的KH550溶液中浸泡10min，
(3) 稱取0.1g肝素放入燒杯中，量取100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蟮玫礁嗡厝芤?，在肝素溶液中加入交?lián)劑EDC和NHS(摩爾比為1:0.6)。將浸泡過KH550溶液的細(xì)菌纖維素膜放入肝素溶液中，室溫下磁力攪拌1h，轉(zhuǎn)速為500rpm。用0.1M Na2HPO4溶液清洗2次終止反應(yīng)，每1h換液。再用1.0M NaCl溶液清洗4次，每6h換液，最后用大量去離子水沖洗，80℃烘干，得到細(xì)菌纖維素/肝素醫(yī)用復(fù)合干膜。
實(shí)施例2
(1) 稱取7.0g葡萄糖和1.5g酵母浸膏放入燒杯中，加入100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加?.0mL無水乙醇，調(diào)節(jié)溶液pH至6.8。裝入三角燒瓶中，封口后在121℃高溫滅菌20min，接種后，30℃恒溫培養(yǎng)10天，得到細(xì)菌纖維素濕膜。將濕膜放入0.1M NaOH溶液中，加熱煮沸30min后，用大量去離子水沖洗至纖維表面呈中性，
(2) 將提純處理好的細(xì)菌纖維素濕膜放入1.0wt%的KH550溶液中浸泡10min，
(3) 稱取0.5g肝素放入燒杯中，量取100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蟮玫礁嗡厝芤?，在肝素溶液中加入交?lián)劑EDC和NHS(摩爾比為1:0.6)。將浸泡過KH550溶液的細(xì)菌纖維素膜放入肝素溶液中，室溫下磁力攪拌1h，轉(zhuǎn)速為500rpm。用0.1M Na2HPO4溶液清洗2次終止反應(yīng)，每1h換液。再用1.0M NaCl溶液清洗4次，每6h換液，最后用大量去離子水沖洗，80℃烘干，得到細(xì)菌纖維素/肝素醫(yī)用復(fù)合干膜。
實(shí)施例3
(1) 稱取7.0g葡萄糖和1.5g酵母浸膏放入燒杯中，加入100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加?.0mL無水乙醇，調(diào)節(jié)溶液pH至6.8。裝入三角燒瓶中，封口后在121℃高溫滅菌20min，接種后，30℃恒溫培養(yǎng)10天，得到細(xì)菌纖維素濕膜。將濕膜放入0.1M NaOH溶液中，加熱煮沸30min后，用大量去離子水沖洗至纖維表面呈中性，
(2) 將提純處理好的細(xì)菌纖維素濕膜放入1.0wt%的KH550溶液中浸泡10min，
(3) 稱取1.0g肝素放入燒杯中，量取100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蟮玫礁嗡厝芤?，在肝素溶液中加入交?lián)劑EDC和NHS(摩爾比為1:0.6)。將浸泡過KH550溶液的細(xì)菌纖維素膜放入肝素溶液中，室溫下磁力攪拌1h，轉(zhuǎn)速為500rpm。用0.1M Na2HPO4溶液清洗2次終止反應(yīng)，每1h換液。再用1.0M NaCl溶液清洗4次，每6h換液，最后用大量去離子水沖洗，80℃烘干，得到細(xì)菌纖維素/肝素醫(yī)用復(fù)合干膜。
實(shí)施例4
(1) 稱取7.0g葡萄糖和1.5g酵母浸膏放入燒杯中，加入100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加?.0mL無水乙醇，調(diào)節(jié)溶液pH至6.8。裝入三角燒瓶中，封口后在121℃高溫滅菌20min，接種后，30℃恒溫培養(yǎng)10天，得到細(xì)菌纖維素濕膜。將濕膜放入0.1M NaOH溶液中，加熱煮沸30min后，用大量去離子水沖洗至纖維表面呈中性，
(2) 將提純處理好的細(xì)菌纖維素濕膜放入1.0wt%的KH550溶液中浸泡10min，
(3) 稱取1.5g肝素放入燒杯中，量取100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蟮玫礁嗡厝芤?，在肝素溶液中加入交?lián)劑EDC和NHS(摩爾比為1:0.6)。將浸泡過KH550溶液的細(xì)菌纖維素膜放入肝素溶液中，室溫下磁力攪拌1h，轉(zhuǎn)速為500rpm。用0.1M Na2HPO4溶液清洗2次終止反應(yīng)，每1h換液。再用1.0M NaCl溶液清洗4次，每6h換液，最后用大量去離子水沖洗，80℃烘干，得到細(xì)菌纖維素/肝素醫(yī)用復(fù)合干膜。
實(shí)施例5
(1) 稱取7.0g葡萄糖和1.5g酵母浸膏放入燒杯中，加入100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加?.0mL無水乙醇，調(diào)節(jié)溶液pH至6.8。裝入三角燒瓶中，封口后在121℃高溫滅菌20min，接種后，30℃恒溫培養(yǎng)10天，得到細(xì)菌纖維素濕膜。將濕膜放入0.1M NaOH溶液中，加熱煮沸30min后，用大量去離子水沖洗至纖維表面呈中性，
(2) 稱取1.5g肝素放入燒杯中，量取100.0mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蟮玫礁嗡厝芤?，將提純處理好的?xì)菌纖維素濕膜浸泡在肝素溶液中，室溫下磁力攪拌1h，轉(zhuǎn)速為500rpm，用大量去離子水沖洗后，80℃烘干，得到細(xì)菌纖維素/肝素醫(yī)用復(fù)合干膜，
經(jīng)機(jī)械性能測試，細(xì)菌纖維素/肝素復(fù)合膜具有較佳的力學(xué)性能，其拉伸強(qiáng)度可達(dá)183.03MPa，和純細(xì)菌纖維素膜（100.87MPa）相比，提高了81.45%。加入交聯(lián)劑改性得到的細(xì)菌纖維素/肝素復(fù)合膜中肝素含量可達(dá)到315.17μg/cm2，和不加交聯(lián)劑的復(fù)合膜（281.75μg/cm2）相比，提高了11.86%。浸泡在pH為7.4的PBS緩沖溶液中120h后，復(fù)合材料中殘留的肝素含量為66.33μg/cm2，是不加交聯(lián)劑的復(fù)合膜的3.6倍。