本申請(qǐng)是2013年04月16日遞交的申請(qǐng)?zhí)枮?01380019880.0，發(fā)明名稱為“用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的介孔二氧化硅組合物”的分案申請(qǐng)。

政府支持

本申請(qǐng)具有政府支持，由國(guó)家健康研究院授權(quán)的第r01de019917號(hào)權(quán)利支持。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。

本發(fā)明涉及生物相容性可注射性組合物。

背景技術(shù)：

需要體外操作的疫苗，例如大多數(shù)基于細(xì)胞的治療，會(huì)導(dǎo)致不理想的淋巴結(jié)定位以及有限的效力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為現(xiàn)有方法中相關(guān)的一些問(wèn)題和缺陷提供了一種解決方案。因此，本發(fā)明的特點(diǎn)在于一種組合物，所述組合物包括介孔二氧化硅(mps)棒，所述介孔二氧化硅(mps)棒包括一種免疫細(xì)胞募集化合物和一種免疫細(xì)胞活化化合物。所述棒包括直徑在2-50納米之間的孔，例如，直徑在5-25納米之間的孔或者直徑在5-10納米之間的孔。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述棒包括直徑大約為8納米的孔。微棒的長(zhǎng)度在5微米到500微米之間。在一個(gè)實(shí)施例中，所述棒的長(zhǎng)度為5-25微米，例如，10-20微米。在其他實(shí)施例中，所述棒的長(zhǎng)度為50微米-250微米。使用介孔二氧化硅(mps)微顆粒組合物可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的穩(wěn)固的募集，所述介孔二氧化硅(mps)微顆粒組合物的特點(diǎn)在于具有較高的寬高比，例如，所述棒的長(zhǎng)度為80微米到120微米。

示例性的免疫細(xì)胞募集化合物包括粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子(gm-csf)。其他募集化合物的實(shí)施例包括趨化因子，例如，選自由趨化因子(c-c基序)配位體21(ccl-21,基因銀行編目號(hào):(aa)cag29322.1(01:47496599),(na)ef064765.1(01:117606581),通過(guò)引證在此并入本文)，趨化因子(c-c基序)配位體19(ccl-19,基因銀行編目號(hào):(aa)cag33149.1(01:48145853),(na)nm_006274.2(01:22165424),通過(guò)引證在此并入本文)，以及fms-樣酪氨酸激酶3配位體(flt3)配位體；基因銀行編目號(hào):(aa)aai44040(01:219519004),(na)nm_004119(01:01:121114303)通過(guò)引證在此并入本文)所組成的組中。

免疫細(xì)胞活化化合物包括toll樣受體激動(dòng)劑。這種激動(dòng)劑包括病原相關(guān)分子模型(pamp)，例如，一種感染-模擬組合物，例如，細(xì)菌衍生的免疫調(diào)節(jié)劑(也叫做危險(xiǎn)信號(hào))。toll樣受體(tlr)激動(dòng)劑包括核酸或者脂類組合物(例如，單磷酸脂a(mpla))。在一個(gè)實(shí)施例中，toll樣受體(tlr)激動(dòng)劑包括tlr9激動(dòng)劑，例如，一種胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)、一種聚(氮丙啶)(pei)-濃縮的低聚核苷酸(odn)(例如，聚(氮丙啶)(pei)-胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn))、或者雙鏈脫氧核糖核酸(dna)。例如，所述裝置包括5微克、10微克、25微克、50微克、100微克、250微克或者500微克的胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)。在另一個(gè)實(shí)施例中，toll樣受體(tlr)激動(dòng)劑包括tlr3激動(dòng)劑，例如，聚肌苷-聚胞苷酸(聚i:c)、一種聚(氮丙啶)(pei)-聚(i:c)、聚腺尿苷酸(聚(a:u))、聚(氮丙啶)(pei)-聚(a:u)、或者雙鏈核糖核酸(rna)。

脂多糖(lps)同樣可以用于實(shí)現(xiàn)此目的。

為了產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所述組合物包括此免疫反應(yīng)所需要的抗原。例如，所述組合物包括腫瘤抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原包括一種腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物(例如，從被治療的主體中收集的腫瘤活組織切片樣品中提取的)。所述主體優(yōu)選是人類患者，但是所述組合物/系統(tǒng)還可以用于獸醫(yī)用途，例如，用于治療功能性動(dòng)物，比如狗、貓以及性能動(dòng)物，例如，馬和家畜，比方說(shuō)家牛、公牛、羊、山羊，等。

抗原遞呈細(xì)胞，比如樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)，通過(guò)介孔二氧化硅(mps)裝置，那就是說(shuō)，細(xì)胞不是永久居住在裝置中。向裝置中募集免疫細(xì)胞，并且使其短時(shí)間內(nèi)居住在裝置中，當(dāng)他們遇到抗原時(shí)被活化。然后免疫細(xì)胞(比如樹(shù)突狀細(xì)胞(dc))定位向淋巴結(jié)。他們聚集在淋巴結(jié)處，例如，一種引流淋巴結(jié)，而不是在介孔二氧化硅(mps)裝置中。在淋巴結(jié)處聚集的細(xì)胞進(jìn)一步增加了對(duì)疫苗抗原的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更有力的針對(duì)該抗原的細(xì)胞反應(yīng)和體液反應(yīng)。

因此，一種誘導(dǎo)對(duì)疫苗產(chǎn)生全身性抗原特異性免疫反應(yīng)的方法包括對(duì)主體施用如上所述的介孔二氧化硅(mps)組合物。所述組合物被裝入注射器并注入受試者的身體中。例如，少量(例如，50-500微升，例如，150微升)進(jìn)行皮下注射。一般地，在施用后第2天，使用細(xì)胞滲透所述裝置(介孔二氧化硅(mps)組合物)，并在施用后第5-7天，引流淋巴結(jié)中充滿從裝置中遷移出來(lái)的細(xì)胞和遷移到淋巴結(jié)組織中的細(xì)胞，這些細(xì)胞在此聚集并進(jìn)一步的傳播抗原-特異性反應(yīng)。因此，所述組合物可以有效用于誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向淋巴結(jié)的定位。在接種疫苗治療劑之后，不比去除所述介孔二氧化硅(mps)組合物。這些組合物可以在施用位點(diǎn)處保存，并在此降解。例如，通過(guò)巨噬細(xì)胞隨著時(shí)間來(lái)消耗介孔二氧化硅(mps)顆粒，并直至從身體內(nèi)清除。

制備疫苗的方法包括，提供一種介孔二氧化硅棒懸浮液，將所述棒與疫苗抗原、免疫細(xì)胞募集化合物和免疫細(xì)胞活化化合物相接觸。所述疫苗抗原一種腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物，所述募集化合物包括粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)，并且所述活化化合物包括胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)。有時(shí)候，在將所述棒與一個(gè)或一個(gè)以上下列化合物相接觸之前用羥基乙酸或者乳酸修飾所述棒：疫苗抗原、募集化合物或者活化化合物。選擇性的，所述介孔二氧化硅(mps)組合物/裝置是使用介孔二氧化硅(mps)棒、一種免疫細(xì)胞募集化合物和一種免疫細(xì)胞活化化合物(選擇性地，與羥基乙酸或者乳酸修飾)來(lái)制備的，被儲(chǔ)存和/或運(yùn)往應(yīng)用位點(diǎn)，因此，在施用前，向棒懸浮液中加入病人特異性腫瘤抗原制劑或者溶解產(chǎn)物，例如，在對(duì)病人施用前1、2、6、12、24或者48小時(shí)之前加入。

所述裝入介孔二氧化硅(mps)組合物中的化合物是被加工或者純化的。例如、多聚核苷酸、多肽或者其他試劑，可以被純化和/或分離。具體地說(shuō)，如這里所使用的，“分離的”或者“純化的"核苷酸分子、多聚核苷酸、多肽或者蛋白質(zhì)是指在通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含有其他細(xì)胞物質(zhì)或者培養(yǎng)基的物質(zhì)，或者是指通過(guò)化學(xué)合成的化學(xué)前體物或者其他化學(xué)試劑。純化后的化合物按重量計(jì)算(干重)占所關(guān)心化合物的至少60％。優(yōu)選的，所述制劑按重量計(jì)算占所關(guān)心化合物的至少75％，更優(yōu)選的占至少90％，并且最優(yōu)選的占至少99％。例如，純化后的化合物按重量計(jì)算占理想化合物的至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，98％，99％，或者100％(重量/重量)。可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)量純度，例如，通過(guò)柱形色譜法、薄層色層分析法、或者高效液相色譜(hplc)進(jìn)行分析。純化后的或者分離的多聚核苷酸(核糖核酸(rna)或者脫氧核糖核酸(dna))不含有那些在其天然存在形式中存在的側(cè)鏈基因或者序列。純化的也用于定義一種滅菌程度，這種滅菌程度可以安全的對(duì)人類主體給藥，例如，不具有傳染性或者毒劑。就腫瘤抗原而言，所述抗原可以被純化或者處理成一種腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物。

同樣，“基本上純的”是指從其天然伴隨的成分中分離出來(lái)的核苷酸或者多肽。通常，當(dāng)核苷酸和多肽按重量計(jì)算不含有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或者甚至至少99％的蛋白質(zhì)和其天然伴隨存在的有機(jī)分子時(shí)，這種核苷酸和多肽是基本上純的。

小分子是質(zhì)量小于2000道爾頓的化合物。優(yōu)選的，所述小分子的分子質(zhì)量小于1000道爾頓，更優(yōu)選的，小于600道爾頓，例如，所述化合物的分子質(zhì)量小于500道爾頓、400道爾頓、300道爾頓、200道爾頓或者100道爾頓。

過(guò)渡術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”與“包含(including)”、“含有(containing)”或者“具有...的特征”是同義詞，都屬于包括性的或者開(kāi)放式定義，不排除其他未列出的成分或者方法步驟。相反，術(shù)語(yǔ)“由。。。組成”不包括任何在權(quán)利要求中沒(méi)有特別指出的成分、步驟或者組分。術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成"將權(quán)利要求的范圍限制在指定的材料或者步驟，“以及那些本質(zhì)上不影響要求保護(hù)的發(fā)明的本質(zhì)和新穎特性的材料或者步驟"。

從下面關(guān)于本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的表述中，以及從權(quán)利要求書(shū)中，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)將變得顯而易見(jiàn)。除非另有定義，這里使用的所有科技用語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常的理解具有相同的含義。雖然與這里描述的方法和材料相似的任何方法和材料都可以被用于實(shí)施或者檢測(cè)本發(fā)明，但是下面描述的是適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。這里應(yīng)用的所有公開(kāi)的外國(guó)專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引證全部并入本文。genbank和ncbi指明的登記號(hào)碼也通過(guò)引證在此全部并入本文。這里引用的其他出版的參考文獻(xiàn)、文件、原稿和科學(xué)文獻(xiàn)通過(guò)引證在此全部并入本文。如果出現(xiàn)矛盾，以本發(fā)明說(shuō)明書(shū)包括定義為準(zhǔn)。此外，這里所述的材料、方法和實(shí)施例只起到說(shuō)明作用，并不作為限制。

附圖說(shuō)明

圖1是介孔二氧化硅(mps)棒的電鏡照片。這些棒的隨機(jī)堆疊和自組裝可產(chǎn)生能夠進(jìn)行細(xì)胞過(guò)濾的3d空間。

圖2是一種棒狀圖，顯示了具有不同長(zhǎng)度的介孔二氧化硅(mps)棒的表面標(biāo)記物表達(dá)作用。將100微克具有不同長(zhǎng)度的介孔二氧化硅(mps)棒與骨髓衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞一起培養(yǎng)18小時(shí)。作為發(fā)炎作用的標(biāo)記物，通過(guò)用細(xì)胞表面受體cdllc(樹(shù)突狀細(xì)胞標(biāo)記物)、mhcii(抗原呈遞標(biāo)記物)和cd86(共刺激受體)染色來(lái)確定被活化的細(xì)胞的百分比。隨著長(zhǎng)度的增加，所述棒的炎癥性質(zhì)也增加。由于理想的腳手架顯示炎癥性質(zhì)(與plg腳手架參照相似)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中使用長(zhǎng)度為30微米到100微米或120微米之間的棒。

圖3是一系列圖，顯示了介孔二氧化硅(mps)棒在小鼠中的作用。圖3a是一種圖，顯示了在用5毫克羅丹明標(biāo)記的介孔二氧化硅(mps)棒對(duì)c57bl/6j小鼠進(jìn)行皮下注射5天后切除的腳手架注射位點(diǎn)。皮下小囊顯示所述棒被定位并且自組裝產(chǎn)生3d微環(huán)境。圖3b是切除的腳手架位點(diǎn)的電鏡照片，顯示了過(guò)濾進(jìn)入腳手架位點(diǎn)的細(xì)胞。圖3c顯示了從介孔二氧化硅(mps)腳手架上分離的細(xì)胞的活/死成像，說(shuō)明活細(xì)胞被募集。

圖4a是線狀圖，顯示了粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子(gm-csf)從介孔二氧化硅(mps)棒中的釋放。1微克粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子(gm-csf)被裝載入介孔二氧化硅(mps)棒中，與0.1bsa/pbs一起培養(yǎng)。定時(shí)收集上清液，然后使用elisa(r&d公司)測(cè)定粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子(gm-csf)。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子(gm-csf)從介孔二氧化硅(mps)棒中連續(xù)釋放。圖4b是棒狀圖，顯示了在體外骨髓衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞(bmdc)中與介孔二氧化硅(mps)共培養(yǎng)的表面標(biāo)記物表達(dá)。100微克的未修飾的、氨基-、硫醇-、氯-、和膦酸修飾的介孔二氧化硅(mps)棒與10⁶/毫升骨髓衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞(bmdc)一起培養(yǎng)18小時(shí)。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，確定mhcii類和共刺激性分子cd86的表達(dá)。介孔二氧化硅(mps)刺激骨髓衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞(bmdc)中mhcii和cd86的增加的表達(dá)作用表示介孔二氧化硅(mps)棒是炎癥性的，并且這一性質(zhì)可以被表面修飾的介孔二氧化硅(mps)棒所調(diào)節(jié)。

圖5a是棒狀圖，顯示了通過(guò)裝載粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的介孔二氧化硅(mps)棒募集的樹(shù)突狀細(xì)胞。皮下注射5毫克/小鼠裝載有或者不裝載有1微克/小鼠粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的介孔二氧化硅(mps)棒。從腳手架位點(diǎn)捕獲細(xì)胞并進(jìn)行cd1lc受體(樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)標(biāo)記物)染色。裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠比空白介孔二氧化硅(mps)腳手架募集更多的樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)。圖5b是一種棒狀圖，描述了樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)的表面標(biāo)記物表達(dá)。裝載粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)和胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)的介孔二氧化硅(mps)腳手架比不裝載胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)的腳手架活化更多的樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)。

圖6a-b是棒狀圖，顯示了腳手架位點(diǎn)處的(圖6a)b220+細(xì)胞百分比，或者(圖6b)b220+細(xì)胞總數(shù)。皮下注射5毫克/小鼠裝載有或者不裝載有1微克/小鼠粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、100微克胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和130微克卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)棒。從腳手架位點(diǎn)定時(shí)捕獲細(xì)胞并進(jìn)行b220受體(b細(xì)胞標(biāo)記物)染色。在第3天，裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠募集更多的b細(xì)胞。

圖7a-c是流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖(圖7a)和棒狀圖(圖7b-c)，描述了樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)表面上存在mhc-i-siinfekl(seqidno:l)標(biāo)記物。裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導(dǎo)抗原特異性樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)擴(kuò)散，定位到引流淋巴結(jié)(dln)。用樹(shù)突狀標(biāo)記物cd1lc和標(biāo)記物標(biāo)記物mhc-i-siinfekl對(duì)dln細(xì)胞進(jìn)行染色顯示，在mhc-i復(fù)合物中，一部分卵清蛋白(肽序列siinfekl)存在于細(xì)胞表面上。

圖8a-b是棒狀圖，顯示由于介孔二氧化硅(mps)腳手架形成的次級(jí)淋巴小結(jié)。在裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導(dǎo)次級(jí)淋巴小結(jié)，定位活化的抗原初始化b細(xì)胞。用b220(b細(xì)胞標(biāo)記物)和gl7次級(jí)淋巴小結(jié)標(biāo)記物)對(duì)dln進(jìn)行染色，研究次級(jí)淋巴小結(jié)的形成，所述次級(jí)淋巴小結(jié)中存在特有的b細(xì)胞，這種特有的b細(xì)胞被活化并且包括在身體過(guò)成熟和同型體轉(zhuǎn)換過(guò)程中。

圖9a-b是一種棒狀圖，描述了裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導(dǎo)cd8+細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctls)的擴(kuò)散，所述cd8+細(xì)胞毒性t細(xì)胞可以特異性識(shí)別模型抗原。用cd8(殺傷t細(xì)胞標(biāo)記物)和mhci-四聚體-siinfekl抗體對(duì)脾細(xì)胞染色，顯示t細(xì)胞是否能夠識(shí)別mhci復(fù)合物上呈遞的特異性抗原。

圖10a-c是直方圖，顯示了裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導(dǎo)抗原特異性cd8+ctls在dln和脾中的克隆擴(kuò)散。從ot-i小鼠中注射的脾細(xì)胞被追蹤染料cfse染色，追蹤染料cfse的熒光性隨著細(xì)胞每次分裂減半。完全裝載的疫苗組中脾和dln中cfse染色的脾細(xì)胞的熒光下降顯示ova-特異性ctl增殖。

圖11a-c是直方圖，顯示了裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導(dǎo)抗原特異性cd4+ths在dln和脾中的克隆擴(kuò)散。從ot-ii小鼠中注射的脾細(xì)胞被追蹤染料cfse染色，追蹤染料cfse的熒光性隨著細(xì)胞每次分裂減半。完全裝載的疫苗組中和只裝載抗原的介孔二氧化硅(mps)組的脾和dln中cfse染色的脾細(xì)胞的熒光下降顯示ova-特異性cd4+th細(xì)胞增殖。

圖12a-b是直方圖，顯示了抗原滴定度被定義為抗體-血清溶液被稀釋并仍然保持可檢測(cè)的抗體數(shù)量的程度。所述抗卵清蛋白血清抗體被滴定。裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠引發(fā)有力的和長(zhǎng)時(shí)間的th1和th2抗體反應(yīng)。單獨(dú)裝載有卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)可以引發(fā)有效的th2反應(yīng)，顯示了介孔二氧化硅(mps)材料本身的輔助潛力。

圖13a-b是線性圖，顯示了粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)以一種控制并持續(xù)的方式從介孔二氧化硅(mps)微粒中釋放。a)1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)被裝載入5毫克介孔二氧化硅(mps)棒中并在0.1bsa/pbs中培養(yǎng)。定時(shí)收集上清液并使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(r&d公司)測(cè)定粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)。雖然劑量較小，但是粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)連續(xù)地從介孔二氧化硅(mps)棒中釋放。b)1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)被裝載入5毫克的含有ova和cpg的介孔二氧化硅(mps)中。然后皮下注射入c57bl/6j小鼠中。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收獲包圍注射的顆粒腳手架的組織并分析粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)水平。粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的水平維持一周。

圖14a-b是照片，和圖14c是棒狀圖。具有更高寬高比的介孔二氧化硅(mps)微粒能夠募集更多的細(xì)胞。圖14a顯示了長(zhǎng)度或者在10微米和20微米之間、或者在80微米和120微米的介孔二氧化硅(mps)微粒的掃描電鏡圖像。較長(zhǎng)的棒使組合物具有更大面積或者更大的棒間空間。圖14b顯示了從小鼠中捕獲的介孔二氧化硅(mps)組合物。將5微克介孔二氧化硅(mps)微粒皮下注射入小鼠中，在注射后第7天收獲腳手架位點(diǎn)。圖14c是一種棒狀圖，列舉了從腳手架中分離的細(xì)胞。具有更高寬高比的介孔二氧化硅(mps)微粒能夠募集更多的細(xì)胞。

圖15a-b是條形圖。作為對(duì)粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的反應(yīng)，樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)被介孔二氧化硅(mps)微粒募集。將粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)(0納克、500納克、1000納克、3000納克)裝載入介孔二氧化硅(mps)微粒中，并將其皮下注射入小鼠中。在注射后第7天，收獲腳手架并用流式細(xì)胞儀分析。圖15a顯示，隨著粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)劑量的增加，募集的cdllc+cdllb+樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)增加。圖15b顯示，隨著粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)劑量的增加，募集的成熟cdllc+mhcii+樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)同樣增加。

圖16是一種棒狀圖，顯示了粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)能夠增加募集的樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)向著引流淋巴結(jié)的流通。將裝載有alexa647標(biāo)記的卵清蛋白(ova)、或者alexa647標(biāo)記的ova和1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的介孔二氧化硅(mps)微粒皮下注射入小鼠體內(nèi)。在注射后第7天，收獲引流管淋巴結(jié)(dln)并用流式細(xì)胞儀分析。在加入了抗原(ova)的情況下，流向腳手架并吸收ova的alexa647+cd11c+樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)有適度增加。然而，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的加入使從腳手架流向dln的樹(shù)突狀細(xì)胞顯著增加。

圖17a-c是散點(diǎn)圖，圖17d是棒狀圖。胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)從介孔二氧化硅(mps)微粒腳手架中的局部運(yùn)輸能夠增加活化的樹(shù)突狀細(xì)胞的循環(huán)。介孔二氧化硅(mps)微粒裝載有1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、300微克ova和100微克胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)。然后將其皮下注射入小鼠中。在注射后7天收獲dlns并分析。用cdllc和cd86染色淋巴結(jié)細(xì)胞。胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)能夠從介孔二氧化硅(mps)腳手架中局部釋放，因此它的加入能夠進(jìn)一步增加dln中活化的、成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)的百分比和數(shù)目。

圖18a-c是照片，圖18d是棒狀圖。蛋白質(zhì)以控制且持續(xù)的方式從介孔二氧化硅(mps)微粒腳手架中釋放。將alexa647標(biāo)記的卵清蛋白(或者處于緩沖溶液中，或者裝載在介孔二氧化硅(mps)微粒上)皮下注射到老鼠側(cè)面。使用ivis測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)熒光。如果在緩沖溶液中注射，所述蛋白質(zhì)在小于1天的時(shí)間里從注射部位擴(kuò)散。但是，如果裝載在介孔二氧化硅(mps)微粒上，所述蛋白質(zhì)以一種持續(xù)的方式從局部腳手架位點(diǎn)釋放，例如，超過(guò)一周的時(shí)間(2、3、4、5、7或者更多天)。

圖19a-b是線性圖，顯示了抗體滴定度?？贵w滴定度被定義為抗體-血清溶液被稀釋但始終包含可檢測(cè)數(shù)量抗體的程度。使用30微克ova、10微克胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)，或著以可溶形式、或者裝載在5毫克介孔二氧化硅(mps)微粒中，對(duì)小鼠接種。滴定抗卵白蛋白血清抗體。裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和ova的介孔二氧化硅(mps)可以引發(fā)有力的、長(zhǎng)時(shí)間的th1和th2抗體反應(yīng)，分別如igg2a和iggl抗體的高滴定度所示。更令人難忘的是，這些反應(yīng)在單次注射接種超過(guò)200天后仍然明顯。該反應(yīng)可以與使用氫氧化鋁傳遞的ova相比，這是美國(guó)唯一獲批的助劑。雖然介孔二氧化硅(mps)疫苗能夠誘導(dǎo)th1和th2抗體反應(yīng)，由于其能夠裝載小的細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)和dna，通過(guò)硫酸鋁誘導(dǎo)的反應(yīng)是完全th2偏移的。介孔二氧化硅(mps)疫苗用途非常廣泛，并且容易精確的轉(zhuǎn)變和控制，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。

圖20a-d是一種散點(diǎn)圖，顯示了使用介孔二氧化硅(mps)疫苗接種能夠誘導(dǎo)t卵泡輔助細(xì)胞的擴(kuò)增。用cfse染色ot-ii脾細(xì)胞并適應(yīng)性傳遞進(jìn)入thy1.1+受體小鼠中。然后用介孔二氧化硅(mps)和溶菌酶、介孔二氧化硅(mps)和ova，和包括粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)和cpg的全形式疫苗接種受體小鼠。在疫苗接種三天后，收獲dln并分析適應(yīng)性傳遞的細(xì)胞。這里顯示，接種介孔二氧化硅(mps)和ova的小鼠，接種全形式疫苗的小鼠能夠產(chǎn)生強(qiáng)壯的卵泡t輔助細(xì)胞群，這是直接負(fù)責(zé)“輔助”b細(xì)胞分化并成熟為完全功能性抗原特異性抗體分泌的漿細(xì)胞。

圖21a-d是一種線狀圖，顯示了使用介孔二氧化硅(mps)疫苗接種能夠誘導(dǎo)cd4+t輔助細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。用cfse染色ot-ii脾細(xì)胞并適應(yīng)性傳遞進(jìn)入thy1.1+受體小鼠中。然后用介孔二氧化硅(mps)和溶菌酶、介孔二氧化硅(mps)和ova，和包括粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)和cpg的全形式疫苗接種受體小鼠。在疫苗接種三天后，收獲dln并分析適應(yīng)性傳遞的細(xì)胞。據(jù)這里所顯示，介孔二氧化硅(mps)和ova，以及全型疫苗都能夠誘導(dǎo)cd4+t輔助細(xì)胞有效的顆粒擴(kuò)增，顯示全身性抗原特異性反應(yīng)。

圖22a-b是一種線性圖，顯示了介孔二氧化硅(mps)微粒羥基乙酸和乳酸修飾作用幫助生物活性粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的釋放。^1微克的粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)被裝載入5毫克的羥基乙酸或者乳酸修飾的介孔二氧化硅(mps)棒中，并在0.1bsa/pbs中培養(yǎng)。周期性收集上清液并使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(r&d公司)粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)。與從未修飾的介孔二氧化硅(mps)微粒中釋放的粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)相比，羥基乙酸和乳酸修飾作用能夠使生物活性粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的累積釋放增加超過(guò)20倍。

圖23a-d是散點(diǎn)圖，顯示了羥基乙酸修飾的介孔二氧化硅(mps)能夠增加募集的樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)和成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)的百分比。在37度下，5毫克未修飾的或者羥基乙酸修飾的介孔二氧化硅(mps)微粒裝載有1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)1小時(shí)，然后皮下注射入小鼠中。在第7天收獲腳手架并分析。這里證實(shí)，修飾的介孔二氧化硅(mps)幾乎使募集的cdllc+cdllb+樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)的百分比加倍，并且，cdllc+cd86+成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)百分比顯著增加。這些結(jié)果顯示，介孔二氧化硅(mps)微粒良好的表面修飾能力允許進(jìn)行進(jìn)一步募集細(xì)胞的表型操作，從而誘導(dǎo)更有效的免疫反應(yīng)。

具體實(shí)施方式

可注射的介孔二氧化硅(mps)-基的微棒在體內(nèi)隨機(jī)自組裝形成3d腳手架。設(shè)計(jì)該系統(tǒng)從而使該系統(tǒng)釋放細(xì)胞因子，募集并短時(shí)間內(nèi)收容免疫細(xì)胞，用抗原呈遞他們并用危險(xiǎn)信號(hào)活化他們。在募集并短時(shí)間收容所述細(xì)胞或者結(jié)構(gòu)中含有所述細(xì)胞之后，這些免疫細(xì)胞從裝置結(jié)構(gòu)中遷移出來(lái)并定位到淋巴結(jié)中。因此，所述組合物是一種細(xì)胞在其中來(lái)回交流/循環(huán)的組合物，他們的免疫活化狀態(tài)通過(guò)裝置運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)果而改變/調(diào)節(jié)。

在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)抗原特異性樹(shù)突狀細(xì)胞群落的顯著擴(kuò)增以及次級(jí)淋巴小結(jié)的形成，這是通過(guò)使用本發(fā)明的裝置，在淋巴結(jié)中引入卵泡t輔助細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在脾中，抗原識(shí)別性cd8+ctl群落也被發(fā)現(xiàn)顯著增加了。該系統(tǒng)同樣誘導(dǎo)抗原特異性cd4和cd8t細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。除了細(xì)胞免疫反應(yīng)顯著擴(kuò)增之外，還檢測(cè)到產(chǎn)生大量耐受性抗體和平衡性th1/th2反應(yīng)。

用于調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞流通和重新編碼的可注射性介孔二氧化硅微棒-基腳手架系統(tǒng)的基本元素包括：

·介孔二氧化硅(mps)微棒的寬高比(10納米橫截面積除以100微米長(zhǎng)度)防止其被吸收，并因此允許局部形成三維結(jié)構(gòu)。

·8納米孔徑，允許吸附那些能夠通過(guò)控制的并且連續(xù)的方式擴(kuò)散而傳遞的小分子。

·高表面面積與體積比，允許控制各種細(xì)胞因子、危險(xiǎn)信號(hào)和抗原的裝載。

·介孔二氧化硅(mps)微棒的炎癥性質(zhì)能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞募集，并且不需要其他炎癥性細(xì)胞因子。

·介孔二氧化硅(mps)棒表面化學(xué)修飾能力的多功能性，可以調(diào)節(jié)所述棒的性質(zhì)以及蛋白質(zhì)與棒的結(jié)合方式。

·粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的控制釋放可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞流向腳手架位點(diǎn)。

·胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)的控制釋放能夠活化募集的樹(shù)突狀細(xì)胞。

·募集免疫細(xì)胞在腳手架位點(diǎn)可以吸收錨定蛋白質(zhì)抗原。

據(jù)發(fā)現(xiàn)，孔徑為大約5-10納米，例如8納米時(shí)，對(duì)于小分子以及蛋白質(zhì)的裝載效率達(dá)到最佳，例如，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)(其分子直徑為大約3納米)。

將懸浮在緩沖液中的微棒進(jìn)行皮下注射，所述棒隨機(jī)堆疊成一種三維結(jié)構(gòu)，所述棒的末端相互之間形成物理接觸，并且在此接觸之間形成一種微空隙。

mps

通過(guò)將四乙基原硅酸酯與一種由膠束棒制成的模板發(fā)生反應(yīng)來(lái)合成介孔二氧化硅納米顆粒。所得結(jié)果是一系列納米尺寸的球或者棒，其中充滿規(guī)則排列的小孔。通過(guò)溶劑洗滌調(diào)節(jié)合適的ph值，并因此除去模板。在另一個(gè)技術(shù)中，所述介孔顆?？梢允褂煤?jiǎn)單的溶膠-凝膠法或者噴霧干燥法合成。四乙基原硅酸酯還可以與其他的聚合物單體(作為模板)一起使用。其他方法包括美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)20120264599和20120256336中所描述的那些方法，通過(guò)引證在此并入本文。

粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)

粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)是一種蛋白質(zhì)，由巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞所分泌。具體地說(shuō)，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)是一種細(xì)胞因子，可以起到白細(xì)胞生長(zhǎng)因子的功能。粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)刺激干細(xì)胞產(chǎn)生粒性白細(xì)胞和單核細(xì)胞。單核細(xì)胞從血流中出來(lái)，移入組織，并隨后成熟進(jìn)入巨噬細(xì)胞。

這里描述的腳手架裝置包括并且釋放粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽，用于將宿主樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)吸引到所述裝置中。預(yù)計(jì)的粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是從體內(nèi)分離的，或者是體內(nèi)或者體外合成的。內(nèi)生的粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)是從健康的人類組織中分離出來(lái)的。在將模板dna轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主有機(jī)體或者細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物或者培養(yǎng)的人細(xì)胞系)中之后，體內(nèi)合成性粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽。做為選擇，合成性粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或者其他本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法體外合成的sambrook,j.,fritsch,e.f.,和maniatis,t.,molecularcloning:alaboratorymanual(分子克?。阂环N實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)).coldspringharborlaboratorypress(冷泉港冷泉出版社),ny,第1,2,3卷(1989),通過(guò)引證在此并入本文)。

粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽被修飾以增加體內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。做為選擇，對(duì)粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽進(jìn)行設(shè)計(jì)使其具有更多或者更少的免疫原性。內(nèi)原性的成熟人粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是糖基化的，據(jù)報(bào)道，在氨基酸殘基23(白氨酸)、27(天門(mén)冬酰胺)于是39(谷氨酸)處糖基化(參見(jiàn)美國(guó)專利第5,073,627號(hào))。相對(duì)于糖基化狀態(tài)，在一個(gè)或者一個(gè)以上的氨基酸殘基上修飾本發(fā)明的粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽。

粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是重組的。做為選擇，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是哺乳動(dòng)物粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽的人源化衍生物?？梢匝苌Ｐ园准?xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)多肽的示范性的哺乳動(dòng)物種類包括，但是不局限于，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、荷蘭豬、白鼬、貓、狗、猴子或者靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)是一種重組人蛋白質(zhì)(peprotech公司，編目號(hào)300-03)。做為選擇，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)是一種重組鼠科(小鼠)蛋白質(zhì)(peprotech公司，編目號(hào)＃_315-03)。最后，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)是重組體小鼠蛋白質(zhì)人源化的衍生物。

人重組粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)(peprotech公司，編目＃_300-03)(由下列多肽序列編碼(seqidno：2))：

maparspspstqpwehvnaiqearrllnlsrdtaaemnetvevisemfdlqeptclqtrlelykqglrgsltklkgpltmmashykqhcpptpetscatqiitfesfkenlkdfllvipfdcwepvqe

鼠重組粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)(peprotech公司，編目＃_315-03)(由下列多肽序列編碼(seqidno：3))：

maptrspttvtrpwkhveaikealnllddmpvtlneevevvsnefsfkkltcvqtrlkifeqglrgnftklkgalnmtasyyqtycpptpetdcetqvttyadfidslkthltdipfeckkpvqk

人內(nèi)原性的粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)(由下列mrna序列(ncbi登記號(hào)nm_000758和seqidno：4)編碼)：

人內(nèi)原性的粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)(由下列氨基酸序列(ncbi登記號(hào)np_000749.2和seqidno：5)編碼)：

mwlqsllllgtvacsisaparspspstqpwehvnaiqearrllnlsrdtaaemnetvevisemfdlqeptclqtrlelykqglrgsltklkgpltmmashykqhcpptpetscatqiitfesfkenlkdfllvipfdcwepvqe

胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤(cpg)低聚核苷酸(cpg-odn)序列

cpg位點(diǎn)是脫氧核糖核酸(dna)區(qū)域，在此區(qū)域中，基質(zhì)線性序列沿著其長(zhǎng)度方向胞嘧啶核苷緊挨著鳥(niǎo)苷酸(″p″表示他們之間存在的磷酸鍵，并將他們與胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤互補(bǔ)堿基對(duì)相區(qū)別)。cpg位點(diǎn)在dna甲基化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這是細(xì)胞用來(lái)靜止基因表達(dá)的一些內(nèi)源性機(jī)制中的一個(gè)。啟動(dòng)子元素內(nèi)cpg位點(diǎn)的甲基化能夠使基因靜止。在癌癥的情況下，已知腫瘤抑制基因通常是靜止的，而致癌基因或者癌癥誘導(dǎo)基因被表達(dá)。重要地，已經(jīng)證實(shí)腫瘤抑制基因(預(yù)防癌癥形成的基因)啟動(dòng)子區(qū)域中的cpg位點(diǎn)是被甲基化的，而在某些癌癥中致癌基因啟動(dòng)子區(qū)域中的cpg位點(diǎn)是低甲基化的或者未甲基化的。toll樣受體(tlr)-9受體結(jié)合dna中未甲基化的cpg位點(diǎn)。

這里描述的疫苗組合物包括cpg低聚核苷酸。cpg低聚核苷酸是從體內(nèi)分離的，或者是體內(nèi)或者體外合成的。示范性的內(nèi)源性cpg低聚核苷酸來(lái)源包括，但是不局限于，微生物、細(xì)菌、真菌、原生蟲(chóng)、病毒、霉菌或者寄生蟲(chóng)。或者，內(nèi)源性的cpg低聚核苷酸是從哺乳動(dòng)物良性或者惡性贅生性腫瘤中分離出來(lái)的。合成的cpg低聚核苷酸是在將模板dna轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化入宿主有機(jī)體內(nèi)之后，在體內(nèi)合成的。做為選擇，合成性cpg低聚核苷酸是使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或者其他本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法體外合成的(sambrook,j.,fritsch,e.f.,和maniatis,t.,molecularcloning:alaboratorymanual(分子克?。阂环N實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)).coldspringharborlaboratorypress(冷泉港冷泉出版社),ny,第1,2,3卷(1989),通過(guò)引證在此并入本文))。

呈遞cpg低聚核苷酸用于樹(shù)突狀細(xì)胞的胞內(nèi)吸收。例如，使用無(wú)保護(hù)的cpg低聚核苷酸。術(shù)語(yǔ)“無(wú)保護(hù)的”用于描述一種分離的內(nèi)源性或者合成的多聚核苷酸(或者低聚核苷酸)，其上不含有額外的取代基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，cpg低聚核苷酸與一種或者一種以上化合物相結(jié)合，增加細(xì)胞吸收的效率。做為選擇或者另外，cpg低聚核苷酸與一種或者一種以上的化合物結(jié)合，增加腳手架和/或樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)低聚核苷酸的穩(wěn)定性。在細(xì)胞吸收之前，選擇性地濃縮cpg低聚核苷酸。例如，使用聚(氮丙啶)(pei)濃縮cpg低聚核苷酸，所述聚(氮丙啶)(pei)是一種陽(yáng)離子聚合物，能夠增加樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞吸收的效率。

cpg低聚核苷酸可以被分成多個(gè)種類。例如，本發(fā)明組合物、方法和裝置中包括的示范性的cpg-odns是刺激性的、中性的或者抑制性的。這里的術(shù)語(yǔ)“刺激性的”用于描述一類能夠活化tlr9的胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)序列。這里的術(shù)語(yǔ)“中性的”用于描述一類不能活化tlr9的胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)序列。這里的術(shù)語(yǔ)“抑制的”用于描述一類能夠抑制tlr9的胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)序列。術(shù)語(yǔ)“活化的tlr9”描述了一種方法，使用此方法tlr9能夠引起細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。

刺激性胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)可以進(jìn)一步被分成三種類型，a、b和c，這些類型在免疫刺激活性方面有所不同。a類刺激性cpg低聚核苷酸(odns)的特點(diǎn)在于包括磷酸二酯中心性cpg的回文結(jié)構(gòu)部分和一種硫代磷酸3'聚-g線。在tlr9活化之后，這些胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)誘導(dǎo)漿樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pdc)中產(chǎn)生高產(chǎn)量的ifn-α。a類胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)微弱地刺激tlr9-依賴性的nf-κb信號(hào)傳導(dǎo)。

b型刺激性胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)包括一種全硫代磷酸主鏈，具有一種或者一種以上cpg二核苷酸。在tlr9活化后，這些cpg-odns有力的刺激b細(xì)胞。與a類胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)不同，b類胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)微弱地刺激ifn-α分泌。

c類刺激性胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)包括a和b類的特征。c類胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)包括一種全硫代磷酸主鏈和一種包括cpg的回文結(jié)構(gòu)部分。與a類胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)相似，c類胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)誘導(dǎo)pdc產(chǎn)生大量的ifn-α。與b類胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)相似，c類胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的b細(xì)胞刺激。

示范性的刺激性cpgodns包括，但是不局限于，odn1585、odn1668、odn1826、odn2006、odn2006-g5、odn2216、odn2336、odn2395、odnm362(都來(lái)自invivogen)。本發(fā)明還包括前述cpg低聚核苷酸(odns)任何人源化的版本。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物、方法和裝置包括odn1826(其序列從5'到3'是tccatgacgttcctgacgtt，其中cpg元素用黑體表示，seqidno:10)。

不刺激tlr9的中性或者參照cpgodns被包括在本發(fā)明中。這些低聚核苷酸(odns)包括與其刺激性對(duì)應(yīng)物相同的序列，但是不含有cpg二核苷酸，而是含有g(shù)pc二核苷酸。

本發(fā)明所包括的示范性的中性或者參照cpgodns包括，但是不局限于，odn1585參照物、odn1668參照物、odn1826參照物、odn2006參照物、odn2016參照物、odn2336參照物、odn2395參照物、odnm362參照物(都來(lái)自invivogen)。本發(fā)明還包括前述cpg低聚核苷酸(odns)任何人源化的版本。

抗原

這里所描述的組合物、方法和裝置中包括腫瘤抗原或者其他抗原。在施用這種裝置的患者體內(nèi)，抗原引發(fā)保護(hù)性免疫或者產(chǎn)生治療免疫反應(yīng)。優(yōu)選的腫瘤抗原是腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物(參見(jiàn)，例如，aliet.al,2009,naturematerials8,151-158；通過(guò)引證在此并入本文)。例如，從人類患者(或者非人動(dòng)物)中提取全腫瘤樣品或者腫瘤活組織切片樣品，并使用膠原酶消化，降解胞外基質(zhì)。然后，所述腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷三次冷凍融化過(guò)程循環(huán)，其中，細(xì)胞在液氮中冷凍，然后在水浴中解凍。該過(guò)程產(chǎn)生腫瘤抗原，然后將腫瘤抗原與粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)和cpgodn一起裝載在介孔二氧化硅(mps)顆粒上。例如，腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物抗原的疫苗劑量是獲得1x10⁶個(gè)腫瘤細(xì)胞。在制備mps顆粒之后，將此顆粒懸浮在生理學(xué)可接受性緩沖液(例如，pbs)中，然后向棒的懸浮液中加入募集化合物(例如，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf))、活化化合物(例如，cpg)和抗原。在室溫下?lián)u動(dòng)混合物整夜，然后冷凍干燥大約4小時(shí)。在給藥之前，將棒在此懸浮在緩沖液中，然后將懸浮液裝載進(jìn)入1毫升注射器(18號(hào)針)中。通常，每次注射的混合物疫苗劑量是150微升。

本發(fā)明的組合物、方法和裝置中包括的示范性的癌癥抗原包括，但是不局限于，從活體檢查中提取的腫瘤溶解產(chǎn)物、照射的腫瘤細(xì)胞、抗原的mage系列(例如mage-1)、mart-1/梅拉納、酪氨酸酶、神經(jīng)節(jié)苷脂、gp100、gd-2、o-乙?；痝d-3、gm-2、muc-1、sos1、蛋白激酶c-結(jié)合蛋白、反轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)、akap蛋白質(zhì)、vrk1、kiaa1735、t7-1、t11-3、t11-9、現(xiàn)代人端粒酶發(fā)酵產(chǎn)物(htrt)、細(xì)胞角蛋白-19(cyfra21-1)、鱗狀細(xì)胞癌抗原1(scca-1)、(蛋白質(zhì)t4-a)、鱗狀細(xì)胞癌抗原2(scca-2)、卵巢癌抗原ca125(1a1-3b)(kiaa0049)、粘蛋白1(腫瘤相關(guān)的粘蛋白)、癌-相關(guān)的粘蛋白)、(多形態(tài)上皮細(xì)胞粘蛋白)、(pem)、(pemt)、(episialin)、(腫瘤相關(guān)的上皮細(xì)胞膜抗原)、(ema)、(h23ag)、(花生反應(yīng)性的尿粘蛋白)、(pum)、(乳腺癌相關(guān)的抗原df3)、ctcl腫瘤抗原se1-1、ctcl腫瘤抗原se14-3、ctcl腫瘤抗原se20-4、ctcl腫瘤抗原se20-9、ctcl腫瘤抗原se33-1、ctcl腫瘤抗原se37-2、ctcl腫瘤抗原se57-1、ctcl腫瘤抗原se89-1、前列腺特異性膜抗原、5t4癌坯滋養(yǎng)層糖蛋白、orf73皮膚多發(fā)性出血性肉瘤相關(guān)的皰疹病毒、mage-c1(癌癥/睪丸抗原ct7)、mage-b1抗原(mage-xp抗原)(dam10)、mage-b2抗原(dam6)、mage-2抗原、mage-4a抗原、mage-4b抗原、結(jié)腸癌抗原ny-co-45、肺癌抗原ny-lu-12變體a、癌癥相關(guān)的表面抗原、腺癌抗原art1、伴生腫瘤相關(guān)的腦-睪丸-癌癥抗原(旁瘤抗原ma2；伴生腫瘤神經(jīng)元抗原)、神經(jīng)腫瘤腹部抗原2(nova2)、肝細(xì)胞癌抗原基因520、腫瘤相關(guān)的抗原co-029、腫瘤相關(guān)的抗原mage-x2、滑膜肉瘤、x斷點(diǎn)2、t細(xì)胞識(shí)別的鱗狀細(xì)胞癌抗原、血清學(xué)檢測(cè)的結(jié)腸癌抗原1、血清學(xué)檢測(cè)的乳癌抗原ny-br-15、血清學(xué)檢測(cè)的乳癌抗原ny-br-16、嗜鉻粒蛋白a；甲狀旁腺分泌的蛋白質(zhì)1、dupan-2、ca19-9、ca72-4、ca195、癌胚抗原(cea)。純化的腫瘤抗原可以單獨(dú)被是用或者彼此結(jié)合使用。

所述系統(tǒng)還可以有效用于產(chǎn)生針對(duì)其他抗原(例如，微生物病原體，比如細(xì)菌、病毒、真菌)的免疫反應(yīng)。

下列材料和方法用于產(chǎn)生這里描述的數(shù)據(jù)。

介孔二氧化硅(mps)腳手架的制備

在室溫下，將pluronicp-123(sigma-aldrich公司)表面活性劑溶解在1.6mhcl中，然后加熱至40℃。加入42毫摩爾正硅酸乙酯(teos)(sigma-aldrich公司)，在40℃下加熱20分鐘，同時(shí)攪拌(600rpm)。然后將組合物加熱到100℃，24小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集棒狀顆粒，在室溫條件下空氣干燥。80℃下，將顆粒在乙醇/鹽酸(5部分hcl比500部分乙醇)中提取過(guò)夜?；蛘?，在100％乙醇中，在550℃下煅燒顆粒4小時(shí)。所述mps組合物可以在加入募集化合物和/或活化化合物之前或之后，并且在加入抗原之前或者之后被儲(chǔ)存并運(yùn)輸使用。例如，如果抗原是有來(lái)自病人的活組織檢查樣品制備的腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物，他可以被處理并在對(duì)病人施用前很短時(shí)間加入到mps顆粒中。

對(duì)于全型疫苗組合物，1微克/鼠gm-csf、100微克/鼠cpg-odn和130微克/鼠的卵清蛋白與5毫克/鼠mps一起在dh2o中培養(yǎng)12小時(shí)，冷凍干燥12小時(shí)，重新懸浮在150微升/鼠pbs中，用18g針頭皮下注射。

為了確定gm-csf和cpg-odn從mps棒中釋放的動(dòng)力學(xué)，放射活化的i-標(biāo)記的重組人gm-csf被用作示蹤劑，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)釋放研究。相似的，通過(guò)使用nanodrop儀(nd1000,nanodroptechnologies公司)的吸光讀數(shù)確定釋放進(jìn)入pbs的cpg-odn的量。

mps微顆粒的修飾作用

使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)二亞胺碳(edc)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品來(lái)活化羥基乙酸和乳酸上的羧酸。使用胺丙基硅烷對(duì)mps顆粒進(jìn)行氨基修飾。然后室溫下將兩種組分混合在一起，過(guò)夜反應(yīng)。然后允許顆粒風(fēng)干。將所得的羥基乙酸和/或乳酸修飾的顆粒與gm-csf或其他上面描述的化合物相接觸。

體外樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)活化試驗(yàn)

使用20納克/毫升的gm-csf將鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)從骨髓細(xì)胞中分化出來(lái)。分化的樹(shù)突狀細(xì)胞以10⁶/毫升的濃度與100微克/毫升mps顆粒一起培養(yǎng)18小時(shí)，然后使用流式細(xì)胞儀分析cd11c(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)、cd86(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)和mhc類-ii(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)的表達(dá)。

分析mps腳手架募集的樹(shù)突狀細(xì)胞及其向淋巴結(jié)的遷移

從動(dòng)物體內(nèi)取回mps腳手架然后通過(guò)機(jī)械分離的方式消化棒中細(xì)胞。apc共軛的cd11c(樹(shù)突狀細(xì)胞標(biāo)記物)、fitc共軛的mhc類-ii和pe共軛的cd86(b7，共刺激分子)染色被用于樹(shù)突狀細(xì)胞和白細(xì)胞募集分析。根據(jù)陽(yáng)性異硫氰酸熒光素(fitc)，異藻藍(lán)蛋白(apc)和藻紅蛋白(pe)，使用同型參照對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類，記錄對(duì)每種表面抗原染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞百分比。

為了確定淋巴結(jié)中是否存在抗原特異性樹(shù)突狀細(xì)胞，收獲引流淋巴結(jié)(dln)并用apc共軛的cd11c和pe共軛的siinfekl-mhc類-i(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)進(jìn)行分析。

抗原特異性cd8+脾t細(xì)胞的分析

收獲并消化脾。在裂解血紅細(xì)胞之后，使用pe-cy7共軛的cd3(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)、apc共軛的cd8(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)、pe共軛的siinfekl(seqidno:)mhc類-i四聚體(beckmancoulter公司)分析脾細(xì)胞。siinfekl是一種卵清蛋白衍生的肽[ova(257-264)]。

cd4+或者cd8+t細(xì)胞克隆擴(kuò)增的分析

收獲來(lái)自ot-ii(對(duì)于cd4)或者ot-i(對(duì)于cd8)轉(zhuǎn)基因c57bl/6鼠(jackson實(shí)驗(yàn)室)的脾，消化、匯集并用細(xì)胞示蹤劑羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(cfse)染色。在免疫2天之后，20xl0⁶個(gè)染色的脾細(xì)胞/小鼠被靜脈注射入c57bl/6鼠(jackson實(shí)驗(yàn)室)中。靜脈注射4天之后，回收dln和脾，然受使用pe共軛的cd8或者cd4標(biāo)記物分析。

抗-ova體液免疫反應(yīng)的特點(diǎn)

使用卵清蛋白包覆的平板e(cuò)lisa分析血清中的igg1和igg2a抗體?？贵w滴定度定義為elisa的od讀數(shù)>0.3(空白)的最低血清稀釋程度。

其他實(shí)施方案

盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但之前的描述只起到解釋作用并不能限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)定義。其他的方面、優(yōu)勢(shì)和修飾也被包括在所附權(quán)利要求書(shū)記載的范圍內(nèi)。

這里所涉及的所有專利和科技文獻(xiàn)構(gòu)成了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠獲得的知識(shí)。這里引用的所有美國(guó)專利和公開(kāi)的或者未公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)通過(guò)引證在此并入本文。這里引用的所有公開(kāi)的外國(guó)專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引證全部并入本文。genbank和ncbi指明的登記號(hào)碼也通過(guò)引證在此并入本文。這里引用的其他出版的參考文獻(xiàn)、文件、原稿和科學(xué)文獻(xiàn)通過(guò)引證在此并入本文。

盡管本發(fā)明已經(jīng)參照其優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了具體的顯示和表述，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，在形式和細(xì)節(jié)上可以存在各種各樣的變化，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)概括。