本發(fā)明屬于民族藥領域，具體涉及一種用于糖尿病腎病的朝藥復方提取物及其制備方法和用途。
背景技術：
本發(fā)明是以中國朝鮮族民族醫(yī)藥學(簡稱：朝醫(yī)藥學)理論為指導，借鑒“組分中藥”的概念，采用獨特的藥物提取分離技術，制備一種用于防治糖尿病腎病的提取物，該提取物可以單獨或者填加適宜輔料后制備藥物制劑。該提取物的原料藥味組成主要依據(jù)朝醫(yī)藥學中的“四象醫(yī)學”理論，參考臨床防治“太陰人”“下消”的傳統(tǒng)復方加減藥味而成。以復方中總黃酮、總多糖及總皂苷的提取量和成分保留率為指標，優(yōu)化復方提取、精制工藝。提取精制后通過大孔吸附樹脂柱，分離出復方中7個有效組分。將各有效組分及總提取物作用于高糖誘導的hk-2細胞，考察其對高糖誘導hk-2細胞氧化應激的影響和對細胞纖維化的作用，以mda含量、sod活性和α-sma蛋白表達為指標，通過單因素實驗篩選確定最佳有效組分比例，制備提取物。
糖尿病腎病(diabetickidneydisease，dkd)是由糖尿病引發(fā)的危害性較大的一類慢性并發(fā)癥，亦是胰島素依賴型糖尿病(insulindependentdiabetesmellitus，iddm)患者主要死因，其特點之一是糖尿病引起微血管病變最終致使腎小球硬化。在治療糖尿病的進程中，隨著治療技術的不斷提升，死于糖尿病急性并發(fā)癥患者逐步減少，而近些年來，糖尿病慢性并發(fā)癥如腎臟病變、眼底病變、心血管疾病已成為糖尿病患者致死、致殘的關鍵原因。據(jù)統(tǒng)計，糖尿病患者中，dkd患者死亡率達60％，由于dkd致使腎功能衰竭的死亡人數(shù)比非糖尿病患者多17倍。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，不只是ⅰ型糖尿病會發(fā)展成為dkd，dkd也會出現(xiàn)于ⅱ型糖尿病中。
當今社會，在人們生活方式變更以及嚴重的人口老齡化等方面的影響下，dkd危害人類健康的趨勢逐年上升，故積極治療dkd顯得格外重要。中老年易患有dkd，最初沒有顯著的臨床癥狀，當腎病綜合征呈現(xiàn)時，糖尿病病程已有10年之久。dkd患者發(fā)病早期會產(chǎn)生白蛋白尿，隨后逐步出現(xiàn)大量蛋白尿，3-5年即進入尿毒癥。目前盡管糖尿病患者出現(xiàn)dkd癥狀，卻沒有十分有效的治療手段。因此，唯一奏效的方法就是早期診斷治療。
目前，對于糖尿病腎病的發(fā)病機制仍未完全闡明，普遍認為是由眾多因素聯(lián)合作用所致，主要與腎內(nèi)血流動力學異常、葡萄糖代謝紊亂、某些細胞因子的參與、氧化應激、遺傳等因素相關。現(xiàn)代研究表明，糖尿病腎病腎臟病變涉及腎小球、腎小管、腎血管及間質(zhì)，而腎間質(zhì)纖維化(renalinterstitialfibrosis，rif)是dkd病理變化的主要原因之一。越來越多的人們開始研究rif的發(fā)生機制，原因在于rif在許多慢性腎病中可作為腎臟功能惡化的預測指標，并且較為準確。肌成纖維細胞(myofibroblast,myof)在腎間質(zhì)中的累積是發(fā)生rif的重要因素之一，myof是由間質(zhì)成纖維細胞激活產(chǎn)生，而間質(zhì)成纖維細胞中36％是由腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelialtomesenchymaltransition,emt)而來。所以，研究emt在dkd的rif進程中所起的作用是十分必要的內(nèi)容。
1995年，有人成功克隆出嚙齒動物腎成纖維細胞的成纖維特異蛋白(fibroblastspecificprotein,fsp1)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白在腎臟纖維化終末期的小管上皮細胞中有所表達，且上皮細胞標志物角蛋白表達降低，從而率先提出了emt的概念。此后，越來越多的emt研究中發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞在炎癥、免疫反應等一定條件刺激下可轉(zhuǎn)化為myof，其生理病理過程是一種分化完全的細胞，丟失了其原有的表型特點，轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋偷募毎mt的標志包括：(1)細胞間緊密連接消失。轉(zhuǎn)分化的過程中，腎小管上皮細胞表皮黏附分子e-cadherin表達下降，黏附特性逐步消散，基底膜斷裂從而導致細胞間緊密連接消失。(2)細胞極性消失。上皮細胞存在端-基極性，當上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞時，極性會逐漸消失，破壞了腎小管上皮細胞的完整性，細胞易從基底膜脫落。(3)波形蛋白表達增多。在emt過程中，波形纖維蛋白(vimentin)會在細胞特異性中間纖維蛋白消失與細胞骨架蛋白微絲重組時出現(xiàn)，它是細胞骨架的中間纖維，在emt中表達增多。(4)α-平滑肌肌動蛋白(α-sma)表達增多。α-sma是腎臟細胞轉(zhuǎn)分化成為myof后合成的一種特征性蛋白，是myof的表型特征，α-sma蛋白的表達量間接表現(xiàn)了myof的數(shù)量以及腎臟纖維化的程度，在正常的細胞中微量表達，在emt過程中含量升高。此外，emt的發(fā)生機制尚未完全闡明，其有關的可能機制有：(1)某些間充質(zhì)細胞決定基因被激活。纖維細胞特異蛋白-1(fsp1)、v-src、v-ras、v-mos、c-fos基因被激活，導致上皮細胞標識物如e-cadherin表達降低，間充質(zhì)標識物如vimentin和α-sma表達明顯上升，從而發(fā)生了emt。(2)emt受基質(zhì)膠原成分的調(diào)節(jié)。ⅰ型膠原會促進emt的發(fā)生，ⅳ型膠原可保留近曲小管上皮細胞的細胞表型，但重組的α1鏈非膠原1(α1nc1)的結構會抑制ⅳ型膠原的原體，阻礙ⅳ型膠原的聚積，從而發(fā)生emt，在近曲小管上皮細胞中生成了大量的促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子-β(tgf-β)，進一步推動了emt的發(fā)生。(3)某些細胞因子及代謝產(chǎn)物的參與。細胞因子影響細胞纖維化主要是推動和控制兩方面。有推進纖維化作用的因子如tgf-β，普遍認為是誘導emt的關鍵細胞因子。
大量研究表明，dkd發(fā)病機制中的另一種因素氧化應激(oxidativestress，os)也可引致組織細胞受損。os是指化學及環(huán)境等特定因素引發(fā)的機體內(nèi)自由基數(shù)量增加，os產(chǎn)物如活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ros)過多生成，抗氧能力減弱，導致氧化及抗氧化系統(tǒng)無法均衡，進而造成機體組織細胞受損。眾多的dkd發(fā)病機制中，糖代謝紊亂、糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，ages)途徑、蛋白激酶c(proteinkinasec，pkc)激活途徑以及腎小球毛細血管內(nèi)壓的提高均可激活os。ros可通過上述途徑，增加細胞外基質(zhì)(extracellularmatrixc，ecm)的合成，減少其降解，促進dkd的發(fā)展。當血糖濃度過高時，通過線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生大量的ros，ros損傷足細胞，使腎小球基底膜陰性電荷消失，腎小球濾過能力喪失，蛋白漏出。導致腎損傷的ros包括超氧陰離子(superoxideanion,o2-)，過氧化氫(peroxide,h2o2)和羥基自由基(hydroxylradicals,·ho)。清除此類超氧化物的酶包括谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,gsh-px)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)和過氧化氫酶(catalase,cat)，它們會催化超氧化物轉(zhuǎn)化為o2和h2o，但血糖濃度過高時，超氧化物的形成速度會超過其被清除的速度隨即發(fā)生os。檢測os的指標有很多，糖尿病通常檢測的是ros、rns和脂質(zhì)過氧化物。
目前，西醫(yī)治療dkd主要以糾正代謝紊亂、消除癥狀為主，尚無特效治法和直接針對dkd的有效藥物。通常主要是控制血糖、血壓和血脂，同時配以血管緊張素ii受體拮抗劑(angiotensinⅱreceptorblockers，arb)或者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensinconvertingenzymeinhibitors，acei)降低腎小球跨膜壓力。在dkd的初期，緩解疾病的發(fā)展還可依靠藥物的治療，一旦進入腎病終末期，由于腎小球的硬化，依賴藥物進行抗纖維化難以起效。藥物治療方案包括：利用降血糖藥物或胰島素控制血糖；用acei、鈣拮抗劑等藥物控制高血壓；血小板黏附和凝集能力通過第3代降糖藥物及抗凝藥物的應用降低；以aris調(diào)節(jié)多元醇旁路異常；用氨基胍、苯甲酰噻唑、噻唑類衍生物等清除糖基化最終產(chǎn)物。
dkd中醫(yī)學統(tǒng)一定名為“消渴病腎病”，中醫(yī)認為dkd主要由消渴日久，纏綿不愈，使臟腑功能衰退，主要是陰、陽、氣、血虛衰而致病。在病因病機理論上普遍統(tǒng)一為正虛邪實，氣陰兩虛為其根本，瘀血阻滯為其標。脾氣衰弱，肝腎不足，淤血水阻為主要發(fā)病機制。中醫(yī)診治方法多以益腎健脾、活血利水為主。在臨床個體化治療中取得了一定療效，但適合群體化治療的藥物開發(fā)尚未取得突破性進展，缺乏針對性強的具體產(chǎn)品。因此，積極探求dkd的防治方法和開發(fā)針對性強的藥物成了世界各國急需解決的難題。
朝醫(yī)藥學有著自己獨特的風格，它以東醫(yī)理論為基礎，結合中醫(yī)藥學理論，確立了本民族的醫(yī)藥學理論體系。體質(zhì)辨證為朝醫(yī)學當中獨到的治病防病理論。按照每個人具有不同的體質(zhì)特點，將社會人群分為四種人，分別是太陽人、太陰人、少陽人、少陰人，統(tǒng)計結果表明太陰人居多，占人群的50％以上。朝醫(yī)臨床曾調(diào)查糖尿病患者中患dkd的人數(shù)，結果顯示太陰人占70％以上。
朝醫(yī)學將dkd歸于“消渴門”范圍。查閱朝醫(yī)藥學經(jīng)典著作和文獻，消渴病腎病的命名來源于機體消渴日久，變?yōu)橄D期的腎消顯現(xiàn)的水腫、尿濁等相應臨床癥狀，其病機特點是：稟賦有虧，氣陰兩虛，久之陰陽兩虛，痰熱郁瘀，聚積絡脈，形成微小瘕，肺、脾、腎、肝、心漸次受傷。治療dkd患者的過程中，根據(jù)朝醫(yī)學理論結合患者體質(zhì)特點和疾病本身給患者用藥，選用的處方具有明顯的治療效果。
本發(fā)明提取物的原料藥味包括：葛根、黃芩、山藥、藁本、五味子、桔梗、升麻、白芷、麥門冬。葛根為豆科植物野葛(puerarialobate(willd.)ohwi)的干燥根；黃芩為唇形科草本植物黃芩(scutellariabaicalensisgeorgi.)的干燥根；山藥為薯蕷科植物薯蕷(dioscoreaoppositathunb.)的干燥根莖；藁本為傘形科植物藁本(ligusticumsinenseoliv.)干燥根和根莖；五味子為木蘭科植物五味子(schisandrachinensis(turez.baill.))的干燥成熟果實；桔梗為桔?？浦参锝酃?platycodongrandiflorum(jacq.)a.dc.)的干燥根；升麻為毛茛科植物興安升麻(cimicifugadahurica(t-urcz.)maxim.)的干燥根莖；白芷為傘形科植物白芷(angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f.)的干燥根；麥門冬為百合科植物麥冬(ophiopogonjaponicus(thumb.)ker-gawl.)的干燥塊根。
以上藥味中，葛根清熱解毒，生津止渴；黃芩收斂肺元，清熱解毒；藁本發(fā)散表邪，祛風止痛；升麻發(fā)散風熱，解毒升陽之效；麥門冬補肺和肺，五味子健肺直肺；山藥以壯肺而有內(nèi)守之力，桔梗以壯肺而有外攘之勢；白芷具有祛風解表止痛作用。諸藥合用，共奏補肺斂肺、潤燥化痰、生津解表之功。
本發(fā)明原料藥味的組成參考了傳統(tǒng)朝藥復方，該復方主要針對太陰人“肝大肺小”的體質(zhì)特點、不良的飲食習慣及其特有的病機特征等，基于“大者瀉之”、“小者補之”的綜合治療原則，結合“通利補肺瀉肝”的臨床治療思路，選取了上述9味太陰人要藥組成方劑。發(fā)明人在臨床上將該方劑應用于太陰人的消渴病下消和消渴病腎病，已經(jīng)取得了一定療效。在該方劑以往的應用過程中，僅采用湯劑水煎服，日2次的簡單制備和使用方法，并沒有充分提取和富集藥物的有效成分，使得有效成分含量相對偏低且不穩(wěn)定。同時湯劑還存在患者順應性差，攜帶運輸不方便，長期貯存容易變質(zhì)等問題。因此，有必要以藥理活性為指標，依據(jù)處方中各藥味的活性成分對該方劑制備工藝進行研究并優(yōu)化出具體工藝參數(shù)，同時確定主要成分的含量范圍，以期在提高藥效、減少藥物服用量的基礎上確保質(zhì)量穩(wěn)定，為患者提供更好的防治dkd的藥物。
“組分中藥”的概念是在長期對中藥的研究應用過程中提出的，以傳統(tǒng)中醫(yī)方劑為主，在中藥藥效理論指導下，依據(jù)中藥復方的功能主治和臨床應用，得出精簡中藥化學組分，簡稱為“組分中藥”。“組分中藥”是復方制劑，形式類似于天然藥物，可作為新藥研發(fā)的方向，其藥理研究包括有效性、安全性、配伍合理性以及藥理機制。本發(fā)明借鑒“組分中藥”的概念，通過特定的提取、精制和富集工藝獲得了上述方劑的“有效組分”提取物，該提取物的幾種有效組分在特定配比時呈現(xiàn)出最佳藥理活性。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于防治dkd的朝藥復方提取物。一種用于防治dkd的朝藥復方提取物中主要有效組分及重量配比為：總多糖100份、總黃酮5～15份、總皂苷3～12份。它是以葛根、黃芩、山藥、藁本、五味子、桔梗、升麻、白芷、麥門冬為原料按一定比例配伍，采用特定方法制備的提取物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種上述提取物的制備方法。與朝藥復方現(xiàn)有的水煎煮法比較，本發(fā)明所述制備方法采用特定的提取、精制和有效組分分離純化方法，使得有效成分含量相對提高，同時保持各有效組分之間的含量比例穩(wěn)定，從而顯著提高藥效、減少藥物服用量并確保藥物質(zhì)量穩(wěn)定。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術方案：
所述的防治dkd的朝藥復方提取物的制備方法，其特征在于，所述提取物的原料藥組成及重量配比為：
葛根2～4份，黃芩2～4份，山藥2～4份，藁本2～4份，五味子1～2份，桔梗1～2份，升麻1～2份，白芷1～2份，麥門冬1～2份。
所述制備方法包括如下步驟：
(1)按照所述重量份準備各原料藥，各原料質(zhì)量均應符合《中華人民共和國藥典》2015版(一部)的規(guī)定；
(2)取上述原料藥，采用20％～40％乙醇為溶劑提取，得提取液；
(3)采用吸附澄清法對提取液進行精制，得精制液；
(4)精制液通過d101型大孔吸附樹脂柱，進行有效組分分離純化，收集洗脫液；
(5)洗脫液濃縮干燥，得提取物。
上述原料藥的單位處方組成優(yōu)選為：葛根20g、黃芩20g、山藥20g、藁本20g、五味子10g、桔梗10g、升麻10g、白芷10g、麥門冬10g。
所述步驟(2)中，原料藥用20％～40％乙醇為溶劑提取2次，優(yōu)選的，乙醇濃度為30％；
優(yōu)選的，所述步驟(2)中，第一次提取溶劑用量為藥材重量的8～12倍，提取時間為1h～2h；優(yōu)選的，溶劑用量為藥材重量的10倍，提取時間為1.5h；
優(yōu)選的，所述步驟(2)中，第二次溶劑用量為藥材重量的6～10倍，提取時間為0.5h～1.5h；優(yōu)選的，溶劑用量為藥材重量的8倍，提取時間為1h。
所述步驟(2)優(yōu)選的技術方案為：
取上述原料藥，采用30％乙醇為溶劑提取2次，第一次溶劑用量為藥材重量的10倍，提取1.5h，濾過，第二次溶劑用量為藥材重量的8倍量，提取1h，濾過，合并濾液，得提取液。
所述步驟(3)中，采用吸附澄清法進行精制，提取液濃縮程度為濃縮至料液比1:1～1:2，吸附澄清操作溫度為60℃～65℃，先加入ztc1+1天然澄清劑b組分，用量為濃縮后提取液體積的5％～9％，吸附澄清后冷藏靜置時間為12h～48h，取上清液離心，濾過，濾液加入澄清劑a組分，a組分用量為b組分的0.5倍，靜置4h，濾過，得精制液；
優(yōu)選的，提取液濃縮程度為濃縮至料液比1:1，吸附澄清操作溫度為60℃，ztc1+1天然澄清劑b組分用量為濃縮后提取液體積的7％，吸附澄清后冷藏靜置時間為24h；
所述步驟(3)優(yōu)選的技術方案為：
提取液濃縮至料液比1:1，在60℃下加入ztc1+1天然澄清劑b組分，同時攪拌，b組分用量為濃縮后提取液體積的7％，吸附澄清后冷藏靜置24h，取上清液離心，濾過，濾液加入澄清劑a組分，a組分用量為b組分的0.5倍，靜置4h，濾過，得精制液。
所述步驟(4)中，取精制液通過處理好的d101型大孔吸附樹脂柱，洗脫劑為10％～50％乙醇，洗脫量為3～5bv，洗脫流速為2bv/h，收集洗脫液；優(yōu)選的，洗脫劑乙醇濃度為30％，洗脫劑用量為3bv；
所述步驟(4)優(yōu)選的技術方案為：
取精制液通過處理好的d101型大孔吸附樹脂柱，采用30％乙醇，3bv洗脫量，2bv/h流速洗脫，收集洗脫液。
所述步驟(5)中，取洗脫液減壓濃縮，真空干燥或者冷凍干燥，粉碎，得提取物；或者進行噴霧干燥，得提取物。
作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，所述制備方法的具體操作步驟如下：
(1)按照所述重量份準備各原料藥；
(2)取上述原料，加入藥材重量8～12倍量的20％～40％乙醇，浸泡1h，第一次提取1h～2h，濾過，藥渣加入6～10倍量的20％～40％乙醇，繼續(xù)提取0.5h～1.5h，濾過，合并濾液，得提取液；
(3)取提取液濃縮至料液比1:1～1:2，在60℃～65℃下加入ztc1+1天然澄清劑b組分，用量為濃縮后提取液體積的5％～9％，吸附澄清后冷藏靜置12h～48h，取上清液離心，濾過，濾液加入澄清劑a組分，用量為b組分的0.5倍，靜置4h，濾過，得精制液；
(4)取精制液通過處理好的d101型大孔吸附樹脂柱，用10％～50％乙醇，3～5bv洗脫量，2bv/h流速洗脫，收集洗脫液；
(5)取洗脫液減壓濃縮，真空干燥或者冷凍干燥，粉碎，得提取物；或者進行噴霧干燥，得提取物；
作為本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方式，所述制備方法的具體操作步驟如下：
(1)按照所述重量份準備各原料藥；
(2)取上述原料，加入10倍量的30％乙醇，浸泡1h，第一次提取1.5，濾過，藥渣加入8倍量的30％乙醇，繼續(xù)提取1h，濾過，合并濾液，得提取液；
(3)取提取液濃縮至料液比1:1，在60℃下加入ztc1+1天然澄清劑b組分，同時攪拌，用量為7％，吸附澄清后冷藏靜置24h，取上清液離心，濾過，濾液加入澄清劑a組分，用量為b組分的0.5倍，靜置4h，濾過，得精制液；
(4)取精制液通過處理好的d101型大孔吸附樹脂柱，用30％乙醇，3bv洗脫量，2bv/h流速洗脫，收集洗脫液；
(5)取洗脫液減壓濃縮，真空干燥或者冷凍干燥，粉碎，得提取物；或者進行噴霧干燥，得提取物。
本發(fā)明還有一個目的在于，提供上述朝藥復方提取物在制備防治dkd的藥物中的應用。
上述應用中，所述防治dkd的朝藥復方提取物加入或者不加入藥學上可以接受的輔料，制備成臨床上可以接受的制劑。
本發(fā)明所述藥學上可以接受的輔料，可以包括但不限于：
稀釋劑或填充劑：如淀粉、糊精、預膠化淀粉、乳糖、微晶纖維素、蔗糖、甘露醇、山梨醇、無機鹽類中的一種或多種；
潤濕劑：如蒸餾水、乙醇、不同濃度的乙醇溶液；
粘合劑：淀粉漿、纖維素的衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素鈉溶液、明膠、蔗糖中的一種或多種；
崩解劑：如干淀粉、低取代羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、泡騰崩解劑中的一種或多種；
潤滑劑：如聚乙二醇、微粉硅膠、硬脂酸鎂、滑石粉、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇、氫化植物油中的一種或多種；
矯味劑：如甜味劑、香料、香精中的一種或多種。
本發(fā)明的有益技術效果在于：
(1)提供了一種防治dkd的朝藥復方提取物，該提取物主要由特定的有效組分按特定的配比構成，并呈現(xiàn)出最佳藥理活性。經(jīng)細胞實驗證明，本發(fā)明提取物用于高糖誘導的hk-2細胞后，增加了細胞的sod活性、減少了mda的產(chǎn)生，而且可降低hk-2細胞的α-sma的表達。提示該提取物可通過抑制高糖誘導的hk-2細胞氧化應激和腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，從而改善腎纖維化，并提高腎功能。
(2)本發(fā)明提取物提取工藝中，以主要成分為指標篩選出適當?shù)奶崛∪軇?，在盡可能提高有效成分提取率的同時兼顧成分協(xié)同效應，從而提高療效、節(jié)約中藥資源。原料藥中，葛根的黃酮類化合物具有顯著降血糖作用；黃芩主要包括黃酮類化合物，其中黃芩苷可顯著降低紅細胞山梨醇含量，能抑制誘導多種糖尿病慢性綜合并發(fā)癥的醛糖還原酶；山藥的主要有效成分為山藥多糖，具有降血糖作用；五味子中的五味子油可增加sod，清除機體內(nèi)自由基，減少脂質(zhì)過氧化，減少胰島β細胞損傷；桔梗主要含有皂苷類成分，可抑制血糖升高；升麻中阿魏酸類化合物阿魏酸鈉有減少尿蛋白的作用；白芷中的白芷香豆素可起到降低血壓的作用；麥冬多糖可以保護且修復損傷的胰島β細胞，降低血糖；綜上所述，本發(fā)明選用總黃酮、總多糖及總皂苷為提取工藝中的含量測定指標。
(3)本發(fā)明提取物精制工藝中采用“ztc1+1”天然吸附澄清劑，可以去除提取液中鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、膠體等無效成分，對黃酮、生物堿、多糖、皂苷類、萜類、維生素等有效成分無影響。該方法可以顯著降低提取物雜質(zhì)含量，為后續(xù)工藝提供了方便，且具有安全無毒、無異味、不殘留、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
(4)本發(fā)明提取物有效組分分離純化工藝中采用d101型大孔吸附樹脂柱，可兼顧黃酮、皂苷、生物堿等多種有效組分。大孔吸附樹脂(macroprousadsorptionresin,mar)是非離子型高分子吸附劑，具有多孔網(wǎng)狀結構和較大的比表面積。將藥液通過相應型號樹脂柱，利用物理吸附法，可有選擇性地吸附其有效成分，去除無效成分，富集有效組分。mar具有多種類型，根據(jù)不同的單體分子結構和極性，可分為非極性、中極性和極性三類，每種類型具有不同的型號。d101型mar可兼顧黃酮、皂苷、生物堿等多種有效組分的分離純化。本發(fā)明選用d101型mar對精制液進行分離純化，以黃酮、多糖及皂苷為測定指標，對洗脫后得到的組分進行含量測定。
主要藥效學實驗顯示，本發(fā)明提取物具有控制血糖、抑制腎臟異常增大、組織損傷修復、控制小鼠過氧化損傷、抑制小鼠血清腫瘤壞死因子α的作用，并呈現(xiàn)量效關系。
具體實施方式
以下結合實驗例和實施例對本發(fā)明進行更為詳細的說明。
實驗例1提取工藝研究
本實驗設計水提、醇提二種提取方法進行提取，以總黃酮、總多糖及總皂苷含量為考察指標，優(yōu)化提取工藝參數(shù)。
1.1原料藥成分分析
原料藥中葛根的黃酮類化合物葛根素對血液中的血糖含量有明顯地降低作用，可預防治療糖尿病。黃芩主要包括黃酮類化合物，其中黃芩苷可顯著降低糖紅細胞山梨醇含量，能抑制誘導多種糖尿病慢性綜合并發(fā)癥的醛糖還原酶。山藥的主要有效成分為山藥多糖，具有顯著的降血糖作用。五味子中的五味子油可增加sod，清除機體內(nèi)自由基，減少脂質(zhì)過氧化，減少胰島β細胞損傷。桔梗主要含有皂苷類成分，桔梗提取物可抑制血糖升高。升麻中阿魏酸類化合物阿魏酸鈉有減少尿蛋白的作用。白芷中的白芷香豆素可起到降低血壓的作用。麥冬多糖在某種程度上可以保護且修復損傷的胰島β細胞，可降低血糖。綜上所述，本研究選用總黃酮、總多糖及總皂苷為含量測定指標。
1.2總黃酮的含量測定
采取紫外分光光度法，測定復方提取液中總黃酮的含量。
1.2.1溶液配制
對照品溶液：精密稱量蘆丁對照品適量，用甲醇溶解，配成濃度為0.2mg/ml的對照品溶液。
供試品溶液的制備：精密量取待測品1ml，用提取溶液稀釋10倍，搖勻，即得供試品溶液。
1.2.2檢測波長的確定精密量取蘆丁對照品溶液2ml，置于25ml容量瓶中，加水至6ml，加入1.0ml5％亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6min，加入1.0ml10％硝酸鋁溶液，搖勻放置6min，繼續(xù)加入10ml5％氫氧化鈉試液，搖勻，加水定容，混勻后放置15min，以0.0ml對照品溶液為空白，于紫外可見分光光度計200-800nm處，測吸光度值。
測定結果表示在510nm處對照品溶液有最大吸收,故選擇510nm作為測定波長。
1.2.3線性關系考察精密量取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于25ml量瓶中，按1.2.2項下方法測定其吸光度值，以吸光度為縱坐標(a)，對照品濃度為橫坐標(μg/ml)，繪制標準曲線。得線性回歸方程為：y＝0.0008x+0.0029,r＝0.9998。結果表明，總黃酮濃度在115～690μg/ml范圍內(nèi)與吸光度值線性關系良好。
1.2.4精密度考察精密量取蘆丁對照品溶液2ml，按1.2.2項下方法重復5次測定吸光度，考察儀器的精密性。結果平均吸光度值為0.213，rsd值為0.281％。表明儀器精密性良好。
1.2.5穩(wěn)定性考察精密量取樣品溶液2ml，按1.2.2項下方法操作，在0，2，4，8，10，12h測定吸光度。結果平均吸光度值為0.560，rsd值為1.338％。表明待測樣品液在一定時間內(nèi)穩(wěn)定。
1.2.6重復性考察分別精密量取樣品溶液2ml5份，按1.2.2項下的方法測量吸光度值，驗證方法的重復性。結果rsd值為0.905％。表明該法重復性良好。
1.2.7加樣回收率考察量取已知含量樣品溶液6份，分別精密加入適量蘆丁對照品，制備不同含量的供試品溶液，計算回收率，結果總黃酮平均回收率為99.56％，rsd＝0.74％，表明本實驗法具有較好的準確度及可行性。
1.3總多糖的含量測定
采用蒽酮-硫酸比色法，雖然蒽酮-硫酸試劑不穩(wěn)定，但優(yōu)于苯酚-硫酸比色法，苯酚更容易氧化，本實驗顯色劑現(xiàn)用現(xiàn)配，可避免顯色劑被氧化。
1.3.1溶液的配制
蒽酮-硫酸溶液：量取蒽酮0.2g，加濃硫酸100ml，混勻即可(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
葡萄糖對照品溶液：精確稱取葡萄糖對照品100.0mg，置100ml容量瓶中,蒸餾水溶解稀釋至刻度，從中精密量取10ml，置100ml量瓶中，繼續(xù)稀釋至刻度，搖勻，即得。
供試品溶液：將提取液減壓濃縮至500ml，待冷卻至室溫后，加入乙醇至醇含量在80％以上，不斷攪拌，現(xiàn)象有大量沉淀生成，靜置12h，離心，收集沉淀，沉淀用蒸餾水溶解并配成溶液，濾過，濾液定容至1000ml，搖勻，即得。
1.3.2檢測波長的確定精確量取1ml葡萄糖對照品溶液，置于10ml具塞試管中，加入5ml蒽酮試劑，混勻,加塞密封，置于沸水浴中8min，取出流水沖洗冷卻，室溫靜置10min。以未加葡萄糖的溶液為空白，于400-700nm波長范圍掃描。
測定結果表示，580nm處對照品溶液有最大吸收，所以選擇580nm作為測定波長。
1.3.3線性關系考察量取0.1，0.3，0.5，0.7，0.9ml葡萄糖對照品溶液，加水補足至1ml(冷水中進行)，搖勻，分別置10ml具塞試管中，按1.3.2項下方法測定其吸光度值，以吸光度為縱坐標(a)，對照品濃度為橫坐標(μg/ml)，繪制標準曲線。得回歸方程為：y＝0.0069x-0.0128，r＝0.9998。結果表明，總多糖濃度在10.4-93.6μg/ml范圍內(nèi)與吸光度值線性關系良好。
1.3.4精密度考察精密量取葡萄糖對照品溶液1ml，按1.3.2項下方法，重復測定5次，測定吸光度，計算rsd值，考察儀器的精密性。結果平均吸光度值為0.827，rsd值為0.061％。表明儀器精密性良好。
1.3.5穩(wěn)定性考察精密量取供試品溶液1ml，按1.3.2項下方法操作，分別于0，2，4，8，10，12h，測定吸光度，結果平均吸光度值為0.708，rsd值為0.509％。結果表明，溶液在一定時間內(nèi)穩(wěn)定。
1.3.6重復性考察精密量取同一批供試品溶液，按1.3.2項下的方法測量吸光度值，驗證方法的重復性。結果rsd值為0.296％。表明該方法重復性良好。
1.3.7加樣回收率考察量取已知含量的樣品溶液6份，分別精密加入適量葡萄糖對照品，制備不同含量的供試品溶液，計算回收率，結果總多糖平均回收率為99.43％，rsd＝0.42％，表明本實驗法具有較好的準確度及可行性。
1.4總皂苷的含量測定
對待測樣品萃取后得到的皂苷類成分，采用紫外分光光度法，測定其吸光度值。
1.4.1溶液的配制
對照品溶液：精密稱取三七皂苷標準品5mg，置于25.0ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即三七皂苷濃度為0.2mg/ml。
供試品溶液：提取液減壓濃縮至500ml，從中精密量取10ml，置于分液漏斗中，加水至25ml，進行萃取。取水飽和正丁醇加至分液漏斗中，振搖萃取3次，每次20ml，分取正丁醇液，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次20ml，分取正丁醇液蒸干，甲醇溶解其殘渣，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
1.4.2檢測波長的確定精密量取三七皂苷對照品溶液1.0ml，置于10ml具塞試管中，在熱水浴中蒸干溶劑，精密量取0.2ml5％香草醛-冰乙酸溶液，再加入0.8ml高氯酸，混勻，使殘渣全部溶解，置于60℃水浴中，加熱10min后取出于冰浴冷卻，加入5.0ml冰乙酸，搖勻后，立即于400-700nm處波長范圍掃描。
測定結果表示對照品溶液在560nm處有最大吸收，所以選擇560nm作為測定波長。
1.4.3線性關系考察量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml三七皂苷對照品溶液，于10ml具塞比色管中按1.4.2項下方法測定其吸光度值，以吸光度為縱坐標(a)，對照品濃度為橫坐標(μg/ml)，繪制標準曲線。得回歸方程為：y＝0.0039x-0.0298，r＝0.9994。結果表明總多糖濃度在19.2～96μg/ml范圍具有較好的線性關系。
1.4.4精密度考察精密量取三七皂苷對照品溶液1ml，按1.4.2項下方法重復測定5次，測定吸光度，計算rsd值，考察儀器的精密性。結果平均吸光度值為0.301，rsd值為0.133％。表明儀器精密性良好。
1.4.5穩(wěn)定性考察精密量取供試品溶液1ml，按1.4.2項下方法操作，分別于0，2，4，8，10，12h，測定吸光度，結果平均吸光度值為0.483，rsd值為1.066％。表明待測樣品液在一定時間內(nèi)穩(wěn)定。
1.4.6重復性考察精密量取同一批供試品溶液5份，按1.4.2項下的方法測量吸光度值，驗證方法的重復性。結果rsd值為0.234％，表明該方法重復性良好。
1.4.7加樣回收率考察量取已知含量的樣品溶液6份，分別精密加入適量三七皂苷對照品，制備不同含量的供試品溶液，計算回收率，結果總皂苷平均回收率為100.13％，rsd＝0.67％，表明本實驗法具有較好的準確度及可行性。
1.5影響提取工藝的因素考察
1.5.1提取溶劑的選擇以總多糖、總黃酮及總皂苷吸光度值作為考察指標，提取溶劑選擇水、30％、80％乙醇，采用水煎煮法和加熱回流法進行提取。取單倍處方量藥材，加12倍溶劑浸泡1h，加熱回流1.5h，濾過，藥渣再用10倍量溶劑加熱回流1h，濾過，合并2次濾液，定容至1400ml，最終減壓濃縮至500ml。各取1ml提取濃縮液，測定3種組分的吸光度，結果見表1。結果表明，采用高濃度乙醇時，多糖的提取量低，以水為溶劑皂苷提取量低，以低濃度乙醇為溶劑可以兼顧總黃酮、總多糖及總皂苷的提取量，故確定以30％乙醇為提取溶劑。
表1不同溶劑提取各組分吸光度測定結果(
1.5.2浸泡時間與溶劑吸收率的考察精密稱取處方量藥材飲片，洗凈，加溶劑浸泡，每隔20min稱量藥渣重量，至吸濕增重無顯著變化為止。結果表明藥材在經(jīng)過60min的浸泡后，溶劑吸收達到飽和，吸水率為84.71％。
1.6提取工藝參數(shù)優(yōu)化
1.6.1正交試驗設計選用正交設計實驗，以供試品中總黃酮、總多糖和總皂苷吸光度值為指標，確定提取工藝參數(shù)。提取時間和溶劑用量被確認為影響提取工藝的主要因素，故最終采用l9(32)正交設計。正交試驗因素水平設計見表2，正交實驗安排及結果見表3。
表2正交試驗設計
表3正交試驗結果表
1.6.2正交實驗結果分析以各實驗組總黃酮、總多糖和總皂苷的含量為指標進行分析，方差分析結果見表4～6。結果，因素b對總黃酮提取量有顯著性影響，因素a對總皂苷有顯著性影響，因素a、b對總多糖提取量均無顯著性影響；多水平均值檢驗結果表明，對總黃酮提取量的影響a2>a1>a3，a1與a2間無顯著性差異；b1>b2>b3，b1與b2間無顯著性差異；對總多糖的影響a1>a2>a3，a1與a2無顯著性差異；b1>b3>b2，b1與b3間無顯著性差異；對總皂苷的影響a2>a1>a3，a1與a2無顯著性差異；b2>b1>b3，b1與b2間無顯著性差異。綜合考慮能源消耗和工作量以及提取時間和溶劑用量對三種考察指標的影響，確定的最佳提取方案為a2b2，即溶劑用量為10，8倍；煎煮時間為90min，60min。
表4總黃酮方差分析結果
表5總多糖方差分析結果
表6總皂苷方差分析結果
1.7驗證性實驗
稱取處方量藥材，按正交實驗確定的最佳提取工藝進行提取。做3次平行試驗，測得樣品中總黃酮總量為574.80±0.12μg/ml；總多糖的含量56.11±0.21μg/ml；總皂苷總量為107.53±0.26μg/ml與正交實驗最大值594.55μg/ml(abs為0.764)、56.51μg/ml(abs為0.699)、108.32μg/ml(abs為0.747)相近。結果表明優(yōu)選的最佳提取工藝相對穩(wěn)定，具有可行性。
1.8小結
本發(fā)明提取物的效成分總黃酮、總多糖及總皂苷在相關文獻報道中均可降低血糖濃度，在提取時應同等考慮，故以三者含量為指標進行優(yōu)選，確定提取工藝參數(shù)。提取工藝參數(shù)為：以30％乙醇為溶劑，回流提取2次，溶劑用量為藥材量的10倍、8倍，提取時間為1.5h、1h，即得提取液。
實驗例2精制工藝研究
2.1提取液制備
按比例稱取原料，照實驗例1所述提取工藝參數(shù)提取，得提取液。
2.2精制工藝研究
采用“ztc1+1”天然吸附澄清劑，可以去除中藥提取液中鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、膠體等無效成分，對黃酮、生物堿、多糖、皂苷類、萜類、維生素等有效成分無影響。該方法可以顯著降低提取物雜質(zhì)含量，為后續(xù)工藝提供了方便，且具有安全無毒、無異味、不殘留、經(jīng)濟實用等優(yōu)點，故選用ztc1+1天然吸附澄清劑對藥材提取液進行精制處理。
2.2.1澄清劑的配制
a組分：稱量10ga組份，加入少量蒸餾水，持續(xù)攪拌成糊狀，加蒸餾水至1000ml，靜止24h，攪拌，配制成1％粘膠液。
b組分：稱量10gb組份，配制1％醋酸1000ml，將少量的1％醋酸先加至b組份中，持續(xù)攪拌成糊狀，再加入剩余的1％醋酸，靜止24h，攪拌，配制成1％粘膠液。
2.2.2吸附澄清法實驗方案設計吸附澄清效果受多方面因素影響，其中提取液濃縮程度、藥液溫度、吸附澄清劑的用量、加入澄清劑時的攪拌速度，在很大程度上會影響吸附澄清的效果。在實際生產(chǎn)過程中，藥液的溫度通常在50℃～80℃；吸附澄清劑的用量普遍在藥液總體積的3％～8％，需要通過觀察澄清過程中，藥液出現(xiàn)的絮狀沉淀量及其澄明度來確定最終用量。本實驗主要考察因素為藥液的不同濃縮程度、澄清劑的用法用量、藥液溫度，通過觀察藥液精制前后的澄明度來確定最優(yōu)方案。
2.2.3吸附澄清劑的用法用量對澄清工藝的影響
方案1：只加入a組分(藥液總體積的8％)，靜置24h，濾過。
方案2：只加入b組分(藥液總體積的8％)，靜置24h，濾過。
方案3：先加入a組分(藥液總體積的8％)，靜置24h，濾過后加入b組分(a組分用量的0.5倍)，靜置6h，濾過。
方案4：先加入b組分(藥液總體積的8％)，靜置24h，濾過后加入a組分(b組分用量的0.5倍)，靜置6h，濾過。
分別按上述方案操作，結果表明，吸附澄清劑的用法對澄清效果影響較大。精制后的澄明度結果為4>2>3>1，故選擇方案4，即先加b組分，再加a組分。由于a組分對藥液的澄清效果影響較小，所以本實驗只考察b組分的用量即可。
吸附澄清劑b組分用量為7％和8％時均達到使藥液澄清的效果，從生產(chǎn)實際角度考慮，吸附澄清劑b組分用量選為7％，a組分為b組分用量的0.5倍即可。
2.2.4藥液濃縮程度對澄清工藝的影響將提取液濃縮至不同程度(以相當于原料的料液比表示)，加入澄清劑，靜置24h觀察結果。結果表明，相同條件下，藥液濃縮至料液比為1:1時澄清效果最佳。
2.2.5溫度對澄清工藝的影響取料液比1:1的濃縮提取液，保持不同溫度下加入澄清劑，靜置24h觀察結果。結果表明，相同條件下，藥液溫度在60℃對澄清效果最佳。
2.3精制前后有效成分保留率的考察
采取上述吸附澄清工藝參數(shù)對提取液進行精制，測定精制前后提取液的浸膏得率、總黃酮含量、總多糖、總皂苷含量，結果見表7。結果表明，精制前后藥液的浸膏得率顯著下降，總黃酮、總多糖及總皂苷的平均含量無顯著變化。
表7提取液精制前后有效成分保留率及浸膏得率
2.4小結
本實驗選用吸附澄清法精制提取液，考察結果顯示，在提取液中加入ztc1+1吸附澄清劑后顯著提高了提取液的澄明度，降低了浸膏得率，對有效成分的含量無顯著性影響。
最優(yōu)吸附澄清工藝參數(shù)為：藥液濃縮料液比為1:1，60℃下加入吸附澄清劑b組分，用量為7％，靜置，濾過，濾液加入a組分(用量為b組分的0.5倍)，靜置，濾過，即得精制液。
實驗例3有效組分的分離純化工藝參數(shù)研究
mar是非離子型高分子吸附劑，具有多孔網(wǎng)狀結構和較大的比表面積。將藥材提取液通過相應型號樹脂柱，利用物理吸附法，可有選擇性地吸附其有效成分，去除無效成分，富集有效組分。mar具有多種類型，根據(jù)不同的單體分子結構和極性，可分為非極性、中極性和極性三類，每種類型具有不同的型號。d101型mar可兼顧黃酮、皂苷、生物堿等多種有效成分的分離純化。故本實驗選用d101型對精制液進行分離純化，以黃酮、多糖及皂苷為測定指標，對洗脫后得到的組分進行含量測定。
3.1d101大孔吸附樹脂的預處理
(1)將d101型mar用95％的無水乙醇浸泡24h，并不時攪拌
(2)按照濕法裝柱法裝入層析柱中，用去離子水進行洗脫，洗脫流速設置為2bv/h，流出液與水體積比為1:5的混合液不再渾濁時，繼續(xù)用水洗至無醇味。
(3)5％hcl通過樹脂柱，用2bv洗脫量，以2～3bv/h浸泡2～4h，水洗至中性
(4)2％naoh通過樹脂柱，用2bv洗脫量，以2～3bv/h浸泡2～4h，水洗至中性后備用。
3.2精制液中有效組分的分離及含量測定
照“實驗例2”方法制備精制液，通過處理好的d101型mar柱，用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇及100％乙醇，3bv洗脫量依次洗脫，得到7組有效組分，標記為1-7號。7組有效組分中的黃酮、多糖及皂苷的含量如表8所示。結果表明，第5、6、7組有效組分中未見多糖成分；1～4組有效組分中總多糖、總黃酮及總皂苷含量比分別為1:0.012:0.067、1:0.098:0.072、1:1:0.238、1:0.727:0.273；5～7組有效組分總黃酮與總皂苷含量比分別為1:0.833、1:0.974、1:0.3。
表87組組分中的黃酮、多糖及皂苷的含量
3.3小結
實驗選用d101型mar對精制液中黃酮、多糖及皂苷進行初步分離，達到了較好的分離純化有效部位組分的效果，得到了7組有效組分，標記為1-7號，并提供了主要工藝參數(shù)。實驗例4不同有效組分對氧化應激的影響研究
4.1溶液配制
(1)胎牛血清(fbs)滅活：55℃滅活30min
(2)10×pbs緩沖液的配制：nacl80g、kcl2g、na2hpo4·12h2o15.12g、kh2po42g溶于1000ml去離子水中，ph調(diào)至7.4后，分裝、高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)低糖培養(yǎng)液的配制：取不含血清的rpmi1640培養(yǎng)液與無糖rpmi1640培養(yǎng)基等比例混合，加入fbs及青鏈霉素配制成含10％fbs、100u/l青鏈霉素、葡萄糖濃度為5.5mmol/l的混合培養(yǎng)液。
(4)高糖培養(yǎng)液的配制：用1×pbs溶解無水葡萄糖，使葡萄糖溶液濃度為2.45mol/l，0.22μm濾過除菌，4℃保存。使用時與低糖培養(yǎng)液按照1:100比例稀釋。
(5)甘露醇溶液配制：用1×pbs溶解甘露醇，使甘露醇溶液濃度為2.45mol/l，0.22μm濾過除菌，4℃保存。使用時與低糖培養(yǎng)液按照1:100比例稀釋。
(6)mda試劑盒組成與配制：
試劑一：液體20ml×1瓶4℃保存。
試劑二：液體12ml×1瓶，用時加340ml雙蒸水混勻，4℃冷藏(避免碰到皮膚上)
試劑三：粉劑×1支，溶于90℃～100℃的雙蒸水中，充分溶解后，加雙蒸水補足至60ml，再加冰醋酸60ml，混勻，避光冷藏。
標準品：10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml×1瓶，4℃冷藏。
(7)t-sod試劑盒組成與配制：
試劑一：用雙蒸水稀釋貯備液，定容至100ml，4℃保存。
試劑二：液體10ml×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體10ml×1瓶，4℃保存。
試劑四：貯備液與稀釋液按1:14進行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃保存。
試劑五：粉劑×1支，使用70℃～80℃雙蒸水進行溶解，充分溶解后，加雙蒸水補足至75ml，避光4℃冷藏。
試劑六：粉劑×1支，用時溶于75ml雙蒸水中，避光4℃保存。
顯色劑：試劑五：試劑六：冰乙酸按3:3:2的體積比配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光4℃保存。
4.2細胞復蘇
所用腎小管上皮細胞(hk-2)購自上海博谷生物科技有限公司。取出凍存的hk-2細胞立即置于37℃水浴中，融化后放在細胞超凈臺上，將凍存液移至t25中，加入5ml低糖rpmi1640培養(yǎng)液，注意緩慢滴加培養(yǎng)液，過程中前后左右輕輕晃動，在顯微鏡下觀察后放于37℃，5％二氧化碳條件下進行培養(yǎng)。
4.3細胞傳代
細胞覆蓋率達80％以上時，即可進行傳代。從培養(yǎng)箱取出細胞，吸去原有培養(yǎng)基，用pbs清洗三次，加入胰酶在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中消化3min，加入相應體積培養(yǎng)液，吹打后移至離心管中，3000×rpm離心3min。棄去上清液，加入等體積的培養(yǎng)液均勻打散細胞，吹打后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，放于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
4.4細胞凍存
將處于對數(shù)生長期的細胞從培養(yǎng)箱中取出，吸去原有培養(yǎng)基，加入pbs洗三次，加入胰酶消化3min，消化后加入培養(yǎng)基，吹打后轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄去上清液，加入fbs與dmso的混合液，二者比例為900μl：100μl，吹打后分裝至滅菌后的凍存管中，置于-20℃、30min，-80℃過夜，取出放于液氮罐中長久保存?zhèn)溆谩?/p>
4.5細胞毒性測定
4.5.1試樣處理將通過大孔吸附樹脂柱得到的7種有效組分和精制液冷凍干燥，稱取各有效組分及精制液凍干粉20mg，1、2號組分用1ml水溶解，3號～7號以及精制液凍干粉用1mldmso溶解，標記為試樣1～8號，作用于高糖誘導的hk-2細胞。每種試樣按照一定濃度梯度作用于正常hk-2細胞進行細胞毒性測定，濃度梯度設置為3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml。
4.5.2mtt測定采用mtt法評價各組試樣在hk-2細胞中的細胞毒性。將hk-2細胞種到96孔板中，密度為1×104個/孔，在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h后，每組試樣按“4.5.1”項下的濃度梯度加入孔板中，按上述條件培養(yǎng)24h。每孔加入100μlmtt溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄上清液后，再加入100μl/孔dmso溶解結晶，避光振搖10min。選用570nm波長測定每孔的吸光度。
4.6氧化應激試驗
4.6.1細胞培養(yǎng)及分組根據(jù)mtt測定結果，每組試樣選擇合適的濃度進行氧化應激實驗。將細胞分為11組，分別為對照組(ng)、滲透壓對照組(man)、高糖組(hg)、給藥組(1～8號試樣)。待細胞覆蓋率達80％以上且狀態(tài)良好時，按照以上分組加入不同試樣進行干預。在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h后，取細胞上清液測定mda含量及sod酶活性。
4.6.2細胞上清液mda測定
(1)測定原理及意義：mda是過氧化脂質(zhì)降解的產(chǎn)物，可與硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid，tba)縮合，形成紅色產(chǎn)物。測試mda的量可間接反映由脂質(zhì)過氧化引起細胞損傷的程度。
(2)操作方法：按照表9操作加樣。渦旋混勻，用保鮮膜扎緊試管口，針頭刺一小孔，用鍋開蓋煮沸40min，取出流水冷卻，532nm處測定吸光度值。按照公式mda含量(nmol/ml)＝(測定od值-對照od值)/(標準od值-空白od值)計算。
表9mda測定操作表
4.6.3細胞上清液sod活力測定
(1)測定原理及意義：sod能清除超氧陰離子自由基(o2-﹒)，避免細胞受損傷。o2-﹒可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，與顯色劑反應顯紫紅色。若測試樣品中含sod，o2-﹒可被sod抑制，進而減少了亞硝酸鹽的產(chǎn)生。酶標儀測定吸光度，不同樣品的吸光度值有差異且均低于對照管的吸光度值，通過公式即可求出sod的活力。
(2)操作方法：按照表10操作加樣。渦旋混勻，室溫放置10min，于550nm處測定吸光度值。按照公式總sod活力(u/ml)＝(對照od值-測定od值)/對照od值/50％×反應體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)計算。
表10sod測定操作表
4.7統(tǒng)計分析
用graphpadprism5.0程序(graphpadsoftware，usa)進行統(tǒng)計分析，p<0.05具有顯著性差異。
4.8實驗結果
4.8.1細胞毒性試驗本實驗采用mtt法，測定細胞存活率，考察試樣對細胞的毒性。在hk-2細胞系中，1～8號試樣在不同濃度下都顯示出較低的細胞毒性。細胞存活率隨著濃度的升高而下降。
4.8.2試樣對高糖誘導hk-2細胞mda的影響高糖刺激hk-2細胞24h后，其上清液mda含量與ng相比顯著升高(p<0.05)。為排除氧化應激是由于高糖的高滲透壓所引起，本實驗設立了man，man組細胞上清液的mda含量與ng組比較無顯著性差異。與hg比較，給藥組細胞上清mda含量均下降，給藥濃度50μg/ml的2～8號均有顯著性差異(p<0.05)，結果見表11。
表11試樣對高糖誘導的hk-2細胞mda影響(
#p<0.05vsng；*p<0.05,**p<0.01vshg.
4.8.3試樣對高糖誘導hk-2細胞sod活力的影響高糖刺激hk-2細胞24h后，與ng組比較，man組sod活力無顯著性差異，hg組sod含量顯著下降(p<0.05)。與hg相比，除濃度為200μg/ml的6號之外，其他給藥組的sod含量均上升，其中25μg/ml的2號、3號和4號均有極顯著性差異(p<0.01)，結果見表12。
表12試樣對高糖誘導的hk-2細胞sod活力的影響(
#p<0.05vsng；*p<0.05,**p<0.01vshg.
4.9小結
dkd主要是持續(xù)處在高糖狀態(tài)下的血管產(chǎn)生微血管病變所致。研究發(fā)現(xiàn)，高糖引起的微血管病變多數(shù)是由于自由基過多產(chǎn)生，且清除自由基的酶如gsh-px、sod、cat、過氧化物酶(peroxidase，pod)等活性降低，導致不能及時清除的自由基在體內(nèi)積儲，基底膜被脂質(zhì)過氧化物損傷，進而減弱腎臟功能。
本實驗選擇mda和sod活力作為檢測氧化應激的指標。通過測定mda的含量，以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，可以間接了解細胞受損程度。sod可清除致毒的超氧自由基。致病因子的作用下，會產(chǎn)生過多的超氧自由基或者降低sod活力，從而導致疾病的發(fā)生與發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導hk-2細胞，可升高細胞上清的mda含量且明顯降低sod活力，證實了高糖作用下hk-2的ros產(chǎn)生增多，脂質(zhì)過氧化程度提高，抗氧化能力降低。
本研究在高糖刺激hk-2中發(fā)現(xiàn)總提取物浸膏及各有效組分均具有使細胞上清液中的mda含量下降，sod活性升高的趨勢。綜合評價，在給藥濃度相同時有效組分2號、3號、4號對兩項指標結果影響最顯著。
實驗例5不同有效組分體外蛋白質(zhì)印跡(westernblot)檢測研究
5.1溶液配制
(1)10×電泳緩沖液(runningbuffer)的配制：分別精密稱取sds10g、tris30.28g、glycine144.14g，加ddw至1000ml，充分溶解混合后調(diào)節(jié)ph至8.3，室溫保存。
(2)轉(zhuǎn)印緩沖液(transferbuffer)的配制：分別精密稱取tris3.03g、glycine14.42g、甲醇200ml，加ddw至1000ml，充分溶解混合后調(diào)節(jié)ph至8.3，4℃保存。
(3)pbst緩沖液的配制：量取10×pbs緩沖液500ml，加ddw至4500ml，加入5mltween20，充分溶解，調(diào)節(jié)ph至7.4，最終定容到5000ml。
5.2總蛋白提取
將hk-2細胞按照2×105/孔的密度接種于6孔板，待細胞貼壁并且狀態(tài)良好時，根據(jù)氧化應激的結果選擇試樣的最佳濃度，按照“4.6.1”項下分組給樣。48h后棄去上清液，加入預冷的pbs輕輕清洗細胞，用細胞刮子收集細胞，放入1.5mltube中，4℃、15000rpm離心3min，棄上清。加入ripa裂解液及p8340(1‰，v/v)200μl，充分渦旋30min，4℃，15000rpm離心15min，收集上清液，置于-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>
5.3蛋白定量
采用bca法測定蛋白濃度。待測蛋白用pbs稀釋至20倍，標準品(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml)和稀釋后的樣品各加入3μl至96孔板中，每個樣品設3個復孔。再加入200μlbca工作液(試劑a：試劑b＝50：1)，充分混勻后放置于60℃烘箱孵育30min，冷卻后用酶標儀于562nm處測定樣品吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度。
5.4westernblot實驗
5.4.1聚丙烯酰胺凝膠電泳
(1)膠的制備：分離膠(2塊膠)的配制：加入40％acrylamide3.75ml、1.5mtris-hcl(ph8.8)3.6ml、10％sds150μl、ddw7.5ml、10％aps67.5μl、temed13.5μl配制成10％的分離膠；濃縮膠(2塊膠)的配制：加入40％acrylamide495μl、0.5mtris-hcl(ph8.8)1080μl、10％sds45μl、ddw2.835ml、10％aps45μl、temed9μl配制成5％的濃縮膠。
(2)灌膠與上樣：玻璃板用酒精清洗擦拭干凈后固定在膠架上，加入適量制備好的分離膠于玻璃板之間，用水飽和正丁醇液封。待分離膠聚合后，倒掉正丁醇，用蒸餾水清洗并用濾紙吸干。將制備好的濃縮膠灌入玻璃板之間，迅速插上干凈的梳子，注意避免產(chǎn)生氣泡。待濃縮膠完全凝固后，將梳子拔掉，用蒸餾水清洗梳子孔里的膠。將制膠器放入電泳儀中，加足夠的電泳緩沖液。上樣體積根據(jù)測出的蛋白濃度計算出來，加入適量的緩沖液，離心，渦旋，再離心后放入95℃金屬浴中加熱5min，使蛋白變性。待樣品冷卻后，排出加樣孔內(nèi)的氣泡即可上樣。
(3)電泳：上樣完畢后，接通電泳儀，起始電壓為80v，待樣品跑至濃縮膠與分離膠連接處時，升高電壓至100v。
5.4.2轉(zhuǎn)印將轉(zhuǎn)印夾、海綿、濾紙浸泡在transferbuffer中，兩張pvdf膜浸泡在甲醇中。電泳結束后，取出玻璃板，棄去濃縮膠，小心取出分離膠，按照海綿、濾紙、pvdf膜、膠、濾紙、海綿的順序放入轉(zhuǎn)印夾中，夾好趕走氣泡，放入轉(zhuǎn)印裝置中，加入轉(zhuǎn)印緩沖液使轉(zhuǎn)印夾完全浸沒，電壓調(diào)至30v、4℃冰箱過夜轉(zhuǎn)印。
5.4.3封閉及一抗的孵育取出轉(zhuǎn)印后的pvdf膜，放入5％的脫脂牛奶中，室溫下?lián)u床孵育1h。牛奶封閉后取出膜放在pbst中洗35min。在15min、10min、5min、5min的時間點換液。將一抗按照一定的比例進行稀釋，貼在洗后的pvdf膜上，4℃、搖床上孵育一夜。
5.4.4二抗的孵育一抗孵育后，按照上述方法洗膜。根據(jù)一抗的種類選擇二抗，按照一定的比例稀釋，貼在膜上室溫下?lián)u床孵育1h。孵育后將膜取出放在pbst中洗45min，在15min、10min、5min、5min、5min、5min時換液。
5.4.5顯影、定影顯色試劑按1:1比例混合，均勻鋪在膜上孵育1～2min后放入暗匣內(nèi)，暗室夾片一定時間后取出膠片，按照顯影液-水-定影液的順序進行洗片，再用清水漂洗后晾干。
5.4.6統(tǒng)計分析用quantityone(bio-rad公司)進行灰度分析，graphpadprism5.0程序(graphpadsoftware，usa)進行統(tǒng)計分析，p<0.05具有顯著性差異。
5.5實驗結果
α-sma是myof表型的特異性標志物，通過westernblot實驗，對dkd中α-sma的表達進行半定量分析。α-sma在對照組中蛋白微量表達，不同試樣干預48h后，man組與ng組比較，α-sma表達無顯著性差異，hg組與ng組比較α-sma表達顯著升高(p<0.01)；與hg組比較，給藥組α-sma表達均有極顯著性差異(p<0.01)，結果見表13。
表13試樣對高糖誘導hk-2細胞表達α-sma的影響(
#p<0.05vsng，*p<0.05；##p<0.01vsng，**p<0.01vshg.
5.6小結
在早期，dkd普遍認為是由于腎小球病變引起的，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)腎小球病變的同時也可能發(fā)生腎小管病變，而腎小管病變與糖尿病腎病的腎功能有更密切的關系。腎小管上皮細胞在尿糖、氧化應激、尿蛋白等刺激條件下可引起腎小管間質(zhì)纖維化。myof的累積是發(fā)展成為腎間質(zhì)纖維化的重要因素，而α-sma是myof的表型特征。α-sma是sma中最主要的肌動蛋白微絲，除血管外，在其他部位僅有微弱的表達，作為平滑肌的特征性標記物，α-sma反映了平滑肌數(shù)量以及收縮功能的改變，具有較強的合成膠原的能力，進而形成纖維化。體外培養(yǎng)高糖誘導的hk-2細胞中，α-sma蛋白表達顯著升高。多項研究顯示，高糖濃度為30mmol/l時，hk-2細胞tgf-β1表達顯著升高，而tgf-β1被公認為是致細胞纖維化的生長因子，故本實驗選取的高糖濃度為30mmol/l，作用于hk-2細胞來模擬dkd體內(nèi)的高糖環(huán)境。
本實驗選用30mmol/l的高糖作用于hk-2細胞48h，與正常組相比，α-sma蛋白表達顯著提高。為排除emt是由于高糖環(huán)境的高滲透壓所致，本研究設計man組，在相同滲透壓、相同培養(yǎng)時間的條件下培養(yǎng)hk-2細胞，結果表明，α-sma蛋白微量表達，與ng組比較無顯著性差異，故高滲透壓不能直接引起emt。研究表明有效組分作用于高糖誘導的hk-2細胞，與hg比較，給藥組α-sma表達顯著降低，結合臨床觀察和前期體內(nèi)實驗研究結果，提示本發(fā)明提取物可抑制rif的發(fā)生，對emt具有保護作用，從而提高腎功能，有效組分2號、3號、4號、5號、6號在較低劑量下具有顯著影響。
實施例1本發(fā)明提取物的制備
配方：
制法：
(1)原料準備：按配方劑量稱取原料，各原料質(zhì)量均應符合《中華人民共和國藥典》2015版(一部)的規(guī)定。
(2)原料提取：取上述原料，加入10倍量的30％乙醇，浸泡1h，第一次提取1.5h，濾過，藥渣加入8倍量的30％乙醇，繼續(xù)提取1h，濾過，合并濾液，得提取液。
(3)提取液精制：采用吸附澄清法進行精制，提取液濃縮至料液比1:1，在60℃下緩緩加入ztc1+1天然澄清劑b組分，同時攪拌，用量為7％，吸附澄清后冷藏靜置24h以上，取上清液離心，濾過，濾液加入澄清劑a組分(用量為b組分的1/2)，靜置4h，濾過，得精制液。
(4)有效組分分離純化：取精制液通過處理好的d101型mar柱，用30％乙醇，5bv洗脫量洗脫，收集洗脫液。
(5)洗脫液濃縮干燥：取上述洗脫液進行冷凍干燥，收集干燥物，即得。
實施例2本發(fā)明提取物分散片的制備
配方：
制法：
(1)原輔料過100目篩，按上述重量配比混勻；
(2)取混合物置于濕法制粒機中，以40％乙醇為潤濕劑，制軟材，制粒；
(3)濕顆粒干燥，整粒，得干顆粒，加入硬脂酸鎂，混勻，測定其流動性、粒度分布、含水量，得總混物料；
(4)取總混物料置于壓片機中，壓片，即得提取物分散片。
實施例3本發(fā)明提取物對糖尿病動物模型腎功能的影響
1實驗材料與試劑
1.1實驗動物6周齡，spf級，體重20±2g的昆明小鼠雄性80只。
1.2受試樣品受試樣品為根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的提取物(長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室制備)(批號：20151103、20151109、20151115)。制備工藝同實施例1。
1.3動物實驗室環(huán)境實驗環(huán)境為spf級動物實驗室，實驗環(huán)境溫度22±2℃，相對濕度57±2％,每3日清掃1次以保持籠內(nèi)清潔。
2實驗方法
普通飼料常規(guī)適應性飼養(yǎng)一周后檢測血糖和尿蛋白，均為陰性者用于實驗。隨機分為正常組10只和造模組70只。造模組小鼠禁食不禁水12h以上，以濃度為170mg/ml的stz溶液單次給予腹腔注射。給藥后72h，測定其空腹血糖值是否高于11.1mmol/l，若出現(xiàn)飲水量加大、排尿量加大并且血糖值高于11.1mmol/l的試驗小鼠視為模型成功。模型動物隨機分為低、中、高劑量組和對照組，每組10只。
3給藥劑量及指標測定
設置低、中、高三個劑量組，相當于人體口服劑量的5倍量、10倍量和20倍量，折算為灌胃劑量分別是65mg/kg、130mg/kg、260mg/kg；對照組和正常組灌胃10ml/kg的水，每天1次，連續(xù)灌胃28d。
3.1體重和血糖測定藥物灌胃4周后，停止灌胃治療，禁食、不禁水24h，收集24h內(nèi)的總尿量，然后稱體重及尾靜脈采血測小鼠空腹血糖。
3.2相對腎重測定稱量取小鼠的體重，解剖后取出右腎并精細稱重，相對腎重數(shù)值上等于腎重(mg)與體重(g)的比值。
3.3小鼠腎臟組織sod活性和mda含量的測定將小鼠處死后取出右側腎臟，利用生理鹽水清洗干凈腎臟，用濾紙吸干其上水分，用轉(zhuǎn)速3000-4000r/min的離心機將勻漿器搗勻后的組織離心，取其上清液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ勒赵噭┖羞M行進一步測定。
3.4小鼠血清tnf-α含量的測定小鼠眼眶取血3ml～5ml，此血液樣本置于室溫12h，用轉(zhuǎn)速為2500r/min的離心機離心10min，收集血清并做標記，于-70℃的低溫條件下保存?zhèn)溆?；依照試劑盒說明書，用酶標儀測tnf-α的值。
4實驗結果
4.1提取物對小鼠空腹血糖(fpg)的影響模型組與正常組比較有極顯著性差異，血糖值均高于11.1mmol/l，表明造模成功。給藥2周后給藥組血糖有所降低，4周后給藥組血糖顯著降低，與對照組相比均有極顯著性差異，并呈現(xiàn)量效關系，結果見表14。
表14提取物對小鼠空腹血糖(fpg)的影響(
注：##1.模型組與正常組比較有極顯著性差異：p＜0.01
**2.給藥組與對照組比較有極顯著性差異：p＜0.01
4.2提取物對小鼠腎重指數(shù)的影響模型組腎重指數(shù)與正常組比較均升高，具有極顯著差異，表明腎臟有不同程度的增大。給藥組腎重指數(shù)與對照組相比均降低，具有極顯著差異，給藥后模型動物腎臟增大的程度與未給藥的模型動物相比有所緩和，表明本提取物針對dkd所引起的腎臟異常增大有控制作用，結果見表15。
4.3提取物對小鼠腎臟sod活性的影響與正常組相比，模型組sod含量均降低，表明模型組均呈現(xiàn)不同程度腎臟組織損傷。給藥組的sod含量均高于對照組，且具有顯著性差異，表明提取物能夠?qū)kd小鼠氧化應激反應引起的小鼠腎臟組織損傷具有修復作用，并呈現(xiàn)量效關系，結果見表15。
4.4對小鼠腎臟mda含量的影響與正常組比較，模型組mda含量均升高。給藥組與對照組比較mda含量均降低，并存在顯著性差異，表明本提取物具有降低腎臟組織mda含量的作用，并呈現(xiàn)量效關系，結果見表15。
4.5對小鼠血清腫瘤壞死因子α含量的影響與正常組比較，模型組腎臟組織中小鼠血清腫瘤壞死因子α水平均明顯上升。給藥組與對照組比較tnf-α的含量明顯降低，均具有顯著性差異。表明，本提取物對dkd導致的腎臟組織中小鼠血清腫瘤壞死因子α含量異常升高具抑制作用，結果見表15。
表15提取物對小鼠腎臟各項指標的影響(
注：#1.模型組與正常組比較有極顯著性差異：p＜0.01
*2.給藥組與對照組比較有極顯著性差異：p＜0.01
5結果分析
本實施例結果表明，本發(fā)明提取物能夠降低血糖值，改善腎重指數(shù)，增加sod的活性，降低mda的含量，提示該提取物能夠保護并修復腎臟組織受到的氧化應激而帶來的病變傷害；提取物顯著降低了腎臟組織中血清腫瘤壞死因子α的含量，提示其可以通過降低血清腫瘤壞死因子α的含量，對dkd小鼠的腎臟組織產(chǎn)生保護作用。隨著給藥劑量的增加，對dkd模型的作用依次增強，說明該提取物對dkd的作用存在量效關系。
本發(fā)明的保護范圍不能認為只局限于上述具體實施方式及具體實例。對所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的基本前提下，還可以做出若干簡單推演或等同替換，這些等同替換方案仍然將被視為在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。