本發(fā)明涉及殺微生物劑領(lǐng)域，更具體地涉及楊梅素及其衍生物的新用途和一種抗hiv感染的殺微生物劑。

背景技術(shù)：

艾滋病(aids)是人免疫缺陷病毒(hiv)引起的病毒性傳染病，性傳播是hiv的主要傳播途徑，雖然理論上來說，預(yù)防hiv感染最好的手段是使用艾滋病疫苗；然而，艾滋病疫苗的研究還需要較長(zhǎng)時(shí)間的摸索，短期內(nèi)有效的艾滋病疫苗還難以問世。

殺微生物劑是一類含有抗hiv成分的凝膠、乳脂、栓劑、藥膜或海綿，在性交前置入陰道或肛門內(nèi)，以預(yù)防艾滋病病毒和其它性傳播疾病的性傳播，是一種可由女性所控制的預(yù)防hiv性傳播的有效措施，這對(duì)于女性地位比較低下的發(fā)展中國(guó)家(如大部分的非洲國(guó)家)預(yù)防艾滋病傳播有非常重要的意義。為此，殺微生物劑的研究開發(fā)已被聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織定為全球優(yōu)先發(fā)展的策略。

迄今為止，大約有20個(gè)殺微生物劑產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的各個(gè)階段，其中，大部分多聚陰離子類和表面活性劑類殺微生物劑因臨床抑制效果不甚理想，或存在一定的安全問題，均先后宣布失敗或被中止。

由于殺微生物劑的用藥部位為陰道或直腸，不能忽視精液對(duì)其藥效的影響。精液中存在淀粉樣纖維，促進(jìn)hiv的感染，在存在生理濃度精液衍生肽時(shí)，1到3個(gè)病毒顆粒就可導(dǎo)致hiv感染。其中，前列腺酸性磷酸酶(prostaticacidicphosphatase,pap)多肽片段(pap248-286)形成的淀粉樣纖維被命名為精液源性病毒感染增強(qiáng)因子(semen-derivedenhancerofvirusinfection,sevi)，sevi促進(jìn)hiv感染的作用機(jī)理主要是：1)富含陽離子氨基酸殘基的sevi能通過靜電作用降低hiv病毒顆粒與靶細(xì)胞之間的靜電排斥；2)sevi在人體體液中呈無序狀態(tài)，利于病毒顆粒與靶細(xì)胞膜相互作用；3)sevi直接捕獲hiv病毒顆粒，提高病毒在靶細(xì)胞表面沉降速度，促進(jìn)病毒與靶細(xì)胞吸附和融合。因此，在精液或pap248-286存在時(shí)，sevi會(huì)抑制殺微生物劑的抗hiv感染能力，這意味著，開發(fā)一種能拮抗sevi對(duì)hiv感染的增強(qiáng)能力，又具有抗hiv病毒活性的雙功能殺微生物劑，非常有現(xiàn)實(shí)意義。

楊梅素(myricetin，簡(jiǎn)稱myr)是一種黃酮類化合物，化學(xué)式為c15h10o8，存在于殼斗科、豆科、報(bào)春花科、葡萄科、菊科等植物中，現(xiàn)有研究表明，楊梅素具有抗腫瘤、降低神經(jīng)毒性、影響淋巴細(xì)胞活化與增殖、拮抗血小板活化因子、降血糖、抗氧化、保肝護(hù)肝等藥理學(xué)活性。另外，楊梅素來源廣泛，且相對(duì)價(jià)格低廉，安全可靠，有利于后續(xù)廣泛開發(fā)上市。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供楊梅素及其衍生物的新用途和一種抗hiv感染的殺微生物劑。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

楊梅素或楊梅素衍生物在預(yù)防hiv感染中的應(yīng)用。

作為上述應(yīng)用的進(jìn)一步限定，所述楊梅素衍生物為楊梅素在藥學(xué)上可以接受的鹽、脂及糖基化的衍生物。

一種抗hiv感染的殺微生物劑，其特征在于：含有楊梅素和/或楊梅素衍生物。

作為上述殺微生物劑的進(jìn)一步優(yōu)選，還含有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。

作為上述殺微生物劑的進(jìn)一步優(yōu)選，所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物為疊氮胸苷、雷特格韋、馬拉維若、替諾福韋、奈韋拉平、依法韋侖中至少一種。

作為上述殺微生物劑的進(jìn)一步優(yōu)選，楊梅素衍生物為楊梅素在藥學(xué)上可以接受的鹽、脂及糖基化的衍生物。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)楊梅素能單獨(dú)作為抗hiv感染的殺微生物劑。楊梅素能抑制pap248-286多肽自聚集形成sevi淀粉樣纖維；能夠劑量依賴性抑制sevi淀粉樣纖維的形成；能夠破壞已經(jīng)成熟的sevi結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致纖維二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變；在tzm-b1感染增強(qiáng)細(xì)胞模型上，還可直接阻斷sevi引起的hiv病毒感染。綜上所述，楊梅素能夠抑制sevi的形成，破壞成熟sevi的結(jié)構(gòu)，直接阻斷sevi引起的hiv感染增強(qiáng)，并且楊梅素本身還具有良好的抗hiv活性，可開發(fā)為具有拮抗sevi和抗hiv病毒的雙功能殺微生物劑，最大程度地避免因精液中淀粉樣纖維的存在而導(dǎo)致臨床療效不佳的可能。

(2)楊梅素能與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物(簡(jiǎn)稱，arvs)聯(lián)合作為抗hiv感染的殺微生物劑。在精液存在的條件下，楊梅素能分別與疊氮胸苷、雷特格韋、馬拉維若、替諾福韋、奈韋拉平、依法韋侖任意一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物協(xié)同抗hiv，可開發(fā)出含有楊梅素和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的多組分抗hiv感染殺微生物劑，同時(shí)作用于精液和病毒兩個(gè)方面，發(fā)揮更好的臨床抗hiv感染療效。

附圖說明

圖1：硫黃素t染色法檢測(cè)梅素對(duì)pap248-286自聚集形成sevi淀粉樣纖維的影響；

圖2：透射電子顯微鏡觀察楊梅素對(duì)pap248-286自聚集形成sevi淀粉樣纖維的影響；

圖3：圓二色譜法檢測(cè)楊梅素對(duì)成熟sevi二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞作用，其中，圖a、b、c分別為楊梅素處理1min、24h、48h的檢測(cè)結(jié)果；

圖4：tzm-b1細(xì)胞感染模型檢測(cè)楊梅素拮抗sevi增強(qiáng)hiv病毒感染的能力，其中，圖a、b分別為x4嗜性hiv病毒和r5嗜性hiv病毒感染的增強(qiáng)倍數(shù)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述。

需要說明的是，本實(shí)例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)驗(yàn)例1、硫磺素t染色法觀察楊梅素對(duì)sevi淀粉樣纖維形成的影響

(1)梯度稀釋的楊梅素(終濃度為75,37.5,18.75及0μg/ml)與3mg/mlpap248-286溶液混勻，置于恒溫振蕩儀中，37℃，1400rpm轉(zhuǎn)速下恒溫振蕩；

(2)于振蕩的不同時(shí)間點(diǎn)(0,6,12,18,24及48h)分別取出10μl樣品與190μl硫磺素t溶液混合，熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為440nm，發(fā)射波長(zhǎng)為485nm)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，75μg/ml的楊梅素可在48h內(nèi)完全抑制pap248-286自聚集形成sevi淀粉樣纖維。

實(shí)驗(yàn)例2、透射電子顯微鏡觀察楊梅素對(duì)sevi淀粉樣纖維的形態(tài)的影響

(1)梯度稀釋的楊梅素(75,37.5,18.75及0μg/ml)與3mg/mlpap248-286溶液混勻，置于恒溫振蕩儀中，37℃，1400rpm轉(zhuǎn)速下恒溫振蕩；

(2)于不同時(shí)間點(diǎn)(0,12及24h)，取5μl樣品滴于銅網(wǎng)上，2min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體；

(3)滴加磷鎢酸(3％,ph7.0)于銅網(wǎng)，2min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余染液；

(4)滴加純水于銅網(wǎng)，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸取多余水，待干后即用于電鏡觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，50μg/ml的楊梅素在24h內(nèi)完全抑制3mg/mlpap248-286自聚集形成sevi淀粉樣纖維。

實(shí)驗(yàn)例3、圓二色譜法檢測(cè)楊梅素對(duì)成熟seviβ-sheet二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

(1)梯度稀釋的楊梅素(500,250,125及0μg/ml)與3mg/ml預(yù)形成sevi溶液混勻，置于恒溫振蕩儀中，37℃，1400rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)；

(2)于不同時(shí)間點(diǎn)(1min,24h及48h)，取出樣品與pbs混勻稀釋至多肽終濃度為300μg/ml；

(3)于圓二色譜儀上掃描200～260nm波段的光譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，楊梅素處理1min后，淀粉樣纖維特征結(jié)構(gòu)β-sheet在220nm處的峰消失了，說明楊梅素能迅速的破壞成熟sevi的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)例4、在tzm-b1細(xì)胞感染模型上檢測(cè)，楊梅素能夠直接抑制sevi介導(dǎo)的hiv病毒感染增強(qiáng)作用

(1)sevi樣品預(yù)處理：將3mg/mlpap248-286溶液，置于37℃振蕩器中，在1400rpm轉(zhuǎn)速下，振搖48h或更長(zhǎng)，直至觀察到淀粉樣纖維形成，將溶液離心，將上清和沉淀部分分別保存；

(2)將1×10⁴個(gè)/孔tzm-b1細(xì)胞進(jìn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中37℃,5％co2條件下培養(yǎng)過夜；

(3)將系列梯度稀釋楊梅素(50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39mg/ml)分別與50μg/mlsevi混合，37℃共孵育1h后，離心去上清，dmem重懸后，分別與x4、r5兩種嗜性的hiv-1病毒混合，加入到tzm-b1細(xì)胞中，感染3h后更換新鮮的dmem培養(yǎng)基。

(4)37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48h，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)病毒感染率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，楊梅素能劑量依賴性地抑制sevi介導(dǎo)的hiv病毒感染增強(qiáng)作用。

實(shí)驗(yàn)例5、在tzm-b1細(xì)胞感染模型上檢測(cè)，精液環(huán)境下楊梅素和arvs藥物發(fā)揮協(xié)同抗hiv作用

(1)將1×10⁴個(gè)/孔tzm-b1細(xì)胞進(jìn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中37℃,5％co2條件下培養(yǎng)過夜。

(2)在10％精液的環(huán)境下，將最高終濃度為10μg/ml楊梅素(myricetin，簡(jiǎn)稱myr)倍比稀釋后分別和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物(簡(jiǎn)稱arvs)單獨(dú)或者共同與r5嗜性的hiv-1病毒混合，37℃共孵育30min后，加入到tzm-b1細(xì)胞中，感染3h更換新鮮的dmem培養(yǎng)基；上述各arvs藥物包括疊氮胸苷(zidovudine，簡(jiǎn)稱azt)、雷特格韋(raltegravir，簡(jiǎn)稱ral)，馬拉維若(maraviroc，簡(jiǎn)稱mar)，替諾福韋(tenofovir，簡(jiǎn)稱tnf)，奈韋拉平(nevirapine，簡(jiǎn)稱nvp)，依法韋侖(efavirenz，簡(jiǎn)稱efv)。

(3)37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48h，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)病毒感染率，計(jì)算楊梅素和各arvs藥物的協(xié)同指數(shù)；已知兩藥合用，聯(lián)用指數(shù)ci值能直觀的反應(yīng)出聯(lián)用的藥物之間是否存在協(xié)同作用。其中ci＜0.1，聯(lián)用藥物之間存在著很強(qiáng)的協(xié)同作用，0.10～0.30代表著強(qiáng)的協(xié)同,0.30～0.70代表著兩藥協(xié)同，0.70～0.85兩藥在某種程度上協(xié)同和0.85～0.90代表著較弱的協(xié)同作用。

表1精液環(huán)境下楊梅素和arvs藥物協(xié)同抗hiv-1

注：ci為聯(lián)用指數(shù)。

結(jié)果如表1所示，楊梅素與疊氮胸苷、雷特格韋、馬拉維若、替諾福韋、奈韋拉平、依法韋侖這六種arvs分別的協(xié)同指數(shù)都低于0.4，表明兩藥有協(xié)同作用，能發(fā)揮較強(qiáng)的協(xié)同抗hiv感染的效果，有望開發(fā)出含有楊梅素和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的多組分抗hiv感染殺微生物劑，同時(shí)作用于精液和病毒兩個(gè)方面，發(fā)揮更好的臨床抗hiv感染療效。