本發(fā)明屬于高分子材料和靶向遞送藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球及其制備方法。

背景技術(shù)：

腫瘤的化療的效果很大程度上受限于化療藥物在腫瘤部位分布少(經(jīng)常小于1％)、腫瘤細胞顯著的多藥耐藥性以及化療藥物對正常細胞的毒性。聚合物納米球作為化療藥物的遞送載體具有種類多樣、生物可降解、表面性能優(yōu)異以及可對人體內(nèi)ph環(huán)境和酶分子具有響應(yīng)性等優(yōu)勢，受到廣泛重視。通過靶向分子的介導(dǎo)作用可以有效促進腫瘤細胞對納米球的識別和攝取，從而實現(xiàn)腫瘤細胞靶向給藥，提升藥物在腫瘤細胞內(nèi)的濃度，顯著提高化療效果，同時最大程度避免化療對健康細胞的破壞。

對于介導(dǎo)分子在納米球表面的固定，通常使用化學鍵合的方式，既可以首先將介導(dǎo)分子結(jié)合在聚合物長鏈，再制備納米球；也可以首先制備納米球，再通過表面改性的方法將介導(dǎo)分子固定。例如唐世福等人(j.nanopart.res.,2014,16:2453)首先將生物素分子通過酰胺化反應(yīng)固定在plga分子鏈的末端，再通過超聲分散法制備了含有生物素端基的plga納米球載體，并考察了納米球表面電荷和介導(dǎo)分子對于癌細胞攝取的影響。而liu等人(adv.funct.mater.,2009,19:3535-3542)則是將葉酸分子的末端羧基改性為氨基，然后利用氨基與plga納米球表面的羧基進行酰胺化反應(yīng)，將葉酸固定在plga微球表面。專利cn201110191131.9則合成了一種聚酰胺胺樹枝狀大分子，通過edc-nhs的方法將癌細胞靶向介導(dǎo)分子葉酸鍵合在分子末端，從而賦予樹枝狀大分子癌細胞靶向遞送藥物的性能。而專利cn201280007461.0則是通過多肽分子自組裝的方法合成了一種癌細胞藥物遞送載體，通過在多肽分子的序列中引入一段癌細胞介導(dǎo)序列，賦予自組裝體癌細胞介導(dǎo)性能。但是以上方法都存在材料合成工藝復(fù)雜、成本高、通用性差，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球及其制備方法，利用氫鍵作用將癌細胞靶向介導(dǎo)分子固定在納米球表面，制備出具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球，可用于癌細胞的靶向藥物遞送。本發(fā)明可實現(xiàn)納米球粒徑精確調(diào)節(jié)、制備方法簡單、易于進行工業(yè)化生產(chǎn)，并且納米球本身不具有細胞毒性。同時固定癌細胞介導(dǎo)分子的方法工藝簡單、綠色環(huán)保、介導(dǎo)分子固定較為牢固，對各類帶有羧基或氨基的癌細胞介導(dǎo)分子具有通用性。

本發(fā)明提供的一種具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球，它由表面含有胺基的聚合物納米球和氨基化的癌細胞靶向介導(dǎo)分子構(gòu)成，所述氨基化的癌細胞靶向介導(dǎo)分子通過所述氨基化的癌細胞靶向介導(dǎo)分子中的氨基與所述含有胺基的聚合物納米球中的胺基之間形成的氫鍵固定在所述含有胺基的聚合物納米球的表面。

上述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球中，所述表面含有胺基的聚合物納米球中的胺基和所述氨基化的靶向介導(dǎo)分子的物質(zhì)的量之比可為(0.5～5)：1，具體可為(1～5)：1、(1～2)：1、(2～5)：1、2：1、1：1、5：1。

上述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球中，所述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球的粒徑可為50～500nm，具體可為130nm。

上述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球中，所述氨基化的癌細胞靶向介導(dǎo)分子包含至少一個癌細胞靶向介導(dǎo)分子基團、至少一個氨基，以及連接介導(dǎo)分子基團和氨基的基團。所述氨基化的癌細胞靶向介導(dǎo)分子可由癌細胞靶向介導(dǎo)分子經(jīng)氨基化得到；所述氨基化所采用的氨基化試劑包括但不限于：乙二胺、丙二胺、丁二胺、己二胺等。

所述癌細胞靶向介導(dǎo)分子可為任意能與癌細胞表面受體特異結(jié)合的分子。優(yōu)選地，所述癌細胞靶向介導(dǎo)分子可為含有羧基的癌細胞靶向介導(dǎo)分子，包括但不限于：生物素(結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示)、葉酸(結(jié)構(gòu)式如式ⅱ所示)、膽酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、低密度脂蛋白、尿激酶和腫瘤壞死因子中一種或幾種。

比如，當所述癌細胞靶向介導(dǎo)分子為上述式ⅰ所示生物素時，所述氨基化的癌細胞靶向介導(dǎo)分子具體可為式ⅲ所示乙二胺生物素；當所述癌細胞靶向介導(dǎo)分子為上述式ⅱ所示葉酸時，所述氨基化的癌細胞靶向介導(dǎo)分子具體可為式ⅳ所示乙二胺葉酸；

上述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球中，所述表面含有胺基的聚合物納米球可為任意表面含有胺基且可作為癌細胞的藥物載體的聚合物納米球。所述表面含有胺基的聚合物納米球的粒徑可為50～500nm。

本發(fā)明進一步提供了一種上述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球的制備方法，包括如下步驟：將所述表面含有胺基的聚合物納米球和所述氨基化的靶向介導(dǎo)分子在水或磷酸鹽緩沖溶液中混合，即可得到所述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球。

上述的制備方法中，所述表面含有胺基的聚合物納米球中的胺基和所述氨基化的靶向介導(dǎo)分子的物質(zhì)的量之比可為(5～0.5)：1，具體可為(1～5)：1、(1～3)：1、(1～2)：1、(2～5)：1、(2～3)：1、2：1、1：1、5：1或3：1。

優(yōu)選地，所述表面含有胺基的聚合物納米球在所述水或磷酸鹽緩沖溶液中的含量可為每ml所述水或磷酸鹽緩沖溶液中含有所述表面含有胺基的聚合物納米球1mg～20mg，具體可為每ml所述水或磷酸鹽緩沖溶液中含有所述表面含有胺基的聚合物納米球1mg～10mg、1mg～5mg、1mg～2mg、2mg～10mg、2mg～5mg、5mg～10mg、2mg、5mg、10mg或1mg。

上述的制備方法具體可包括如下步驟：(1)將所述表面含有胺基的聚合物納米球分散所述水中，得到含有胺基的聚合物納米球的分散液；(2)將所述氨基化癌細胞靶向介導(dǎo)分子溶于所述分散液中，攪拌，離心收集沉淀，得到所述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球。所述攪拌的轉(zhuǎn)速可為100～500轉(zhuǎn)/分鐘，時間可為1～24小時(如24小時)。

上述的制備方法中，所述癌細胞靶向介導(dǎo)分子可為含有羧基的癌細胞靶向介導(dǎo)分子，包括但不限于：生物素(結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示)、葉酸(結(jié)構(gòu)式如式ⅱ所示)、膽酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、低密度脂蛋白、尿激酶和腫瘤壞死因子中一種或幾種；制備所述氨基化癌細胞靶向介導(dǎo)分子的方法可包括如下步驟：(1)所述含有羧基的癌細胞靶向介導(dǎo)分子與羧基活化試劑在溶劑中經(jīng)羧基活化反應(yīng)，得到羧基活化產(chǎn)物；(2)所述羧基活化產(chǎn)物與氨基化試劑在溶劑中進行氨基化反應(yīng)，得到所述氨基化的靶向介導(dǎo)分子。

步驟(1)中，所述羧基活化試劑與所述癌細胞靶向介導(dǎo)分子的摩爾比可為(1～5)：1，優(yōu)選(2～3)：1，具體可為2：1或4：1。

所述羧基活化試劑可以為n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)、二異丙基碳二亞胺(dic)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、n-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-nhs)、n,n’-二琥珀酰亞胺碳酸酯(dsc)、4-n,n-二甲基吡啶(dmap)、氯甲酸乙酯、氯甲酸異丁酯、甲烷磺酰氯(mscl)，對甲苯磺酰氯(tscl)、對硝基苯磺酰氯(nscl)、羰基二咪唑(cdi)、o-(7-氮雜苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸鹽(hatu)、o-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸鹽(hbtu)、o-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸鹽(hctu)、二苯基磷酰氯(dpp-cl)、氰代磷酸二乙酯(decp)，等。

所述羧基活化反應(yīng)的溫度可為15～35℃(如25℃)，時間可為12～36小時(如12小時)。

所述羧基活化反應(yīng)可在催化劑的作用下進行，所述催化劑可為三乙胺、二異丙基乙胺等；所述催化劑和所述癌細胞靶向介導(dǎo)分子的摩爾比可為(1～4)：1，具體可為(2～4)：1、2：1或4：1。

所述溶劑可為n,n-二甲基甲酰胺(dmf)；所述溶劑的質(zhì)量與所述生物素、所述羧基活化試劑和所述催化劑的總質(zhì)量的比值可為(3～50)：1，優(yōu)選(4～9)：1。

步驟(2)中，所述氨基化試劑與所述癌細胞靶向介導(dǎo)分子的摩爾比可為(1～5)：1，優(yōu)選(2～3)：1，具體可為2：1。

所述氨基化試劑可以為乙二胺、丙二胺、丁二胺、己二胺，等。

所述氨基化反應(yīng)的溫度為15～35℃(如25℃)，時間為12～24小時(如24小時)。

所述溶劑可為n,n-二甲基甲酰胺(dmf)；所述溶劑的質(zhì)量與所述羧基活化產(chǎn)物和所述氨基化試劑的總質(zhì)量的比值可為(3～50)：1，優(yōu)選(4～9)：1。

上述的制備方法中，制備所述表面含有氨基的聚合物納米球的方法可采用乳液聚合法，具體可包括如下步驟：使含有氨基的單體、其它共聚合單體和交聯(lián)單體的單體混合物在乳化劑和自由基引發(fā)劑的存在下進行乳液聚合，得到所述表面含有胺基的聚合物納米球。

所述含胺基的單體包括但不限于：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙脂、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯等的一種或幾種。

所述其它共聚合單體包括但不限于：苯乙烯、甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、乙烯基萘、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯中的一種或幾種，如質(zhì)量比為4：2.5的丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸甲酯。

所述交聯(lián)單體包括但不限于：丙烯酸芳基酯、甲基丙烯酸芳基酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸-(1，6己二醇)酯、二丙烯酸-1，6-己二醇醋、三甲基丙烯酸甘油酯、三丙烯酸甘油酯、n,n-亞甲基雙丙烯酰胺和二乙烯基苯中的一種或幾種。

所述含胺基的單體、所述其它共聚合單體和所述交聯(lián)單體組成的單體混合物中，所述含胺基的單體的質(zhì)量含量可為5～70％，具體可為33％～35％、33％或35％；所述其它共聚合單體含量可為30～95％，具體可為65％～67％、65％或67％；所述交聯(lián)單體的質(zhì)量含量可為0～10％，具體可為3％。

所述乳化劑可為乳液聚合常規(guī)的陰離子型乳化劑(如十二烷基硫酸鈉)、陽離子型乳化劑(如十六烷基三甲基溴化銨)、陰離子型乳化劑與非離子型乳化劑的組合物(如質(zhì)量比為2：1的十二烷基硫酸鈉和壬基酚聚氧乙烯醚的組合物)或者陽離子型乳化劑與非離子型乳化劑的組合物等。

所述自由基引發(fā)劑可為乳液聚合常規(guī)的非氧化還原型水溶性自由基引發(fā)劑(如偶氮二異丁脒鹽酸鹽)或非氧化還原型油溶性自由基引發(fā)劑(如偶氮二異丁腈)等。

所述乳化劑的用量可為所述單體混合物質(zhì)量的0～3％，具體可為3％；所述自由基引發(fā)劑的用量可為所述單體混合物質(zhì)量的0.05～2％，具體可為2％。

所述乳液聚合的溫度可為60～95℃，具體可為70～80℃、70℃或80℃；時間可為3～7小時。

所述表面含有胺基的聚合物納米球具體可通過如下步驟制備得到：(1)將所述含有胺基的功能單體、所述其他共聚合單體和所述交聯(lián)單體相混合，并分散于含有所述乳化劑和所述引發(fā)劑的水溶液進行乳化；(2)對上述乳化后的混合液進行乳液聚合，即得到表面含有胺基的納米球。

所述乳液聚合的加料方式選自批量法、半連續(xù)法、連續(xù)法和預(yù)乳化法中的一種或多種方法的組合。優(yōu)選預(yù)乳化法和半連續(xù)法的組合投料形式，具體步驟如下：將所述含有胺基的單體、所述其它共聚合單體、所述交聯(lián)單體、含有所述引發(fā)劑和所述乳化劑的水溶液進行混合并進行機械攪拌預(yù)乳化或高速攪拌預(yù)乳化，機械攪拌預(yù)乳化時間的時間可為10～120分鐘，優(yōu)選30～60分鐘(如60分鐘)，高速攪拌預(yù)乳化時間可為5～30分鐘，優(yōu)選10分鐘，得到預(yù)乳化液；將部分預(yù)乳化液，優(yōu)選預(yù)乳化液質(zhì)量的20％～30％(如30％)，加熱至聚合反應(yīng)溫度，并反應(yīng)15～20分鐘(如15分鐘)。再將剩余預(yù)乳化液按照一定的速率逐步滴加到聚合體系中，控制滴加過程為1～5小時(如3小時)，滴加結(jié)束后繼續(xù)反應(yīng)2～5小時(如3小時)。

本發(fā)明進一步提供了上述具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球在作為抗癌藥物遞送載體和/或制備抗癌藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的實施例中，所述癌具體可為肝癌。

除前述以外，當用于本申請的說明書及權(quán)利要求書中時，除非另外特別指明，否則以下術(shù)語具有如下所示的含義。

在本申請中，術(shù)語“氨基”是指氨中的氫被取代的基團，結(jié)構(gòu)為-nh2。

術(shù)語“氨基化”是指在有機化合物分子中引入氨基的反應(yīng)。

與現(xiàn)有的具有癌細胞靶向識別功能的藥物遞送載體的制備方法相比，本發(fā)明的制備方法具有下列優(yōu)點：

1.本發(fā)明制備的具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球粒徑在50-100納米，粒徑分布均一，并可以通過制備過程的調(diào)節(jié)精確控制納米球的粒徑。

2.本發(fā)明制備的具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球可以作為藥物載體包覆抗癌藥物，納米球載體本身不具有細胞毒性。

3.納米球表面通過氫鍵作用固定了癌細胞靶向介導(dǎo)分子，通過靜脈注射或者口服的方式送入體內(nèi)后，納米球載體可在癌細胞附近靶向聚集并進行藥物釋放，提高了癌細胞局部區(qū)域的藥物濃度，達到靶向殺死癌細胞的目的。

4.本發(fā)明制備的具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球制備方法簡單，易于進行工業(yè)化生產(chǎn)。

5.本發(fā)明涉及的將癌細胞靶向介導(dǎo)分子進行氨基化改性，具有普遍性。

6.本發(fā)明涉及的通過氫鍵作用將靶向介導(dǎo)分子固定在納米球表面的方法工藝簡單，綠色環(huán)保并且介導(dǎo)分子固定較為牢固。

附圖說明

圖1為制備具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球過程示意圖；其中，圖1(a)為表面富含胺基的親水性聚合物納米球的制備；圖1(b)為癌細胞靶向介導(dǎo)分子的氨基化改性；圖1(c)為具有癌細胞靶向識別功能的聚合物納米球的制備。

圖2為實施例1中制備得到的生物素表面修飾的聚合物納米球的透射電子顯微鏡照片。

圖3為實施例1中制備得到的生物素表面修飾的聚合物納米球表面硫元素xps譜圖。

圖4是實施例3制備的葉酸表面修飾的聚合物納米球的透射電子顯微鏡照片。

圖5人體肝癌細胞hepg對聚合物納米球的攝取的共聚焦顯微鏡照片，其中圖5(a)為癌細胞對實施例1中制備得到的表面修飾生物素的聚合物納米球的攝取；圖5(b)為癌細胞對表面未修飾生物素的聚合物納米球的攝取。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的人體肝癌細胞系hepg2購自國家細胞資源共享平臺，資源編號3111c0001ccc000035，采用dmem培養(yǎng)基(添加10％的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)在37℃下，含5％co2.空氣氛圍的細胞培養(yǎng)箱紅培養(yǎng)。

實施例1、生物素表面修飾的聚合物納米球的制備

按照圖1所示示意圖制備生物素表面修飾的聚合物納米球：

1)按照圖1中步驟(a)制備表面含有胺基的聚合物納米球，具體步驟如下：

將乳化劑0.2g十二烷基硫酸鈉(sds)和0.1g壬基酚聚氧乙烯醚(op-10)溶于水90ml中，得到乳化劑水溶液；將引發(fā)劑偶氮二異丁腈(aibn)溶于其它共聚合單體苯乙烯(styrene)、含胺基的單體甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(dmaema)以及交聯(lián)單體二乙烯基苯的混合溶劑中(aibn、styrenedmaema、二乙烯基苯的質(zhì)量比為0.2：6.7：3.3：0.03)，得到單體溶液。將乳化劑的水溶液倒入裝有球形冷凝管、攪拌槳的三口瓶中，再將單體溶液滴入水相中(乳化劑水溶液和單體溶液的質(zhì)量比為9：1)。其在常溫下對混合溶液進行機械攪拌預(yù)乳化，攪拌速率300rpm，時間為1小時。取出70％的預(yù)乳化液加入到錐形瓶中，使用磁力攪拌防止預(yù)乳化液分層。同時將剩下的預(yù)乳化液通過水浴加熱到80℃，在機械攪拌下開始乳液聚合，整個反應(yīng)在氮氣氛圍下進行。聚合15分鐘后，將錐形瓶中的預(yù)乳化液通過蠕動泵逐步滴加到反應(yīng)體系中。通過調(diào)節(jié)滴加速度，控制整個滴加過程持續(xù)約3小時。預(yù)乳化液滴加完畢后，再反應(yīng)3小時。停止反應(yīng)，將乳液冷卻至室溫，得到表面含有胺基的聚合物納米球，簡寫為p(st-co-dmaema)-nps。

2)按照圖1中步驟(b)合成乙二胺生物素，具體步驟如下：

將生物素(biotin)溶于有機溶劑n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中(1mldmf中溶解10mg生物素)，在冰水浴中，加入相當于生物素2倍摩爾量的n,n’-二琥珀酰亞胺碳酸酯(dsc)，并加入相當于生物素2倍摩爾量的三乙胺作為催化劑，常溫(25℃)反應(yīng)12小時。分別用乙醚、異丙醇、乙醚將產(chǎn)物沉淀洗滌三次，得到純凈的n-羥基琥珀酰亞胺生物素酯。將n-羥基琥珀酰亞胺生物素酯溶于有機溶劑n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中(1mldmf溶解10mgn-羥基琥珀酰亞胺生物素酯)，然后將溶液反滴入過量的乙二胺(相當于生物素2倍摩爾量)中，在常溫(25℃)下反應(yīng)24小時。分別用乙醚沉淀洗滌兩次，飽和naco3溶液洗滌兩次，再用去離子水洗滌一次，得到純凈的乙二胺生物素。

3)按照圖1中步驟(c)制備生物素表面修飾的聚合物納米球，具體步驟如下：

將離心洗滌后的聚合物納米球分散在去離子水中。然后將純化后的乙二胺生物素溶于納米球分散液中(聚合物納米球中胺基的摩爾量和乙二胺生物素的摩爾量之比為2：1，每ml去離子水中聚合物納米球的質(zhì)量為2mg)，在常溫(25℃)下攪拌24小時(轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘)。經(jīng)過離心洗滌，即得到生物素表面修飾的聚合物納米球，納米球的形貌見圖2。由圖2可以看出，本實施例制備得到的生物素表面修飾的聚合物納米球的平均干態(tài)粒徑為130nm。

將經(jīng)過離心洗滌的納米球進行表面硫元素xps分析可知(圖3)，通過氫鍵作用固定氨基化介導(dǎo)分子的納米球表面具有很強的生物素硫元素的峰(163ev)，而表面沒有氨基無法通過氫鍵作用固定介導(dǎo)分子的納米球則看不到生物素的硫元素峰，只出現(xiàn)了乳化劑sds的硫元素峰，說明通過納米球表面胺基與介導(dǎo)分子的氨基之間的氫鍵作用，可以將介導(dǎo)分子牢牢的固定在微球表面，并且不會由于離心洗滌而脫落。

實施例2、生物素表面修飾的聚合物納米球的制備

1)表面含有胺基的聚合物納米球的制備：

將乳化劑0.2g十六烷基三甲基溴化銨、0.1g壬基酚聚氧乙烯醚(op-10)和引發(fā)劑偶氮二異丁脒鹽酸鹽0.2g溶于90ml水中，得含有乳化劑的水溶液；將其它共聚合單體丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、含胺基的單體甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯以及交聯(lián)單體n,n-亞甲基雙丙烯酰胺按4：2.5：3.5：0.03的質(zhì)量比混合，得單體溶液。將含有乳化劑的水溶液倒入裝有球形冷凝管、攪拌槳的三口瓶中，再將單體溶液滴入水相中(乳化劑水溶液和單體溶液的質(zhì)量比為9：1)。在常溫下使用高速攪拌對混合溶液進行預(yù)乳化，攪拌速率8000rpm，時間為10分鐘。取出70％的預(yù)乳化液加入到錐形瓶中，使用磁力攪拌防止預(yù)乳化液分層。同時將剩下的預(yù)乳化液通過水浴加熱到70℃，在機械攪拌下開始乳液聚合，整個反應(yīng)在氮氣氛圍下進行。聚合15分鐘后，將錐形瓶中的預(yù)乳化液通過蠕動泵逐步滴加到反應(yīng)體系中。通過調(diào)節(jié)滴加速度，控制整個滴加過程持續(xù)約3小時。預(yù)乳化液滴加完畢后，再反應(yīng)3小時。停止反應(yīng)，將乳液冷卻至室溫，得到表面含有胺基的聚合物納米球。

2)己二胺生物素的合成：

將生物素溶于有機溶劑dmf中(1mldmf中溶解10mg生物素)，在冰水浴中，加入相當于生物素2倍摩爾量的催化劑二異丙基乙胺和相當于生物素2倍摩爾量的o-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸鹽(hbtu)，攪拌均勻后在常溫(25℃)反應(yīng)12小時。分別用乙醚、異丙醇、乙醚將產(chǎn)物沉淀洗滌三次，得到純凈的n-羥基琥珀酰亞胺生物素酯。將n-羥基琥珀酰亞胺生物素酯溶于有機溶劑dmf中(1mldmf溶解10mgn-羥基琥珀酰亞胺生物素酯)，然后將溶液反滴入過量的己二胺(相當于生物素2倍摩爾量)中，在常溫(25℃)下反應(yīng)24小時。分別用乙醚沉淀洗滌兩次，飽和naco3溶液洗滌兩次，再用去離子水洗滌一次，得到純凈的己二胺生物素。

3)生物素表面修飾的聚合物納米球的制備：

將離心洗滌后的聚合物納米球分散在去離子水中。然后將純化后的己二胺生物素溶于納米球分散液中(聚合物納米球中胺基的摩爾量和己二胺生物素的摩爾量之比為3：1，每ml水中聚合物納米球的質(zhì)量為2mg)，在常溫(25℃)下攪拌24小時(轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘)。經(jīng)過離心洗滌，即得到生物素表面修飾的聚合物納米球。

實施例3、葉酸表面修飾的聚合物納米球的制備

1)表面含有胺基的聚合物納米球的制備：與實施例1相同。

2)氨基化葉酸的合成：將葉酸溶于有機溶劑dmf中(1mldmf溶解10mg葉酸)，在冰水浴中，加入相當于葉酸四倍摩爾量的n,n’-二琥珀酰亞胺碳酸酯(dsc)，在三乙胺的催化下(三乙胺和葉酸的摩爾比為2：1)常溫(25℃)反應(yīng)12小時。分別用乙醚、異丙醇、乙醚將產(chǎn)物沉淀洗滌三次。將得到的產(chǎn)物重新溶于dmf中(1mldmf中溶解10mg產(chǎn)物)，然后將溶液反滴入過量的乙二胺(相當于葉酸2倍摩爾量)中，在常溫(25℃)下反應(yīng)24小時。分別用乙醚沉淀洗滌兩次，飽和naco3溶液洗滌兩次，再用去離子水洗滌一次，得到純凈的氨基化葉酸。

3)葉酸表面修飾的聚合物納米球的制備：將離心洗滌后的聚合物納米球分散在去離子水中。然后將純化后的氨基化葉酸溶于納米球分散液中(聚合物納米球中胺基的摩爾量和氨基化葉酸的摩爾量之比為2：1，(聚合物納米球中胺基的摩爾量和己二胺生物素的摩爾量之比為3：1，每ml水中聚合物納米球的質(zhì)量為5mg))，在常溫下攪拌24小時(轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘)。經(jīng)過離心洗滌，即得到葉酸表面修飾的聚合物納米球，納米球的形貌見圖4。由圖4可以看出，本實施例制備得到的葉酸表面修飾的聚合物納米球的平均干態(tài)粒徑為126nm。

實施例4、葉酸表面修飾的聚合物納米球的制備

1)表面含有胺基的聚合物納米球的制備：與實施例2相同。

2)氨基化葉酸的合成：將葉酸溶于有機溶劑dmf中(1mldmf中溶解10mg葉酸)，在冰水浴中，加入相當于葉酸4倍摩爾量的催化劑二異丙基乙胺和2倍摩爾量的o-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸鹽(hbtu)，攪拌均勻后在常溫(25℃)反應(yīng)12小時。分別用乙醚、異丙醇、乙醚將產(chǎn)物沉淀洗滌三次。將得到的產(chǎn)物重新溶于有機溶劑dmf中(1mldmf中溶解10mg產(chǎn)物)，然后將溶液反滴入過量的己二胺(相當于葉酸2倍摩爾量)中，在常溫(25℃)下反應(yīng)24小時。分別用乙醚沉淀洗滌兩次，飽和naco3溶液洗滌兩次，再用去離子水洗滌一次，得到純凈的氨基化葉酸。

3)葉酸表面修飾的聚合物納米球的制備：與實施例3相同。

實施例5、膽酸表面修飾的聚合物納米球的制備

1)表面含有胺基的聚合物納米球的制備：與實施例1相同。

2)氨基化膽酸的合成：將膽酸溶于有機溶劑dmf中(1mldmf溶解10mg膽酸)，在冰水浴中，加入相當于膽酸2倍摩爾量的三乙胺的催化劑和2倍摩爾量的n,n’-二琥珀酰亞胺碳酸酯(dsc)，常溫(25℃)反應(yīng)12小時。分別用乙醚、異丙醇、乙醚將產(chǎn)物沉淀洗滌三次。將得到的產(chǎn)物重新溶于有機溶劑dmf中(1mldmf中溶解10mg產(chǎn)物)，然后將溶液反滴入過量的乙二胺(相當于膽酸2倍摩爾量)中，在常溫(25℃)下反應(yīng)24小時。分別用乙醚沉淀洗滌兩次，飽和naco3溶液洗滌兩次，再用去離子水洗滌一次，得到純凈的氨基化膽酸。

3)膽酸表面修飾的聚合物納米球的制備：將離心洗滌后的聚合物納米球分散在去離子水中。然后將純化后的氨基化膽酸溶于納米球分散液中(聚合物納米球中胺基的摩爾量和氨基化膽酸的摩爾量之比為1：1，每ml水中聚合物納米球的質(zhì)量為10mg)，在常溫(25℃)下攪拌24小時(轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘)。經(jīng)過離心洗滌，即得到膽酸表面修飾的聚合物納米球。

實施例6、膽酸表面修飾的聚合物納米球的制備

1)表面含有胺基的聚合物納米球的制備：與實施例2相同。

2)氨基化膽酸的合成：將膽酸溶于有機溶劑dmf中(1mldmf中溶解10mg膽酸)，在冰水浴中，加入相當于膽酸2倍摩爾量的催化劑二異丙基乙胺和2倍摩爾量的o-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸鹽(hbtu)，攪拌均勻后在常溫(25℃)反應(yīng)12小時。分別用乙醚、異丙醇、乙醚將產(chǎn)物沉淀洗滌三次。將得到的產(chǎn)物重新溶于有機溶劑dmf中(1mldmf中溶解10mg產(chǎn)物)，然后將溶液反滴入過量的己二胺(相當于膽酸2倍摩爾量)中，在常溫(25℃)下反應(yīng)24小時。分別用乙醚沉淀洗滌兩次，飽和naco3溶液洗滌兩次，再用去離子水洗滌一次，得到純凈的氨基化膽酸。

3)膽酸表面修飾的聚合物納米球的制備：與實施例5相同。

實施例7、轉(zhuǎn)鐵蛋白表面修飾的聚合物納米球的制備

1)表面含有胺基的聚合物納米球的制備：與實施例1相同。

2)氨基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的合成：將轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于有機溶劑dmf中(1mldmf中溶解1mg的轉(zhuǎn)鐵蛋白)，在冰水浴中，加入相當于轉(zhuǎn)鐵蛋白4倍摩爾量的的n,n’-二琥珀酰亞胺碳酸酯(dsc)，在三乙胺(相當于轉(zhuǎn)鐵蛋白2倍摩爾量)的催化下常溫(25℃)反應(yīng)12小時。分別用乙醚、異丙醇、乙醚將產(chǎn)物沉淀洗滌三次。將得到的產(chǎn)物重新溶于dmf中(1mldmf溶解1mg產(chǎn)物)，然后將溶液反滴入過量的乙二胺(相當于轉(zhuǎn)鐵蛋白2倍摩爾量)中，在常溫(25℃)下反應(yīng)24小時。分別用乙醚沉淀洗滌兩次，飽和naco3溶液洗滌兩次，再用去離子水洗滌一次，得到純凈的氨基化轉(zhuǎn)鐵蛋白。

3)轉(zhuǎn)鐵蛋白表面修飾的聚合物納米球的制備：將離心洗滌后的聚合物納米球分散在去離子水中。然后將純化后的氨基化轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于納米球分散液中(聚合物納米球中胺基的摩爾量和氨基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的摩爾量之比為5：1，每ml水中聚合物納米球的質(zhì)量為1mg)，在常溫(25℃)下攪拌24小時(轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘)。經(jīng)過離心洗滌，即得到轉(zhuǎn)鐵蛋白表面修飾的聚合物納米球。

實施例8、尿激酶表面修飾的聚合物納米球的制備

1)表面含有胺基的聚合物納米球的制備：與實施例1相同。

2)氨基化尿激酶的合成：將尿激酶溶于有機溶劑dmf中(1mldmf中溶解1mg的尿激酶)，在冰水浴中，加入過量的n,n’-二琥珀酰亞胺碳酸酯(dsc)(相當于尿激酶4倍摩爾量)，在三乙胺(相當于尿激酶2倍摩爾量)的催化下常溫(25℃)反應(yīng)12小時。分別用乙醚、異丙醇、乙醚將產(chǎn)物沉淀洗滌三次。將得到的產(chǎn)物重新溶于有機溶劑dmf中(1mldmf溶解1mg產(chǎn)物)，然后將溶液反滴入過量的乙二胺(相當于尿激酶2摩爾量)中，在常溫(25℃)下反應(yīng)24小時。分別用乙醚沉淀洗滌兩次，飽和naco3溶液洗滌兩次，再用去離子水洗滌一次，得到純凈的氨基化尿激酶。

3)尿激酶表面修飾的聚合物納米球的制備：將離心洗滌后的聚合物納米球分散在去離子水中。然后將純化后的氨基化尿激酶溶于納米球分散液中(聚合物納米球中胺基和氨基尿激酶的摩爾量之比為5：1，每ml水中聚合物納米球的質(zhì)量為1mg))，在常溫(25℃)下攪拌24小時(轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘)。經(jīng)過離心洗滌，即得到尿激酶表面修飾的聚合物納米球。

實施例9、生物素表面修飾的聚合物納米球的癌細胞攝取

1)將實施例1中制備的生物素表面修飾的聚合物納米球與人體肝癌細胞hepg2混合，再通過共聚焦顯微鏡(圖5(a))表征細胞對于納米粒的攝取。

2)作為對比試驗，直接使用表面富含胺基的聚合物納米球與人體肝癌細胞hepg2混合，再通過共聚焦顯微鏡(圖5(b))表征細胞對于納米粒的攝取。

從圖5中可以看出，表面通過氫鍵作用修飾上生物素的納米球的癌細胞攝取率大大增加。