本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及熱休克蛋白gp96在治療重癥肌無(wú)力癥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

重癥肌無(wú)力(myastheniagravis，mg)是一種主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholinereceptor，achr)的自身免疫性疾病。臨床主要表現(xiàn)為部分或全身骨骼肌無(wú)力和易疲勞，活動(dòng)后癥狀加重，經(jīng)休息和膽堿酯酶抑制劑(cholinesteraseinhibitors，chei)治療后癥狀減輕。患病率為77～150/100萬(wàn)，年發(fā)病率為4～11/100萬(wàn)。女性患病率大于男性，約3:2，各年齡段均有發(fā)病，兒童1～5歲居多。重癥肌無(wú)力的發(fā)病原因分兩大類，一類是先天遺傳性，極少見(jiàn)，與自身免疫無(wú)關(guān)；第二類是自身免疫性疾病，最常見(jiàn)。發(fā)病原因尚不明確，普遍認(rèn)為與感染、藥物、環(huán)境因素有關(guān)。同時(shí)重癥肌無(wú)力患者中有65％～80％有胸腺增生，10％～20％伴發(fā)胸腺瘤。

熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)是一類在生物進(jìn)化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。hsp根據(jù)同源程度和分子量大小可分為hsp110、hsp90、hsp70、hsp60、hsp40、小分子hsp和泛素等多個(gè)亞家族。熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)gp96屬于hsp90亞家族的成員，該蛋白是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上含量最豐富的熱休克蛋白。目前未有報(bào)道熱休克蛋白gp96在治療重癥肌無(wú)力癥中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供熱休克蛋白gp96在治療重癥肌無(wú)力癥中的新應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供了熱休克蛋白gp96在制備治療重癥肌無(wú)力癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述熱休克蛋白gp96為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列如seqidno.2所示的蛋白質(zhì)；

a2)在a1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將a1)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

進(jìn)一步地，所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為1)或2)或3)：

1)細(xì)胞和組織中天然純化；

2)利用酵母菌表達(dá)重組蛋白；

3)利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組蛋白。

更進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品的功能為如下a1)、a2)和a3)中的至少一種：

a1)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生；

a2)降低乙酰膽堿受體achr抗體滴度；

a3)降低重癥肌無(wú)力癥臨床評(píng)分。

其中，所述調(diào)節(jié)性t細(xì)胞為cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。

作為優(yōu)選，所述產(chǎn)品為注射劑。

本發(fā)明還提供了熱休克蛋白gp96的編碼基因在制備治療重癥肌無(wú)力癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述編碼基因?yàn)閐1)或d2)或d3)：

d1)核苷酸序列是seqidno.1所示的dna分子；

d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述熱休克蛋白gp96的dna分子；

d3)在嚴(yán)格條件下與d1)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述熱休克蛋白gp96的dna分子。

所述嚴(yán)格條件為在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。

本發(fā)明還提供了含有熱休克蛋白gp96編碼基因的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、工程菌、昆蟲(chóng)或酵母。

進(jìn)一步地，上述生物材料在制備治療自身免疫性溶血性貧血藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療重癥肌無(wú)力癥的產(chǎn)品，其活性成分為熱休克蛋白gp96，所述熱休克蛋白gp96為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列如seqidno.2所示的蛋白質(zhì)；

a2)在a1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將a1)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述產(chǎn)品的功能為如下a1)、a2)和a3)中的至少一種：

a1)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生；

a2)降低乙酰膽堿受體achr抗體滴度；

a3)重癥肌無(wú)力癥臨床評(píng)分降低，緩解重癥肌無(wú)力的癥狀，治療重癥肌無(wú)力。

所述調(diào)節(jié)性t細(xì)胞為cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。

所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為以下任一：

(1)從細(xì)胞或組織中提取純化得到；

(2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)，純化。包括利用酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá)，純化得到。

所述“將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中”可通過(guò)向受體中導(dǎo)入重組載體實(shí)現(xiàn)；所述重組載體可為將所述熱休克蛋白gp96的編碼基因插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96。所述重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96具體可為在質(zhì)粒pfastbac1的多克隆位點(diǎn)插入序列表中seqidno.1所示的dna分子得到的重組質(zhì)粒。

所述重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96具體可為將質(zhì)粒pfastbac1的ecorⅰ和xbaⅰ識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pfastbac1被限制性核酸內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為seqidno.1所示的dna分子得到的重組質(zhì)粒。

所述受體可為sf9細(xì)胞。

所述產(chǎn)品的注射劑量為小鼠免疫單次劑量為100-400μg/18-22g體重，人免疫劑量為100-1500μg/人次。

所述哺乳動(dòng)物可為鼠或人。所述鼠具體可為昆明種小鼠。

本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實(shí)施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了熱休克蛋白gp96具有誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生、降低achr抗體滴度、降低重癥肌無(wú)力癥臨床評(píng)分的功能。因此，熱休克蛋白gp96對(duì)治療重癥肌無(wú)力的癥狀具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為人胎盤組織制備的gp96提取物的sds-page和westernblot鑒定結(jié)果，圖中，1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：用人胎盤組織制備的gp96提取物的sds-page電泳圖；3：westernblot鑒定圖。

圖2為利用漢遜酵母表達(dá)重組gp96蛋白的sds-page和westernblot鑒定結(jié)果。圖中，1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：步驟2的發(fā)酵液；3：親和層析后的洗脫液；4：離子交換層析后的洗脫液；5：westernblot鑒定圖。

圖3為利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組gp96的sds-page和westernblot的鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

昆明種小鼠，雌性，體重22～25g，購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。獲取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的具體方法參考如下文獻(xiàn)：zhenliu，xinghuili，lipengqiu，etal.tregsuppressctlresponsesuponimmunizationwithhspgp96.eur.j.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.

hepg2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)為atcc公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為hb-8065^tm。sf9細(xì)胞為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為11496-015。cellfectiniireagent為lifetechnologies公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為10362-100。質(zhì)粒pfastbac^tm1為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為10359-016。gp96單克隆抗體為santacruz公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為sc-56399。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為zb-2307。hitrap-qsepharose離子交換層析柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-5053-01。superdex20010/300gl分子篩層析柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17517501。大腸桿菌dh10bac感受態(tài)細(xì)胞為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為cl108-01。fitc-anti-cd3、pe-anti-cd4、percp-cy5.5-anti-cd25、固定/破膜劑和apc-anti-foxp3均為ebioscience公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00和17-5773-80。insect-xpress^tmprotein-freeinsectcellsmediumwithl-glutamine為lonza公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為12-730q。

實(shí)施例1、熱休克蛋白gp96的獲得

(一)人胎盤組織中純化gp96蛋白

1、組織勻漿

勻漿緩沖液配方：在ph7.0的碳酸氫鈉緩沖液中加pmsf(苯甲基磺酰氟，分子式為c7h7fo2s)至終濃度1mm(置于冰上的燒杯中配制：pmsf在水溶液中數(shù)小時(shí)內(nèi)分解，該溶液不可過(guò)夜)。

取燒杯至于冰上，將人胎盤組織在燒杯中迅速用剪刀剪成直徑約1-2毫米的碎塊，然后加入組織8倍重量的勻漿緩沖液。將組織碎塊攪勻倒入玻璃勻漿器，勻漿至底部組織塊消失后再上下勻漿15次以上。勻漿液倒入離心管，50,000g離心60min，取上清加入1/10體積的10×pbs(ph7.5，200mmnacl)，用于步驟2的cona-sepharose層析。

2、cona-sepharose親和層析

載體為cona-sepharose(購(gòu)自ge公司，產(chǎn)品號(hào)為17-0440-01)，按“1ml載體/4g組織”計(jì)算使用量。層析柱的內(nèi)徑和柱長(zhǎng)是1.6×2.5cm。

將步驟1得到的上清用蠕動(dòng)泵上樣，0.25ml/min。在pbs(ph7.5，200mmnacl)中加pmsf至終濃度1mm，作為洗脫液甲，用蠕動(dòng)泵將10倍柱體積的洗脫液甲過(guò)層析柱(0.5ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。在pbs(ph7.5，200mmnacl)中加α-d-吡喃葡萄糖至終濃度10％(10mg/ml)，加pmsf至終濃度1mm，作為洗脫液乙，用蠕動(dòng)泵將3倍柱體積的洗脫液乙過(guò)柱層析(0.25ml/min)，收集洗脫液。

3、hitrap-qsepharose離子交換層析

載體為hitrap-qsepharose(層析柱為hitrapqhp，購(gòu)自ge公司，產(chǎn)品號(hào)為17-1153-01)。層析柱的內(nèi)徑和柱長(zhǎng)是0.7×2.5cm。

將載體裝柱后，先用5mlpbs(ph7.5，200mmnacl)清洗(1ml/min)。將步驟2得到的洗脫液上樣(1ml/min)，然后將5mlpbs(ph7.5，200mmnacl)過(guò)層析柱(1ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。然后將10mlpbs(ph7.5，300mmnacl)過(guò)層析柱(1ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。然后將3mlpbs(ph7.5，600mmnacl)過(guò)層析柱(1ml/min)，收集洗脫液，即為gp96提取物。

將gp96提取物進(jìn)行10％sds-page，然后考馬斯亮藍(lán)染色。

將gp96提取物進(jìn)行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購(gòu)自santacruz，產(chǎn)品號(hào)為sc-56339)。

除了人胎盤外，也可用如下細(xì)胞或者組織制備gp96提取物：黑色素瘤(b16)細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞系hepg2培養(yǎng)細(xì)胞、臨床手術(shù)切除的人腫瘤組織(乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、腸癌、肝癌、胃癌)，提取方法參照人胎盤的提取。

結(jié)果見(jiàn)圖1。

(二)利用漢遜酵母表達(dá)重組gp96蛋白

1、重組質(zhì)粒phfmdz-r1l2gamy-gp96的構(gòu)建

①提取人肝癌細(xì)胞hepg2的mrna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna。

②以步驟①的cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

pcr引物如下：

fp(5'-ccggaattcatggacgatgaagttgatg-3')

rp(5'-ccgctcgagctattagaattcatctttttcagctgtag-3')

③用限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi雙酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

④用限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi雙酶切質(zhì)粒phfmdz-r1a(購(gòu)自invitrogen公司，產(chǎn)品號(hào)為v20520)，回收載體骨架。

⑤將步驟③的酶切產(chǎn)物和步驟④的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96的骨架載體為phfmdz-r1a，在ecori和xhoi酶切位點(diǎn)之間插入了gp96蛋白的編碼序列。

⑥在重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96的bglii酶切位點(diǎn)插入leu2片段，leu2的核苷酸序列如seqidno.3所示。bamhi酶切位點(diǎn)插入α-淀粉酶報(bào)告系統(tǒng)如seqidno.4所示，得到重組質(zhì)粒phfmdz-r1l2gamy-gp96。

2、gp96蛋白的表達(dá)

①采用電轉(zhuǎn)化法將步驟1得到的重組質(zhì)粒phfmdz-r1l2gamy-gp96導(dǎo)入漢遜酵母(購(gòu)自atcc，產(chǎn)品號(hào)為mya-335)細(xì)胞，得到重組菌。

②將重組菌接種于5mlsd液體培養(yǎng)基(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào)為gms12117.7)，37℃培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)接到100mlsyn6培養(yǎng)基(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào)為gms12116.1)，30℃培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。

③將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2lsyn6培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)。使用氨水控制ph維持在5.5，每4h檢測(cè)1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補(bǔ)加甘油，控制甘油終濃度在0.5％左右，同時(shí)控制溶氧在20％以上。根據(jù)菌體的生成情況檢測(cè)菌體濕重，等菌體濕重達(dá)到180-200g/l的時(shí)候停止補(bǔ)加甘油，開(kāi)始誘導(dǎo)重組gp96蛋白產(chǎn)生(補(bǔ)加甲醇，使甲醇濃度維持在0.5-0.8％左右)，誘導(dǎo)開(kāi)始72小時(shí)后停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。

3、gp96蛋白的分離純化

將步驟2得到的發(fā)酵液離心，收集菌體。用pbs緩沖液洗滌細(xì)胞2次，在球磨機(jī)(dyno-millmodelkdl)中，按照廠家提供的操作手冊(cè)使用玻璃珠球磨的方法破碎細(xì)胞，破碎后的細(xì)胞12000rpm/min離心20min，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濾液。將濾液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。

將濾液進(jìn)行親和層析，具體步驟如下：采用英俊公司(invitrogencorporation)的ni-ntapurificationsystem進(jìn)行親和層析，主要步驟為：先用pbs平衡柱子2h，然后用pbs(含20mm咪唑)平衡柱子2h。將濃縮液用pbs(含20mm咪唑)稀釋后上樣，用pbs(含20mm咪唑)沖洗柱子至od值<0.01，用pbs(含200mm咪唑)洗脫1.5h，收集洗脫液。所有操作均在4℃下進(jìn)行，流速為0.5ml/min。

每升步驟2得到的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液再進(jìn)行離子交換層析，主要步驟為：200mmnacl的pbs液平衡柱子，上樣，300mmnacl的pbs液洗雜質(zhì)，800mmnacl的pbs液洗脫目的蛋白。

將步驟2的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液和離子交換層析后的洗脫液進(jìn)行10％sds-page，然后考馬斯亮藍(lán)染色。將gp96蛋白進(jìn)行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購(gòu)自santacruz，產(chǎn)品號(hào)為sc-56399)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2顯示，離子交換層析后的洗脫液中的gp96蛋白純度很高。

(三)利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組gp96蛋白

1、重組質(zhì)粒pfastbac^tm1-gp96的構(gòu)建

①采用trizol法提取hepg2細(xì)胞的rna，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。

②根據(jù)人gp96基因(genbank號(hào)為ay040226.1)的序列，人工合成引物f1：5’-ggaattcatggacgatgaagttgat-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶ecorⅰ識(shí)別序列)和r1：5’-gctctagactattagaattcatctttttc-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶xbaⅰ識(shí)別序列)。

③完成步驟①和②后，以步驟①獲得的cdna為模板，以步驟②合成的f1和r1為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

④用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ雙酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

⑤用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ酶切質(zhì)粒pfastbac^tm1，回收約4700bp的載體骨架。

⑥將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。

⑦將步驟⑥獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh10bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌，然后提取該重組大腸桿菌的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pfastbac1的ecorⅰ和xbaⅰ識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pfastbac1被限制性核酸內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中序列1所示的雙鏈dna分子。重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96表達(dá)重組熱休克蛋白gp96(以下簡(jiǎn)稱gp96)gp96的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2、gp96的表達(dá)

①將步驟1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞(每1×10⁶個(gè)sf9細(xì)胞約轉(zhuǎn)染4μg重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96；共轉(zhuǎn)染過(guò)程中，轉(zhuǎn)染試劑為cellfectiniireagent，培養(yǎng)基為insect-xpress^tmprotein-freeinsectcellsmediumwithl-glutamine，27℃孵育72h，離心，上清液即為p1代病毒。

②將sf9細(xì)胞懸浮液1(含1×10⁸個(gè)sf9細(xì)胞)27℃培養(yǎng)8～10h，得到培養(yǎng)細(xì)胞；然后向所述培養(yǎng)細(xì)胞中加入p1代病毒(劑量為0.05～0.1moi)，27℃孵育72h，4000rpm離心5min，上清液即為p2代病毒。

③向sf9細(xì)胞懸浮液2(含1.6×10⁸個(gè)sf9細(xì)胞)中加入p2代病毒(劑量為0.05～0.1moi)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，4000rpm離心5min，上清液即為p3代病毒。

以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗，對(duì)p3代病毒進(jìn)行western雜交，western雜交具體步驟參考如下文獻(xiàn)：張悅鳴，段躍強(qiáng)，羅德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性il-5α受體在bac-to-bac系統(tǒng)中的表達(dá)及其鑒定[j].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013，26：5。

western雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，gp96在sf9細(xì)胞中表達(dá)。

3、gp96的純化

①向300ml的sf9細(xì)胞懸浮液3(含4.5×10⁸個(gè)sf9細(xì)胞)中加入p3代病毒(劑量為5moi)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，得到懸浮液。

②取所述懸浮液，7000rpm離心20min，獲得上清液1。

③取所述上清液1，經(jīng)0.22mm濾膜過(guò)濾，獲得上樣液。

④將所述上樣液上樣于hitrap-qsepharose離子交換層析柱(流速為1ml/min)，然后先用5ml的ph7.5、200mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)；再用10ml的ph7.5、300mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)；最后用3ml的ph7.5、600mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)，收集過(guò)柱后溶液并采用截留分子量為50kd的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到1ml左右的濃縮液。所述濃縮液即含有g(shù)p96。

⑤將步驟④得到的濃縮液上樣于superdex20010/300gl分子篩層析柱(流速為0.25ml/min)，然后用ph7.5、150mm的pbs緩沖液洗滌(流速為0.25ml/min)，收集為9～12ml處的穿透液，進(jìn)一步采用截留分子量為50kd的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到gp96的溶液。采用bca法測(cè)定gp96的溶液中的蛋白濃度，最后分裝，貯存于-80℃。

將步驟⑤得到的gp96的溶液進(jìn)行sds-page電泳分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3中左圖(泳道1為高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，泳道2為gp96，箭頭為gp96)。將步驟⑤得到的重組熱休克蛋白gp96的溶液進(jìn)行westernblot(以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3中右圖。結(jié)果表明，gp96的溶液顯示單一分子量條帶，對(duì)應(yīng)的分子量與預(yù)期一致。

實(shí)施例2、gp96在活化調(diào)節(jié)性t細(xì)胞中劑量的確定

一、小鼠分組免疫

將100只體重為18～22g的小鼠隨機(jī)分成胎盤gp96處理組1、胎盤gp96處理組2、胎盤gp96處理組3、酵母gp96處理組1、gp96處理組2、酵母gp96處理組3、昆蟲(chóng)gp96處理組1、昆蟲(chóng)gp96處理組2、昆蟲(chóng)gp96處理組3和對(duì)照組(每組10只)，分別進(jìn)行如下處理：

胎盤gp96處理組1：實(shí)驗(yàn)第1天，腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤組織提取的gp96的溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

胎盤gp96處理組2：按照胎盤gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為200μggp96/只。

胎盤gp96處理組3：按照胎盤gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為400μggp96/只。

酵母gp96處理組1：實(shí)驗(yàn)第1天，腹腔注射實(shí)施例1利用漢遜酵母表達(dá)制備的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤組織提取的gp96的溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

酵母gp96處理組2：按照酵母gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為200μggp96/只。

酵母gp96處理組3：按照酵母gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為400μggp96/只。

昆蟲(chóng)gp96處理組1：實(shí)驗(yàn)第1天，腹腔注射實(shí)施例1利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)制備的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)制備的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)制備的gp96的溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

昆蟲(chóng)gp96處理組2：按照昆蟲(chóng)gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為200μggp96/只。

昆蟲(chóng)gp96處理組3：按照昆蟲(chóng)gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為400μggp96/只。

對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)第1天腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液，實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液。每次注射劑量均為100μl/只。

二、小鼠淋巴細(xì)胞分離

取完成步驟一后第8天的小鼠，獲取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(每只小鼠取3×10⁶個(gè)脾臟淋巴細(xì)胞)。

三、gp96在活化調(diào)節(jié)性t細(xì)胞中劑量的確定

1、取步驟二獲取的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(少于1×10⁶個(gè))，1000rpm離心10min，收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。

2、完成步驟1后，取所述小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，加入100μl含5％(質(zhì)量體積比)bsa的ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液重懸，4℃封閉20min；然后1000rpm離心10min，用100μl上清液重懸沉淀，得到混合液甲。

3、完成步驟2后，取所述混合液甲，加入fitc-anti-cd3、pe-anti-cd4和percp-cy5.5-anti-cd25，4℃避光孵育20min。

4、完成步驟3后，取所述混合液甲，加入1mlph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液，震蕩混勻，1000rpm離心10min，收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，然后用400μlph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液重懸，得到混合液乙。

5、完成步驟4后，取所述混合液乙，加入600μl固定/破膜劑，4℃破膜30min(實(shí)際操作過(guò)程中不超過(guò)1h即可)；然后1000rpm離心10min，收集沉淀，得到沉淀1。

6、完成步驟5后，取所述沉淀1，加入1ml1×洗滌液重懸，1000rpm離心10min，得到沉淀2和上清液丙。取100μl上清液丙重懸沉淀2，得到混合液丙；向混合液丙中加入apc-anti-foxp3，4℃避光孵育30min。

7、完成步驟6后，取所述混合液丙，加入1ml1×洗滌液重懸，1000rpm離心10min，收集沉淀，得到沉淀3。取400μl含4％(質(zhì)量體積比)多聚甲醛的ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液重懸沉淀3，然后用流式細(xì)胞儀分析小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的頻率。

表1gp96免疫對(duì)大鼠調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的影響(平均值±sd值)

注：與對(duì)照組相比，^*p<0.01.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明，胎盤、酵母和昆蟲(chóng)共9組gp96處理組中小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞中cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的頻率顯著均高于對(duì)照組。因此，人胎盤組織、漢遜酵母重組表達(dá)和昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)的gp96蛋白均可以顯著誘導(dǎo)cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生。而200μggp96和400μg人胎盤組織、漢遜酵母重組表達(dá)和昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)的gp96蛋白均可以顯著誘導(dǎo)更高cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生。

實(shí)施例3、gp96在治療重癥肌無(wú)力中的應(yīng)用

1、重癥肌無(wú)力小鼠模型的建立

eamg模型用achr和福氏佐劑1:2混勻后免疫小鼠，初次致敏取achr15μg制成200μl抗原乳劑，于背部、肢體、尾基部多處皮內(nèi)接種。4周后用含15μgachr的抗原乳劑100μl再次接種。佐劑對(duì)照組用等量福氏佐劑免疫。末次免疫后7～14d對(duì)模型進(jìn)行判定。

判定標(biāo)準(zhǔn)：

(1)臨床表現(xiàn)：eamg小鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯、隆背、食量下降、活動(dòng)減少和跛足等不同程度的肌無(wú)力表現(xiàn)；

(2)游泳試驗(yàn)：eamg小鼠游泳時(shí)間明顯短于佐劑對(duì)照組。

2、gp96蛋白治療實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力小鼠的臨床療效

120只體重為18～22g的重癥肌無(wú)力昆明種小鼠，隨機(jī)分成4組(每組30只)，分別進(jìn)行如下處理：

gp96處理組1：實(shí)驗(yàn)第1天，腹腔注射實(shí)施例1制備人胎盤組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射實(shí)施例1制備人胎盤組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射實(shí)施例1制備的人胎盤組織提取gp96的溶液。每次注射劑量均為200μggp96/只。

gp96處理組2：按照gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射用gp96蛋白改為酵母菌重組表達(dá)gp96蛋白。

gp96處理組3：按照gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射用gp96蛋白改為昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)gp96蛋白。

對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)第1天腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液，實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液。每次注射劑量均為100μl/只。

1)體重檢測(cè)：gp96蛋白免疫治療當(dāng)日起每日稱重小鼠。

2)臨床評(píng)分：采用盲法由兩個(gè)觀察者對(duì)小鼠進(jìn)行eamg嚴(yán)重性的臨床評(píng)估。0分:肌力正常；1分:活動(dòng)輕度減少，抓握無(wú)力或低吟，易疲勞；2分:活動(dòng)明顯減少，體重明顯減輕，休息時(shí)呈弓背、頭低伏，前趾彎曲、周身發(fā)抖；3分:嚴(yán)重的周身無(wú)力，無(wú)低吟，無(wú)抓握動(dòng)作，呈瀕死狀態(tài)或死亡。癥狀居中間者分別評(píng)分為0.5、1.5、2.5分。分別于治療后第4周進(jìn)行臨床評(píng)分。

gp96免疫對(duì)小鼠體重影響的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)gp96免疫小鼠的體重顯著升高，3組gp96處理組無(wú)顯著差異。

表2gp96免疫對(duì)小鼠體重的影響(平均值±sd值)

注：與對(duì)照組相比，^*p<0.01.

gp96免疫對(duì)小鼠臨床評(píng)分的影響檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)gp96免疫小鼠的臨床評(píng)分顯著降低，3組gp96處理組無(wú)顯著差異。

表3gp96免疫對(duì)小鼠小鼠臨床評(píng)分的影響(平均值±sd值)

注：與對(duì)照組相比，^*p<0.01.

上述結(jié)果表明，用gp96免疫小鼠，能夠有效的治療或減輕重癥肌無(wú)力的癥狀。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>北京熱休生物技術(shù)有限公司

<120>熱休克蛋白gp96在治療重癥肌無(wú)力癥中的應(yīng)用

<130>khp171110211.5

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2352

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaa60

ggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagaggaagaagctattcagttggatgga120

ttaaatgcatcacaaataagagaacttagagagaagtcggaaaagtttgccttccaagcc180

gaagttaacagaatgatgaaacttatcatcaattcattgtataaaaataaagagattttc240

ctgagagaactgatttcaaatgcttctgatgctttagataagataaggctaatatcactg300

actgatgaaaatgctctttctggaaatgaggaactaacagtcaaaattaagtgtgataag360

gagaagaacctgctgcatgtcacagacaccggtgtaggaatgaccagagaagagttggtt420

aaaaaccttggtaccatagccaaatctgggacaagcgagtttttaaacaaaatgactgaa480

gcacaggaagatggccagtcgtcttctgaattgattggccagtttggtgtcggtttctat540

tccgccttccttgtagcagataaggttattgtcacttcaaaacacaacaacgatacccag600

cacatctgggagtctgactccaatgaattttctgtaattgctgacccaagaggaaacact660

ctaggacggggaacgacaattacccttgtcttaaaagaagaagcatctgattaccttgaa720

ttggatacaattaaaaatctcgtcaaaaaatattcacagttcataaactttcctatttat780

gtatggagcagcaagactgaaactgttgaggagcccatggaggaagaagaagcagccaaa840

gaagagaaagaagaatctgatgatgaagctgcagtagaggaagaagaagaagaaaagaaa900

ccaaagactaaaaaagttgaaaaaactgtctgggactgggaacttatgaatgatatcaaa960

ccaatatggcagagaccatcaaaagaagtagaagaagatgaatacaaagctttctacaaa1020

tcattttcaaaggaaagtgatgaccccatggcttatattcactttactgctgaaggggaa1080

gttaccttcaaatcaattttatttgtacccacatctgctccacgtggtctgtttgacgaa1140

tatggatctaaaaagagcgattacattaagctctatgtgcgccgtgtattcatcccagac1200

gacttccatgatatgatgcctaaatacctcaattttgtcaagggtgtggtggactcagat1260

gatctccccttgaatgtttcccgcgagactcttcagcaacataaactgcttaaggtgatt1320

aggaagaagcttgttcgtaaaacgctggacatgatcaagaagattgctgatgataaatac1380

aatgatactttttggaaagaatttggtaccaacatcaagcttggtgtgattgaagaccac1440

tcgaatcgaacacgtcttgctaaacttcttaggttccagtcttctcatcatccaactgac1500

attactagcctagaccagtatgtggaaagaatgaaggaaaaacaagacaaaatctacttc1560

atggctgggtccagcagaaaagaggctgaatcttctccatttgttgagcgacttctgaaa1620

aagggctatgaagttatttacctcacagaacctgtggatgaatactgtattcaggccctt1680

cccgaatttgatgggaagaggttccagaatgttgccaaggaaggagtgaagttcgatgaa1740

agtgagaaaactaaggagagtcgtgaagcagttgagaaagaatttgagcctctgctgaat1800

tggatgaaagataaagcccttaaggacaagattgaaaaggctgtggtgtctcagcgcctg1860

acagaatctccgtgtgctttggtggccagccagtacggatggtctggcaacatggagaga1920

atcatgaaagcacaagcgtaccaaacgggcaaggacatctctacaaattactatgcgagt1980

cagaagaaaacatttgaaattaatcccagacacccgctgatcagagacatgcttcgacga2040

attaaggaagatgaagatgataaaacagttttggatcttgctgtggttttgtttgaaaca2100

gcaacgcttcggtcagggtatcttttaccagacactaaagcatatggagatagaatagaa2160

agaatgcttcgcctcagtttgaacattgaccctgatgcaaaggtggaagaagagcccgaa2220

gaagaacctgaggagacagcagaagacacaacagaagacacagagcaagacgaagatgaa2280

gaaatggatgtgggaacagatgaagaagaagaaacagcaaaggaatctacagctgaaaaa2340

gatgaattctaa2352

<210>2

<211>783

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

metaspaspgluvalaspvalaspglythrvalglugluaspleugly

151015

lysserarggluglyserargthraspaspgluvalvalglnargglu

202530

gluglualaileglnleuaspglyleuasnalaserglnileargglu

354045

leuargglulysserglulysphealapheglnalagluvalasnarg

505560

metmetlysleuileileasnserleutyrlysasnlysgluilephe

65707580

leuarggluleuileserasnalaseraspalaleuasplysilearg

859095

leuileserleuthraspgluasnalaleuserglyasnglugluleu

100105110

thrvallysilelyscysasplysglulysasnleuleuhisvalthr

115120125

aspthrglyvalglymetthrargglugluleuvallysasnleugly

130135140

thrilealalysserglythrserglupheleuasnlysmetthrglu

145150155160

alaglngluaspglyglnsersersergluleuileglyglnphegly

165170175

valglyphetyrseralapheleuvalalaasplysvalilevalthr

180185190

serlyshisasnasnaspthrglnhisiletrpgluseraspserasn

195200205

glupheservalilealaaspproargglyasnthrleuglyarggly

210215220

thrthrilethrleuvalleulysgluglualaserasptyrleuglu

225230235240

leuaspthrilelysasnleuvallyslystyrserglnpheileasn

245250255

pheproiletyrvaltrpserserlysthrgluthrvalgluglupro

260265270

metgluglugluglualaalalysgluglulysglugluseraspasp

275280285

glualaalavalgluglugluglugluglulyslysprolysthrlys

290295300

lysvalglulysthrvaltrpasptrpgluleumetasnaspilelys

305310315320

proiletrpglnargproserlysgluvalglugluaspglutyrlys

325330335

alaphetyrlysserpheserlysgluseraspaspprometalatyr

340345350

ilehisphethralagluglygluvalthrphelysserileleuphe

355360365

valprothrseralaproargglyleupheaspglutyrglyserlys

370375380

lysserasptyrilelysleutyrvalargargvalpheileproasp

385390395400

aspphehisaspmetmetprolystyrleuasnphevallysglyval

405410415

valaspseraspaspleuproleuasnvalserarggluthrleugln

420425430

glnhislysleuleulysvalilearglyslysleuvalarglysthr

435440445

leuaspmetilelyslysilealaaspasplystyrasnaspthrphe

450455460

trplysglupheglythrasnilelysleuglyvalilegluasphis

465470475480

serasnargthrargleualalysleuleuargpheglnserserhis

485490495

hisprothraspilethrserleuaspglntyrvalgluargmetlys

500505510

glulysglnasplysiletyrphemetalaglyserserarglysglu

515520525

alagluserserprophevalgluargleuleulyslysglytyrglu

530535540

valiletyrleuthrgluprovalaspglutyrcysileglnalaleu

545550555560

proglupheaspglylysargpheglnasnvalalalysgluglyval

565570575

lyspheaspgluserglulysthrlysgluserargglualavalglu

580585590

lysgluphegluproleuleuasntrpmetlysasplysalaleulys

595600605

asplysileglulysalavalvalserglnargleuthrgluserpro

610615620

cysalaleuvalalaserglntyrglytrpserglyasnmetgluarg

625630635640

ilemetlysalaglnalatyrglnthrglylysaspileserthrasn

645650655

tyrtyralaserglnlyslysthrphegluileasnproarghispro

660665670

leuileargaspmetleuargargilelysgluaspgluaspasplys

675680685

thrvalleuaspleualavalvalleuphegluthralathrleuarg

690695700

serglytyrleuleuproaspthrlysalatyrglyaspargileglu

705710715720

argmetleuargleuserleuasnileaspproaspalalysvalglu

725730735

glugluprogluglugluproglugluthralagluaspthrthrglu

740745750

aspthrgluglnaspgluaspgluglumetaspvalglythraspglu

755760765

gluglugluthralalysgluserthralaglulysaspgluphe

770775780

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ccggaattcatggacgatgaagttgatg28

<210>4

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ccgctcgagctattagaattcatctttttcagctgtag38