本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程與生物醫(yī)藥應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及APO-E蛋白及其多肽在治療與預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)資料統(tǒng)計，乳腺癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10％，在很多地區(qū)已經(jīng)超過子宮癌，成為嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的腫瘤之一。乳腺癌的發(fā)病與患者的遺傳基因、生活習(xí)慣、常用食物、生育狀況等緊密相關(guān)，不同人種、地域的乳腺癌發(fā)病率有著明顯的區(qū)別。乳腺癌的高發(fā)地區(qū)，主要集中在北美、北歐和大洋洲，尤其白種女性居多。乳腺癌的中發(fā)地區(qū)，集中在南美、南歐和以色列。亞洲則是乳腺癌的低發(fā)地區(qū)。舉例來說，美國白種女性一生乳腺癌發(fā)病率為13.1％，即平均每8-9人就有1人可能會患上乳腺癌，而亞洲女性的乳腺癌發(fā)病率為4-7％。WHO統(tǒng)計，全球每年新發(fā)乳腺癌達130萬人左右，死亡50萬人左右。在我國北京、上海、天津等大城市的乳腺癌發(fā)病已躍居女性各種癌瘤首位,而且有明顯上升的趨勢。肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種。原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)男性癌癥患者中，肝癌比例排第六，死亡率排在第二；在女性癌癥患者中，肝癌比例排第七，死亡率排第六。2008年，全世界共有748,300個新增肝癌病例，有695,900例肝癌患者死亡。而這些新增肝癌病例和死亡病例中有一半在中國。肝癌發(fā)生率最高的區(qū)域主要在東亞，東南亞，中非和西非國家。亞洲部分地區(qū)和非洲撒哈拉以南地區(qū)之所以肝癌發(fā)生率較高，可能是因為這些地區(qū)HBV盛行，因為這些地區(qū)8％的居民慢性感染HBV，在發(fā)展中國家60％的肝癌患者感染過HBV。載脂蛋白(apolipoprotein，apo)是血漿脂蛋白的主要組分，其中脂蛋白E(apoE)是載脂蛋白家族成員中重要的一種。血漿中60％-80％的apoE主要由肝臟分泌。apo作為一種多功能的血漿脂蛋白，在維持脂蛋白的結(jié)構(gòu)，脂類代謝調(diào)節(jié)以及神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要的作用。此外，研究顯示apoE在免疫調(diào)節(jié)以及腫瘤發(fā)生中也起到關(guān)鍵作用。某些癌癥組織，如肝癌組織中apoE的表達明顯升高，此外apoE的表達與腫瘤的預(yù)后有著密切的聯(lián)系。熱休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)是一類在生物進化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。HSP根據(jù)同源程度和分子量大小可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多個亞家族。熱休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)gp96屬于HSP90亞家族的成員，該蛋白是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上含量最豐富的熱休克蛋白。熱休克蛋白gp96蛋白具有多肽結(jié)合特性，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)其能接受來自TAP復(fù)合體的多肽片段，協(xié)助將其組裝至MHCI類分子，遞呈于細胞膜上。不同組織來源的熱休克蛋白gp96能攜帶有其來源組織內(nèi)特異性表達的多肽片段。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能預(yù)防及治療癌癥的靶標(biāo)蛋白及其多肽的應(yīng)用方法。本發(fā)明首先提供了一種APO-E蛋白，所述APO-E蛋白的氨基酸序列含有如下：i)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；或ii)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列自N端起第2位至最后一位氨基酸序列；或iii)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。本發(fā)明提供了上述APO-E蛋白在制備預(yù)防和/或治療癌癥藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了編碼APO-E蛋白的基因，該基因的核苷酸序列含有如下：i)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或iii)與SEQIDNO.1所示的核苷酸具有75％及以上同源性的核苷酸序列；或iv)在嚴格條件下與SEQIDNO.1所示序列雜交的核苷酸序列；所述嚴格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。本發(fā)明提供了編碼APO-E蛋白的基因在制備預(yù)防和/或治療癌癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了含有編碼APO-E蛋白的基因的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細胞、轉(zhuǎn)基因細胞系、工程菌、昆蟲或酵母。進一步地，本發(fā)明提供了上述生物材料在制備預(yù)防和/或治療癌癥藥物中的應(yīng)用。所述藥物為治療或預(yù)防乳腺癌或肝癌的藥物，具有以下至少一種的功能：(1)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)生率；(2)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生率；(3)減緩或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的生長；(4)減緩或停止已建立的肝癌腫瘤灶的生長；(5)減少或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；(6)減少或停止已建立的肝癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；(7)誘導(dǎo)產(chǎn)生乳腺癌特異性的CTL細胞并對乳腺癌細胞殺傷；(8)誘導(dǎo)產(chǎn)生肝癌特異性的CTL細胞并對肝癌細胞殺傷。本發(fā)明提供了含有APO-E蛋白或其多肽的藥物。本發(fā)明提供了含有APO-E蛋白與熱休克蛋白gp96組成的復(fù)合物或含有APO-E蛋白的多肽與熱休克蛋白gp96組成的復(fù)合物的藥物。所述熱休克蛋白gp96的氨基酸序列含有SEQIDNO.4所述的序列或SEQIDNO.4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為以下任一：(1)從離體哺乳動物的胎盤組織中提??；(2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)，包括利用酵母、哺乳動物細胞表達體系表達，純化得到。所述離體哺乳動物可為人、鼠來源。所述鼠包括但不限于C57BL/6及BALB/c小鼠。所述復(fù)合物是通過以下方式獲得：(1)將APO-E蛋白或其多肽與熱休克蛋白gp96在體外以自然吸附或熱擊方式形成復(fù)合物；或(2)將編碼APO-E蛋白或其多肽與編碼熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)、純化獲得復(fù)合物。所述“將編碼APO-E蛋白或其多肽與編碼熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中”可通過漢遜酵母表達。所述“將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中”可通過向受體中導(dǎo)入重組載體實現(xiàn)；所述重組載體可為將所述熱休克蛋白gp96的編碼基因插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96。所述重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96具體可為在質(zhì)粒pFastBac1的多克隆位點插入序列表中SEQIDNO.3所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96具體可為將質(zhì)粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ識別序列間的片段(質(zhì)粒pFastBac1被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為SEQIDNO.1所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述受體可為Sf9細胞。本發(fā)明提供了上述APO-E蛋白及其多肽與熱休克蛋白gp96組成的復(fù)合物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物中的應(yīng)用。所述藥物為治療或預(yù)防乳腺癌或肝癌的藥物，具有以下至少一種的功能：(1)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)生率；(2)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生率；(3)減緩或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的生長；(4)減緩或停止已建立的肝癌腫瘤灶的生長；(5)減少或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；(6)減少或停止已建立的肝癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；(7)誘導(dǎo)產(chǎn)生乳腺癌特異性的CTL細胞并對乳腺癌細胞殺傷；(8)誘導(dǎo)產(chǎn)生肝癌特異性的CTL細胞并對肝癌細胞殺傷。應(yīng)用本發(fā)明的上述藥物，針對免疫對象，免疫劑量為每次不少于10μg，總共不少于3次，采取皮下注射、皮內(nèi)注射或腹腔注射方式進行免疫。本發(fā)明的藥物(疫苗)免疫數(shù)周后，可引發(fā)機體的特異免疫反應(yīng)，清除體內(nèi)腫瘤干細胞和/或腫瘤休眠細胞，以及癌變的細胞，從而達到預(yù)防和治療癌癥的目的。本發(fā)明可作為腫瘤預(yù)防性疫苗，用于自體或異體腫瘤防治，降低健康人群中癌癥的發(fā)生率，也可作為腫瘤治療性疫苗，患者術(shù)后即時施治能有效防轉(zhuǎn)移防復(fù)發(fā)，或作為化學(xué)療法的輔助治療。本發(fā)明的也可以用于異體腫瘤的免疫防治。附圖說明圖1為胎盤gp96的SDS-PAGE和Westernblot鑒定結(jié)果。圖2為酵母表達gp96的SDS-PAGE和WesternBlot鑒定結(jié)果，圖中，1：分子量標(biāo)準；2：步驟2的發(fā)酵液；3：親和層析后的洗脫液；4：離子交換層析后的洗脫液；5：westernblot鑒定圖。。圖3為昆蟲表達gp96的SDS-PAGE和WesternBlot的鑒定結(jié)果。圖4為多肽-gp96復(fù)合物對乳腺癌的治療作用(腫瘤體積)。圖5為多肽-gp96復(fù)合物對肝癌的治療作用(腫瘤體積)。圖6為多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL對于人乳腺癌細胞殺傷作用。圖7位多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL對于人乳肝癌細胞殺傷作用。具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。雌性C57BL/6與雌性BALB/C小鼠為北京維通利華實驗動物有限責(zé)任公司產(chǎn)品；在下文中簡稱小鼠。多肽由上海吉爾生化有限公司合成。HepG2細胞(人肝癌細胞)為ATCC公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為HB-8065TM。MCF-7細胞(人乳腺癌細胞)為ATCC公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為HTB-22TM。H22及HHCC細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心，資源號分別為3111C0001CCC000309、3111C0002000000069。Sf9細胞為Invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為11496-015。CellfectinIIreagent為Lifetechnologies公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為10362-100。質(zhì)粒pFastBacTM1為Invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為10359-016。gp96單克隆抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為sc-56399。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為ZB-2307。HiTrap-QSepharose離子交換層析柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17-5053-01。Superdex20010/300GL分子篩層析柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17517501。大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為CL108-01。Insect-XPRESSTMProtein-freeInsectCellsmediumwithL-Glutamine為LONZA公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為12-730Q。BSA、PMSF、NaHCO3、MnCl2、CaCl2、NaCl2、Tris、甲基α-D-吡喃甘露糖苷均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號分別為V900933、P7626、792519、V900197、793639、746398、T1378、M6882。溶液A：溶質(zhì)及其濃度為PMSF1mM和NaHCO330mM；溶劑為蒸餾水；pH值為7.4。溶液B：溶質(zhì)及其濃度為2mMMnCl2、2mMCaCl2、500mMNaCl和PMSF1mM；溶劑為pH7.4、20mMTris-HCl緩沖液。溶液C：溶質(zhì)及其濃度為10％(質(zhì)量體積比)甲基α-D-吡喃甘露糖苷、500mMNaCl和1mMPMSF；溶劑為pH7.4、20mMTris-HCl緩沖液。清洗液：用蒸餾水將溶液B稀釋至10倍體積。ConA瓊脂糖凝膠柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17-0440-01，該柱的規(guī)格為1.6×2.5cm，填充介質(zhì)為ConA-Sepharose4B。HitrapQ陰離子交換柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17-1153-01，該柱的規(guī)格為0.7×2.5cm。HRP標(biāo)記的IgG抗體為SEROTEC公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為STAR117P。1×洗滌液為含0.1％(體積百分比)Triton-X100的pH7.4、0.01mol/LPBS緩沖液。50kD與3kD超濾管為MerckMillipore公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號分別為UFC905096、UFC500324。實施例1胎盤中g(shù)p96的提取組織中熱休克蛋白gp96(以下簡稱pgp96)的提取步驟如下：(1)分離分娩前的小鼠的胎盤組織，得到小鼠離體胎盤組織。取小鼠離體胎盤組織或人離體胎盤組織，剪碎，按質(zhì)量體積比1g：4mL加入溶液A，然后用玻璃勻漿器磨碎。(2)完成步驟(1)后，16500g離心1h，得到上清液甲。(3)完成步驟(2)后，取上清液甲，16500g離心50min，得到上清液乙。(4)完成步驟(3)后，取上清液乙，按體積比9：1加入溶液B，混勻后得到上樣液。(5)完成步驟(4)后，將上樣液上樣至ConA瓊脂糖凝膠柱。(6)完成步驟(5)后，用清洗液洗脫所述ConA瓊脂糖凝膠柱，洗脫過程中實時監(jiān)測紫外吸收值，檢測波長為280nm，直至洗脫產(chǎn)物的紫外吸收值低于0.01。(7)完成步驟(6)后，用溶液C洗脫所述ConA瓊脂糖凝膠柱，棄去首先流出的過柱后溶液0.5個柱體積，然后收集之后流出的過柱后溶液1個柱體積；將所述ConA瓊脂糖凝膠柱孵育50min后，再收集過柱后溶液1.5個柱體積。將兩次收集的過柱后溶液合并，即為ConA洗脫液。(8)完成步驟(7)后，將ConA洗脫液上樣至HitrapQ陰離子交換柱。(9)完成步驟(8)后，用含NaCl的pH7.4、12mM的PBS緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為1mL/min。梯度洗脫程序：在pH7.412mM的PBS緩沖液中使NaCl含量由300mM勻速增至800mM，線性梯度洗脫20個柱體積。收集合并NaCl含量為400～450mM的洗脫液，即為洗脫液甲。(10)完成步驟(9)后，取洗脫液甲，用超濾管進行超濾濃縮，得到pgp96的溶液。pgp96的溶液中，pgp96濃度為5mg/mL。將pgp96的溶液進行SDS-PAGE電泳分析和Westernblot(以gp96單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的IgG抗體作為二抗)，實驗結(jié)果見圖1(箭頭所指為pgp96)。結(jié)果表明，pgp96的溶液顯示單一分子量條帶，對應(yīng)的分子量為96kDa。實施例2利用漢遜酵母表達的重組gp96蛋白制備一、重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的構(gòu)建1、提取人肝癌細胞HepG2的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。2、以步驟1的cDNA為模板進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。PCR引物如下：Fp(5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3')Rp(5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3')3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pHFMDZ-R1A(購自Invitrogen公司，產(chǎn)品號為V20520)，回收載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96并測序。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架載體為pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位點之間插入了gp96蛋白的編碼序列。二、gp96蛋白的表達1、采用電轉(zhuǎn)化法將步驟1得到的重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96導(dǎo)入漢遜酵母(購自ATCC，產(chǎn)品號為MYA-335)細胞，得到重組菌。2、將重組菌接種于5mLSD液體培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號為GMS12117.7)，37℃培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)接到100mLSYN6培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號為GMS12116.1)，30℃培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。3、將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2LSYN6培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)。使用氨水控制pH維持在5.5，每4h檢測1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補加甘油，控制甘油終濃度在0.5％左右，同時控制溶氧在20％以上。根據(jù)菌體的生成情況檢測菌體濕重，等菌體濕重達到180-200g/L的時候停止補加甘油，開始誘導(dǎo)重組gp96蛋白產(chǎn)生(補加甲醇，使甲醇濃度維持在0.5-0.8％左右)，誘導(dǎo)開始72小時后停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。三、gp96蛋白的分離純化將步驟2得到的發(fā)酵液離心，收集菌體。用PBS緩沖液洗滌細胞2次，在球磨機(DYNO-MILLmodelKDL)中，按照廠家提供的操作手冊使用玻璃珠球磨的方法破碎細胞，破碎后的細胞12000rpm/min離心20min，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜進行過濾，得到濾液。將濾液進行濃縮，得到濃縮液。將濾液進行親和層析，具體步驟如下：采用英俊公司(InvitrogenCorporation)的Ni-NTAPurificationSystem進行親和層析，主要步驟為：先用PBS平衡柱子2h，然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h。將濃縮液用PBS(含20mM咪唑)稀釋后上樣，用PBS(含20mM咪唑)沖洗柱子至OD值<0.01，用PBS(含200mM咪唑)洗脫1.5h，收集洗脫液。所有操作均在4℃下進行，流速為0.5mL/min。每升步驟2得到的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液再進行離子交換層析，主要步驟為：200mMNaCl的PBS液平衡柱子，上樣，300mMNaCl的PBS液洗雜質(zhì)，800mMNaCl的PBS液洗脫目的蛋白。將步驟2的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液和離子交換層析后的洗脫液進行10％SDS-PAGE，然后考馬斯亮藍染色。將gp96蛋白進行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購自santacruz，產(chǎn)品號為sc-56399)，結(jié)果見圖2。圖2顯示，離子交換層析后的洗脫液中的gp96蛋白純度很高。實施例3昆蟲細胞表達的重組熱休克蛋白gp96的制備一、重組質(zhì)粒pFastBacTM1-gp96的構(gòu)建1、采用Trizol法提取HepG2細胞的RNA，然后進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。2、根據(jù)人gp96基因(GenBank號為AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ識別序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶XbaⅠ識別序列)。3、完成步驟1和2后，以步驟1獲得的cDNA為模板，以步驟2合成的F1和R1為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒pFastBacTM1，回收約4700bp的載體骨架。6、將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。7、將步驟6獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，得到重組大腸桿菌，然后提取該重組大腸桿菌的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ識別序列間的片段(質(zhì)粒pFastBac1被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為序列表中SEQIDNO.3所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96表達重組熱休克蛋白gp96(以下簡稱rgp96)，rgp96的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。二、rgp96的表達1、將步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96共轉(zhuǎn)染Sf9細胞(每1×106個Sf9細胞約轉(zhuǎn)染4μg重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96；共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為CellfectinIIreagent，培養(yǎng)基為Insect-XPRESSTMProtein-freeInsectCellsmediumwithL-Glutamine，27℃孵育72h，離心，上清液即為P1代病毒。2、將Sf9細胞懸浮液1(含1×108個Sf9細胞)27℃培養(yǎng)8～10h，得到培養(yǎng)細胞；然后向所述培養(yǎng)細胞中加入P1代病毒(劑量為0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm離心5min，上清液即為P2代病毒。3、向Sf9細胞懸浮液2(含1.6×108個Sf9細胞)中加入P2代病毒(劑量為0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，4000rpm離心5min，上清液即為P3代病毒。以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗，對P3代病毒進行western雜交，western雜交具體步驟參考如下文獻：張悅鳴，段躍強，羅德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受體在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達及其鑒定[J].中國生物制品學(xué)雜志，2013，26：5。western雜交實驗結(jié)果表明，rgp96在Sf9細胞中表達。三、rgp96的純化1、向300ml的Sf9細胞懸浮液3(含4.5×108個Sf9細胞)中加入P3代病毒(劑量為5MOI)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，得到懸浮液。2、取所述懸浮液，7000rpm離心20min，獲得上清液1。3、取所述上清液1，經(jīng)0.22mm濾膜過濾，獲得上樣液。4、將所述上樣液上樣于HiTrap-QSepharose離子交換層析柱(流速為1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)，收集過柱后溶液并采用截留分子量為50KD的超濾管進行超濾濃縮，得到1mL左右的濃縮液。所述濃縮液即含有rgp96。5、將步驟4得到的濃縮液上樣于Superdex20010/300GL分子篩層析柱(流速為0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS緩沖液洗滌(流速為0.25mL/min)，收集為9～12mL處的穿透液，進一步采用截留分子量為50KD的超濾管進行超濾濃縮，得到rgp96的溶液。采用BCA法測定rgp96的溶液中的蛋白濃度，最后分裝，貯存于-80℃。將步驟5得到的rgp96的溶液進行SDS-PAGE電泳分析，實驗結(jié)果見圖2中左圖(泳道1為高分子量標(biāo)準蛋白質(zhì)，泳道2為rgp96，箭頭為rgp96)。將步驟5得到的重組熱休克蛋白gp96的溶液進行Westernblot(以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗)，實驗結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，rgp96的溶液顯示單一分子量條帶，對應(yīng)的分子量與預(yù)期一致。實施例4APO-E多肽與胎盤gp96結(jié)合的復(fù)合物制備與鑒定一、小鼠胎盤gp96結(jié)合的多肽鑒定1、多肽洗脫：取5mg實施例1提取的濃度為10mg/mL小鼠胎盤pgp96，加入5μL含有20％(體積比)三氟乙酸的水溶液，4℃中孵育1h。2、將步驟1中的孵育液加入3kD超濾管中，12,000rpm離心30min，取穿透液。3、將步驟2中的穿透液注入Agilent1200高壓液相色譜儀進行脫鹽純化(色譜柱型號SB-C182.1mm×250mm)，程序如下：A相：5％(體積比)乙腈水溶液，含0.1％三氟乙酸；B相：乙腈，含0.1％三氟乙酸；0-30min100％A，30-70min100％B。4、收集步驟3中30-70分鐘的洗脫液，凍干。5、將步驟4的凍干粉末用0.1％(體積比)的甲酸水溶液重溶，注入OrbitrapFusion高分辨率質(zhì)譜儀，分析多肽序列，并從數(shù)據(jù)庫中進行匹配。匹配結(jié)果見表1。表1與小鼠胎盤gp96結(jié)合的蛋白多肽匹配結(jié)果二、APOE多肽-gp96復(fù)合物制備1、將表1得到的APO-E蛋白結(jié)果氨基酸序列輸入該網(wǎng)址http://tools.immuneepitope.org/mhci/進行MHCI類分子的表位預(yù)測，分別選取最優(yōu)的H-2Kd、H-2Kb及HLA-A2限制性表位并化學(xué)合成，預(yù)測HLA-A2表位時所選用的氨基酸序列應(yīng)為人類中的同源蛋白。表位篩選結(jié)果見表2。表2APO-E蛋白多肽的表位篩選結(jié)果MHCI限制型多肽序列多肽位置H-2KdVYKAGAREGAERGV171-184H-2KbTMLGQSTEEIRARL134-147HLA-A2FLAGCQAKV12-202、分別化學(xué)合成以上多肽(上海吉爾生化有限公司)，將合成的多肽用細胞級DMSO(Sigma-Aldrich公司，目錄號D2650)復(fù)溶為20mg/mL濃度，分別取1mg多肽與1mg實施例3中制備的重組rgp96，用pH7.40.01mol/LPBS緩沖液稀釋至4mL體積。55℃熱擊10分鐘，在室溫冷卻30分鐘。然后采用50kD超濾管洗去未結(jié)合的多肽，分別制備獲得不同限制性表位的APOE多肽-gp96復(fù)合物。實施例5APOE多肽-gp96復(fù)合物對乳腺癌的預(yù)防與治療作用一、APOE多肽-gp96復(fù)合物對原發(fā)性乳腺癌的預(yù)防作用取8周齡C57BL/6小鼠20只分成兩組，每組10只，分別進行如下處理：第一組：腹部皮下注射實施例4制備的APOE多肽H-2Kb-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；第二組：腹部皮下注射實施例3制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；以上兩組中：實驗第1天進行第一次免疫；第8天進行第二次免疫；第22天進行第三次免疫。免疫完成后1周開始每只小鼠按50mg/kg劑量口服灌胃食用橄欖油配制的DMBA(Sigma-Aldrich公司，目錄號D3254)溶液，每周1次，連續(xù)5周，誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)病。自有小鼠產(chǎn)生乳腺癌腫瘤開始(約造模后14周左右)每周檢測腫瘤生長，并統(tǒng)計腫瘤發(fā)生率與計算腫瘤體積。腫瘤體積計算公式V＝ab2/2(V—體積,a—腫瘤長徑,b—腫瘤短徑)。一直觀察到34周，計算腫瘤發(fā)生率、腫瘤個數(shù)與平均腫瘤大小。統(tǒng)計結(jié)果見表3。從結(jié)果可以看出，APOE多肽-gp96復(fù)合物對DMBA誘導(dǎo)的乳腺癌有明顯的預(yù)防作用。免疫APOE多肽-gp96復(fù)合物后乳腺癌的發(fā)病率明顯降低，發(fā)病時間推遲，腫瘤個數(shù)及腫瘤體積均減小。表3DMBA誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌腫瘤統(tǒng)計結(jié)果二、APOE多肽-gp96復(fù)合物對誘導(dǎo)乳腺癌模型的治療作用取20只6-8周的雌性Balb/c小鼠，每只皮下分別接種6×105TUBO細胞，第2天將小鼠分成兩組，每組10只，分別進行如下處理：第一組：腹部皮下注射實施例4制備的APOE多肽(H-2Kd)-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；第二組：腹部皮下注射實施例3制備的gp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；以上兩組中：接種腫瘤細胞后第2天進行第一次免疫；第5天進行第二次免疫；第8天進行第三次免疫。從第一天免疫開始，每天觀察腫瘤生長情況，記錄腫瘤大小，按以下公式計算腫瘤體積：V＝ab2/2(V—體積,a—腫瘤長徑,b—腫瘤短徑)。腫瘤體積變化見圖4。從結(jié)果可以看出，APOE多肽-gp96復(fù)合物對皮下接種的誘導(dǎo)型乳腺癌模型有明顯的治療作用。APOE多肽-gp96復(fù)合物治療后皮下腫瘤的生長速度明顯減慢，腫瘤體積變小。實施例6APOE多肽-gp96復(fù)合物對肝癌的預(yù)防與治療作用一、多肽-gp96復(fù)合物對原發(fā)性肝癌的預(yù)防作用取20只6周齡雌性C57BL/6小鼠，平均分為兩組，每組10只，分別進行如下處理：第一組：腹部皮下注射實施例4制備的APOE多肽(H-2Kb)-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；第二組：腹部皮下注射實施例3制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；以上兩組中：實驗第1天進行第一次免疫；第8天進行第二次免疫；第22天進行第三次免疫。最后一次免疫結(jié)束后1周，將兩組小鼠每日飲水換為含30μg/mLDEN(Sigma-Aldrich公司，目錄號73861)的無菌蒸餾水，連續(xù)飼養(yǎng)40周，至第40周時處死小鼠，取出肝臟進行比較分析比較。比較結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出，APOE多肽-gp96復(fù)合物對DEN誘導(dǎo)的肝癌有明顯的預(yù)防作用。免疫APOE多肽-gp96復(fù)合物后肝癌的發(fā)病率明顯降低，發(fā)病時間推遲，腫瘤個數(shù)及腫瘤體積均減小。表4DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌統(tǒng)計結(jié)果二、APOE多肽-gp96復(fù)合物對誘導(dǎo)肝癌模型的治療作用將液氮凍存的小鼠肝癌H22細胞于37℃水浴鍋中快速解凍，細胞密度調(diào)至1×107/mL，腹腔接種2只BALB/c小鼠，每只0.2mL。待小鼠腹部脹大后，將小鼠頸椎脫臼處死，消毒腹部，抽取腹水合并，用PBS調(diào)整細胞密度至1×107/mL，皮下接種20只BALB/c小鼠，每只0.2mL。12天后將小鼠分成兩組，每組10只，分別進行如下處理：第一組：腹部皮下注射實施例4制備的APOE多肽(H-2Kd)-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；第二組：腹部皮下注射實施例3制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；以上兩組中：接種腫瘤細胞后第12天進行第一次免疫；第15天進行第二次免疫；第18天進行第三次免疫。從第一天免疫開始，每天觀察腫瘤生長情況，記錄腫瘤大小，按以下公式計算腫瘤體積：V＝ab2/2(V—體積,a—腫瘤長徑,b—腫瘤短徑)。腫瘤體積變化見圖5。從結(jié)果可以看出，APOE多肽-gp96復(fù)合物對皮下接種的誘導(dǎo)型肝癌模型有明顯的治療作用。APOE多肽-gp96復(fù)合物治療后皮下腫瘤的生長速度明顯減慢，腫瘤體積變小。實施例7APOE多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL對于人乳腺癌細胞殺傷效應(yīng)一、人源多肽特異性效應(yīng)細胞的制備1、使用人淋巴細胞分離液(Cellgro,25-072-CI)分離HLA-A2陽性志愿者的抗凝新鮮全血，獲得外周血單個核細胞(PBMC)，用含10％胎牛血清(Gibco，10099-141-FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Gibco，12633012)調(diào)整細胞濃度為1.0X106/ml，接種于24孔板，每孔1ml。2、次日每組分別加入APOE多肽(HLA-A2)-gp96復(fù)合物至終濃度為10μg/ml。3、第三天每孔加入IL-2(PeproTech公司，目錄號212-12)至終濃度為50U/ml，每2-3天半量換液并補充IL-2至終濃度為50U/ml。4、分別于第七天、第十四天進行第二輪、第三輪APOE多肽-gp96復(fù)合物刺激，次日加入IL-2至終濃度為50U/ml。5、第三輪刺激后3天，得到人源多肽效應(yīng)細胞CTL。二、靶細胞人乳腺癌細胞系MCF-7(HLA-A2表達陽性)，多肽孵育的T2細胞(HLA-A2表達陽性)、T2細胞。三、乳腺癌細胞特異性殺傷效應(yīng)的檢測使用非放射性細胞毒性檢測(Promega，目錄號G1780)進行細胞毒活性檢測，主要步驟如下(詳見試劑盒使用說明書)：1、以MCF-7細胞、多肽孵育的T2細胞、Τ2細胞作為靶細胞，接種靶細胞數(shù)目為5×103/孔，按照效靶比10:1的比例加入上述效應(yīng)細胞，效應(yīng)細胞以50μ1/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積100μ1；此外另設(shè)效應(yīng)細胞自發(fā)LDH釋放組，用來校準效應(yīng)細胞自發(fā)釋放出來的LDH(各組效應(yīng)細胞以50μ1/孔加入96孔板，補充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基至終體積100μ1)。靶細胞自發(fā)LDH釋放組，用來校正靶細胞自發(fā)釋放出來的LDH(各組靶細胞以50μ1/孔加入96孔板，補充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基至終濃度100μ1)。靶細胞最大LDH釋放組,用來計算時作為確定100％的LDH釋放的參照(細胞上樣同靶細胞自發(fā)釋放組)。體積校正對照組，用來校正由于加入裂解液引起的體積變化(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基100μ1)。培養(yǎng)基背景對照組，用來校正由培養(yǎng)基中血清產(chǎn)生的LDH活性以及酚紅造成的背景吸收(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基100μ1)。2、細胞接種后，使用250g離心4min，接著于37℃培養(yǎng)箱中孵育4h；在收獲上清前45min，向靶細胞最大LDH釋放組中加入裂解液(10×)，10μ1/孔；接著使用250g離心4min，收獲上清；3、轉(zhuǎn)移50μ1上清至酶標(biāo)板中，用檢測緩沖液配制底物，把配好的底物50μ1/孔加到酶標(biāo)板中，蓋好平板，室溫避光反應(yīng)30min，向每空加入50μ1終止液，1h內(nèi)于酶標(biāo)儀檢測490nm吸光值OD。4、計算細胞殺傷率殺傷率(％)＝[(實驗組OD值-效應(yīng)細胞自發(fā)釋放組OD值-靶細胞自發(fā)釋放組OD值)/(靶細胞最大釋放組OD值-靶細胞自發(fā)釋放組OD值)]×100％細胞殺傷結(jié)果見圖6。結(jié)果表明APOE多肽-gp96復(fù)合物可以從人的外周血淋巴細胞(PBMC)中誘導(dǎo)出表位特異性的細胞毒性T細胞(CTL)，該細胞可對人乳腺癌細胞MCF-7殺傷，表明APOE多肽-gp96復(fù)合物有預(yù)防和治療人乳腺癌的能力。實施例8APOE多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL對于人肝癌細胞殺傷效應(yīng)一、人源多肽特異性效應(yīng)細胞的制備APOE多肽(HLA-A2)-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL制備方法同實施例7，用含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整至適當(dāng)濃度，作為效應(yīng)細胞。二、靶細胞人肝癌細胞HHCC(HLA-A2表達陽性)，多肽孵育的T2細胞(HLA-A2表達陽性)、T2細胞三、肝癌細胞特異性殺傷效應(yīng)的檢測檢測方法同實施例7，將靶細胞換為人肝癌細胞HHCC，實驗組按效靶比10:1的比例加入效應(yīng)細胞與靶細胞，同時設(shè)立效應(yīng)細胞自發(fā)釋放組、靶細胞自發(fā)釋放組、靶細胞最大釋放組、背景對照組、體積校正對照組。37℃條件下孵育4h后加入細胞裂解液，收獲上清做LDH檢測。細胞殺傷結(jié)果見圖7。結(jié)果表明APOE多肽-gp96復(fù)合物可以從人的外周血淋巴細胞(PBMC)中誘導(dǎo)出表位特異性的細胞毒性T細胞(CTL)，該細胞可對人肝癌細胞HHCC殺傷，表明APOE多肽-gp96復(fù)合物有預(yù)防和治療人肝癌的能力。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。SEQUENCELISTING<110>北京熱休生物技術(shù)有限公司<120>APO-E蛋白及其多肽在治療與預(yù)防癌癥中的應(yīng)用<130>KHP171110223.8<160>11<170>PatentInversion3.5<210>1<211>951<212>DNA<213>APO-E蛋白<400>1atgaaggttctgtgggctgcgttgctggtcacattcctggcaggatgccaggccaaggtg60gagcaagcggtggagacagagccggagcccgagctgcgccagcagaccgagtggcagagc120ggccagcgctgggaactggcactgggtcgcttttgggattacctgcgctgggtgcagaca180ctgtctgagcaggtgcaggaggagctgctcagctcccaggtcacccaggaactgagggcg240ctgatggacgagaccatgaaggagttgaaggcctacaaatcggaactggaggaacaactg300accccggtggcggaggagacgcgggcacggctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggcc360cggctgggcgcggacatggaggacgtgtgcggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtg420caggccatgctcggccagagcaccgaggagctgcgggtgcgcctcgcctcccacctgcgc480aagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgcctggcagtgtac540caggccggggcccgcgagggcgccgagcgcggcctcagcgccatccgcgagcgcctgggg600cccctggtggaacagggccgcgtgcgggccgccactgtgggctccctggccggccagccg660ctacaggagcgggcccaggcctggggcgagcggctgcgcgcgcggatggaggagatgggc720agccggacccgcgaccgcctggacgaggtgaaggagcaggtggcggaggtgcgcgccaag780ctggaggagcaggcccagcagatacgcctgcaggccgaggccttccaggcccgcctcaag840agctggttcgagcccctggtggaagacatgcagcgccagtgggccgggctggtggagaag900gtgcaggctgccgtgggcaccagcgccgcccctgtgcccagcgacaatcac951<210>2<211>317<212>PRT<213>APO-E蛋白<400>2MetLysValLeuTrpAlaAlaLeuLeuValThrPheLeuAlaGlyCys151015GlnAlaLysValGluGlnAlaValGluThrGluProGluProGluLeu202530ArgGlnGlnThrGluTrpGlnSerGlyGlnArgTrpGluLeuAlaLeu354045GlyArgPheTrpAspTyrLeuArgTrpValGlnThrLeuSerGluGln505560ValGlnGluGluLeuLeuSerSerGlnValThrGlnGluLeuArgAla65707580LeuMetAspGluThrMetLysGluLeuLysAlaTyrLysSerGluLeu859095GluGluGlnLeuThrProValAlaGluGluThrArgAlaArgLeuSer100105110LysGluLeuGlnAlaAlaGlnAlaArgLeuGlyAlaAspMetGluAsp115120125ValCysGlyArgLeuValGlnTyrArgGlyGluValGlnAlaMetLeu130135140GlyGlnSerThrGluGluLeuArgValArgLeuAlaSerHisLeuArg145150155160LysLeuArgLysArgLeuLeuArgAspAlaAspAspLeuGlnLysArg165170175LeuAlaValTyrGlnAlaGlyAlaArgGluGlyAlaGluArgGlyLeu180185190SerAlaIleArgGluArgLeuGlyProLeuValGluGlnGlyArgVal195200205ArgAlaAlaThrValGlySerLeuAlaGlyGlnProLeuGlnGluArg210215220AlaGlnAlaTrpGlyGluArgLeuArgAlaArgMetGluGluMetGly225230235240SerArgThrArgAspArgLeuAspGluValLysGluGlnValAlaGlu245250255ValArgAlaLysLeuGluGluGlnAlaGlnGlnIleArgLeuGlnAla260265270GluAlaPheGlnAlaArgLeuLysSerTrpPheGluProLeuValGlu275280285AspMetGlnArgGlnTrpAlaGlyLeuValGluLysValGlnAlaAla290295300ValGlyThrSerAlaAlaProValProSerAspAsnHis305310315<210>3<211>2409<212>DNA<213>熱休克蛋白gp96<400>3atgagggccctgtgggtgctgggcctctgctgcgtcctgctgaccttcgggtcggtcaga60gctgacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaa120ggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagaggaagaagctattcagttggatgga180ttaaatgcatcacaaataagagaacttagagagaagtcggaaaagtttgccttccaagcc240gaagttaacagaatgatgaaacttatcatcaattcattgtataaaaataaagagattttc300ctgagagaactgatttcaaatgcttctgatgctttagataagataaggctaatatcactg360actgatgaaaatgctctttctggaaatgaggaactaacagtcaaaattaagtgtgataag420gagaagaacctgctgcatgtcacagacaccggtgtaggaatgaccagagaagagttggtt480aaaaaccttggtaccatagccaaatctgggacaagcgagtttttaaacaaaatgactgaa540gcacaggaagatggccagtcaacttctgaattgattggccagtttggtgtcggtttctat600tccgccttccttgtagcagataaggttattgtcacttcaaaacacaacaacgatacccag660cacatctgggagtctgactccaatgaattttctgtaattgctgacccaagaggaaacact720ctaggacggggaacgacaattaccct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yrLysAlaGlyAlaArgGluGlyAlaGluArgGlyVal1510<210>10<211>14<212>PRT<213>H-2Kb<400>10ThrMetLeuGlyGlnSerThrGluGluIleArgAlaArgLeu1510<210>11<211>9<212>PRT<213>HLA-A2<400>11PheLeuAlaGlyCysGlnAlaLysVal15當(dāng)前第1頁1 2 3