本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及熱休克蛋白gp96在治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

潰瘍性結(jié)腸炎俗稱牛皮癬，是一種慢性炎癥性皮膚病，病程較長(zhǎng)，有易復(fù)發(fā)傾向，有的病例幾乎終生不愈。該病發(fā)病以青壯年為主，對(duì)患者的身體健康和精神狀況影響較大。臨床表現(xiàn)以紅斑，鱗屑為主，全身均可發(fā)病，以頭皮，四肢伸側(cè)較為常見(jiàn)，多在冬季加重。本病目前尚無(wú)特效療法，但并非不治之癥。適當(dāng)?shù)膶?duì)癥治療可以控制癥狀。由于本病是一種慢性復(fù)發(fā)性疾病，不少患者需要長(zhǎng)期醫(yī)治，而各種療法都有一定的不良反應(yīng)。主要有聯(lián)合療法、交替療法、序貫和間歇療法等。

熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一類在生物進(jìn)化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。HSP根據(jù)同源程度和分子量大小可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多個(gè)亞家族。熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)gp96屬于HSP90亞家族的成員，該蛋白是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上含量最豐富的熱休克蛋白。目前未有報(bào)道熱休克蛋白gp96在治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供熱休克蛋白gp96在治療潰瘍性結(jié)腸炎中的新應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供了熱休克蛋白gp96在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用，gp96為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)；

a2)在a1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將a1)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

進(jìn)一步地，所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為1)或2)或3)：

1)細(xì)胞和組織中天然純化；

2)利用酵母菌表達(dá)重組蛋白；

3)利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組蛋白。

更進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品的功能為如下A1)、A2)和A3)中的至少一種：

A1)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生；

A2)緩解體重減輕；

A3)緩解結(jié)腸組織病變損傷。

其中，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

作為優(yōu)選，所述產(chǎn)品為注射劑。

本發(fā)明還提供了熱休克蛋白gp96的編碼基因在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述編碼基因?yàn)閐1)或d2)或d3)：

d1)核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述熱休克蛋白gp96的DNA分子；

d3)在嚴(yán)格條件下與d1)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述熱休克蛋白gp96的DNA分子。

所述嚴(yán)格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。

本發(fā)明還提供了含有熱休克蛋白GP96編碼基因的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、工程菌、昆蟲(chóng)或酵母。

進(jìn)一步地，上述生物材料在制備治療自身免疫性溶血性貧血藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的產(chǎn)品，其活性成分為熱休克蛋白gp96，gp96為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)；

a2)在a1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將a1)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述產(chǎn)品的功能為如下A1)、A2)和A3)中的至少一種：

A1)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生；

A2)緩解體重減輕；

A3)緩解結(jié)腸組織病變損傷。

所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為以下任一：

(1)從細(xì)胞或組織中提取純化得到；

(2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)，純化。包括利用酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá)，純化得到。

所述“將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中”可通過(guò)向受體中導(dǎo)入重組載體實(shí)現(xiàn)；所述重組載體可為將所述熱休克蛋白gp96的編碼基因插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96。所述重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96具體可為在質(zhì)粒pFastBac1的多克隆位點(diǎn)插入序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。

所述重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96具體可為將質(zhì)粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pFastBac1被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為SEQ ID NO.1所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。

所述受體可為Sf9細(xì)胞。

所述產(chǎn)品的注射劑量為小鼠免疫單次劑量為100-400μg/18-22g體重，人免疫劑量為100-1500μg/人次。

所述哺乳動(dòng)物可為鼠或人。所述鼠具體可為昆明種小鼠。

本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實(shí)施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了熱休克蛋白gp96具有誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生、緩解體重減輕、緩解結(jié)腸組織病變損傷的功能。因此，熱休克蛋白gp96對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為人胎盤(pán)組織制備的gp96提取物的SDS-PAGE和westernblot鑒定結(jié)果，圖中，1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：用人胎盤(pán)組織制備的gp96提取物的SDS-PAGE電泳圖；3：western blot鑒定圖。

圖2為利用漢遜酵母表達(dá)重組gp96蛋白的SDS-PAGE和westernblot鑒定結(jié)果。圖中，1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：步驟2的發(fā)酵液；3：親和層析后的洗脫液；4：離子交換層析后的洗脫液；5：western blot鑒定圖。

圖3為利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組gp96的SDS-PAGE和WesternBlot的鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

昆明種小鼠，雌性，體重22～25g，購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。獲取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的具體方法參考如下文獻(xiàn)：Zhen Liu，XinghuiLi，Lipeng Qiu，et al.Treg suppress CTL responses upon immunizationwith HSP gp96.Eur.J.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.

HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)為ATCC公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為HB-8065^TM。Sf9細(xì)胞為Invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為11496-015。Cellfectin II reagent為L(zhǎng)ife technologies公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為10362-100。質(zhì)粒pFastBac^TM1為Invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為10359-016。gp96單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為sc-56399。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為ZB-2307。HiTrap-QSepharose離子交換層析柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-5053-01。Superdex 200 10/300GL分子篩層析柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17517501。大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為CL108-01。FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4、Percp-Cy5.5-anti-CD25、固定/破膜劑和APC-anti-Foxp3均為eBioscience公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00和17-5773-80。Insect-XPRESS^TM Protein-freeInsect Cells medium with L-Glutamine為L(zhǎng)ONZA公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為12-730Q。

實(shí)施例1、熱休克蛋白gp96的獲得

(一)人胎盤(pán)組織中純化gp96蛋白

1、組織勻漿

勻漿緩沖液配方：在pH 7.0的碳酸氫鈉緩沖液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式為C₇H₇FO₂S)至終濃度1mM(置于冰上的燒杯中配制：PMSF在水溶液中數(shù)小時(shí)內(nèi)分解，該溶液不可過(guò)夜)。

取燒杯至于冰上，將人胎盤(pán)組織在燒杯中迅速用剪刀剪成直徑約1-2毫米的碎塊，然后加入組織8倍重量的勻漿緩沖液。將組織碎塊攪勻倒入玻璃勻漿器，勻漿至底部組織塊消失后再上下勻漿15次以上。勻漿液倒入離心管，50，000g離心60min，取上清加入1/10體積的10×PBS(pH7.5，200mM NaCl)，用于步驟2的ConA-Sepharose層析。

2、ConA-Sepharose親和層析

載體為ConA-Sepharose(購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品號(hào)為17-0440-01)，按“1ml載體/4g組織”計(jì)算使用量。層析柱的內(nèi)徑和柱長(zhǎng)是1.6×2.5cm。

將步驟1得到的上清用蠕動(dòng)泵上樣，0.25ml/min。在PBS(pH7.5，200mM NaCl)中加PMSF至終濃度1mM，作為洗脫液甲，用蠕動(dòng)泵將10倍柱體積的洗脫液甲過(guò)層析柱(0.5ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。在PBS(pH7.5，200mM NaCl)中加α-D-吡喃葡萄糖至終濃度10％(10mg/ml)，加PMSF至終濃度1mM，作為洗脫液乙，用蠕動(dòng)泵將3倍柱體積的洗脫液乙過(guò)柱層析(0.25ml/min)，收集洗脫液。

3、HiTrap-Q Sepharose離子交換層析

載體為HiTrap-Q Sepharose(層析柱為HiTrap Q HP，購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品號(hào)為17-1153-01)。層析柱的內(nèi)徑和柱長(zhǎng)是0.7×2.5cm。

將載體裝柱后，先用5ml PBS(pH7.5，200mM NaCl)清洗(1ml/min)。將步驟2得到的洗脫液上樣(1ml/min)，然后將5ml PBS(pH7.5，200mM NaCl)過(guò)層析柱(1ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。然后將10ml PBS(pH7.5，300mM NaCl)過(guò)層析柱(1ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。然后將3ml PBS(pH7.5，600mM NaCl)過(guò)層析柱(1ml/min)，收集洗脫液，即為gp96提取物。

將gp96提取物進(jìn)行10％SDS-PAGE，然后考馬斯亮藍(lán)染色。

將gp96提取物進(jìn)行western blot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購(gòu)自santa cruz，產(chǎn)品號(hào)為sc-56339)。

除了人胎盤(pán)外，也可用如下細(xì)胞或者組織制備gp96提取物：黑色素瘤(B16)細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞系HepG2培養(yǎng)細(xì)胞、臨床手術(shù)切除的人腫瘤組織(乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、腸癌、肝癌、胃癌)，提取方法參照人胎盤(pán)的提取。

結(jié)果見(jiàn)圖1。

(二)利用漢遜酵母表達(dá)重組gp96蛋白

1、重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的構(gòu)建

①提取人肝癌細(xì)胞HepG2的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

②以步驟①的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR引物如下：

Fp(5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3')

Rp(5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3')

③用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

④用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pHFMDZ-R1A(購(gòu)自Invitrogen公司，產(chǎn)品號(hào)為V20520)，回收載體骨架。

⑤將步驟③的酶切產(chǎn)物和步驟④的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架載體為pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了gp96蛋白的編碼序列。

⑥在重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96的BglII酶切位點(diǎn)插入LEU2片段，LEU2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。BamHI酶切位點(diǎn)插入α-淀粉酶報(bào)告系統(tǒng)如SEQ ID No.4所示，得到重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96。

2、gp96蛋白的表達(dá)

①采用電轉(zhuǎn)化法將步驟1得到的重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96導(dǎo)入漢遜酵母(購(gòu)自ATCC，產(chǎn)品號(hào)為MYA-335)細(xì)胞，得到重組菌。

②將重組菌接種于5mLSD液體培養(yǎng)基(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào)為GMS12117.7)，37℃培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)接到100mL SYN6培養(yǎng)基(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào)為GMS12116.1)，30℃培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。

③將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2L SYN6培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)。使用氨水控制pH維持在5.5，每4h檢測(cè)1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補(bǔ)加甘油，控制甘油終濃度在0.5％左右，同時(shí)控制溶氧在20％以上。根據(jù)菌體的生成情況檢測(cè)菌體濕重，等菌體濕重達(dá)到180-200g/L的時(shí)候停止補(bǔ)加甘油，開(kāi)始誘導(dǎo)重組gp96蛋白產(chǎn)生(補(bǔ)加甲醇，使甲醇濃度維持在0.5-0.8％左右)，誘導(dǎo)開(kāi)始72小時(shí)后停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。

3、gp96蛋白的分離純化

將步驟2得到的發(fā)酵液離心，收集菌體。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，在球磨機(jī)(DYNO-MILL model KDL)中，按照廠家提供的操作手冊(cè)使用玻璃珠球磨的方法破碎細(xì)胞，破碎后的細(xì)胞12000rpm/min離心20min，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濾液。將濾液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。

將濾液進(jìn)行親和層析，具體步驟如下：采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的Ni-NTA Purification System進(jìn)行親和層析，主要步驟為：先用PBS平衡柱子2h，然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h。將濃縮液用PBS(含20mM咪唑)稀釋后上樣，用PBS(含20mM咪唑)沖洗柱子至OD值<0.01，用PBS(含200mM咪唑)洗脫1.5h，收集洗脫液。所有操作均在4℃下進(jìn)行，流速為0.5mL/min。

每升步驟2得到的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液再進(jìn)行離子交換層析，主要步驟為：200mM NaCl的PBS液平衡柱子，上樣，300mM NaCl的PBS液洗雜質(zhì)，800mM NaCl的PBS液洗脫目的蛋白。

將步驟2的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液和離子交換層析后的洗脫液進(jìn)行10％SDS-PAGE，然后考馬斯亮藍(lán)染色。將gp96蛋白進(jìn)行western blot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購(gòu)自santa cruz，產(chǎn)品號(hào)為sc-56399)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2顯示，離子交換層析后的洗脫液中的gp96蛋白純度很高。

(三)利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組gp96蛋白

1、重組質(zhì)粒pFastBac^TM1-gp96的構(gòu)建

①采用Trizol法提取HepG2細(xì)胞的RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

②根據(jù)人gp96基因(GenBank號(hào)為AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ識(shí)別序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶XbaⅠ識(shí)別序列)。

③完成步驟①和②后，以步驟①獲得的cDNA為模板，以步驟②合成的F1和R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

④用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

⑤用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒pFastBac^TM1，回收約4700bp的載體骨架。

⑥將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。

⑦將步驟⑥獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌，然后提取該重組大腸桿菌的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pFastBac1被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為序列表中序列1所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pFastBac 1-gp96表達(dá)重組熱休克蛋白gp96，gp96的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2、gp96的表達(dá)

①將步驟1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞(每1×10⁶個(gè)Sf9細(xì)胞約轉(zhuǎn)染4μg重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96；共轉(zhuǎn)染過(guò)程中，轉(zhuǎn)染試劑為Cellfectin II reagent，培養(yǎng)基為Insect-XPRESS^TMProtein-free Insect Cells medium with L-Glutamine，27℃孵育72h，離心，上清液即為P1代病毒。

②將Sf9細(xì)胞懸浮液1(含1×10⁸個(gè)Sf9細(xì)胞)27℃培養(yǎng)8～10h，得到培養(yǎng)細(xì)胞；然后向所述培養(yǎng)細(xì)胞中加入P1代病毒(劑量為0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm離心5min，上清液即為P2代病毒。

③向Sf9細(xì)胞懸浮液2(含1.6×10⁸個(gè)Sf9細(xì)胞)中加入P2代病毒(劑量為0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，4000rpm離心5min，上清液即為P3代病毒。

以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗，對(duì)P3代病毒進(jìn)行western雜交，western雜交具體步驟參考如下文獻(xiàn)：張悅鳴，段躍強(qiáng)，羅德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受體在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達(dá)及其鑒定[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013，26：5。

western雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，gp96在Sf9細(xì)胞中表達(dá)。

3、gp96的純化

①向300ml的Sf9細(xì)胞懸浮液3(含4.5×10⁸個(gè)Sf9細(xì)胞)中加入P3代病毒(劑量為5MOI)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，得到懸浮液。

②取所述懸浮液，7000rpm離心20min，獲得上清液1。

③取所述上清液1，經(jīng)0.22mm濾膜過(guò)濾，獲得上樣液。

④將所述上樣液上樣于HiTrap-Q Sepharose離子交換層析柱(流速為1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)，收集過(guò)柱后溶液并采用截留分子量為50KD的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到1mL左右的濃縮液。所述濃縮液即含有g(shù)p96。

⑤將步驟④得到的濃縮液上樣于Superdex 200 10/300GL分子篩層析柱(流速為0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS緩沖液洗滌(流速為0.25mL/min)，收集為9～12mL處的穿透液，進(jìn)一步采用截留分子量為50KD的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到gp96的溶液。采用BCA法測(cè)定gp96的溶液中的蛋白濃度，最后分裝，貯存于-80℃。

將步驟⑤得到的gp96的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3中左圖(泳道1為高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，泳道2為gp96，箭頭為gp96)。將步驟⑤得到的重組熱休克蛋白gp96的溶液進(jìn)行Western blot(以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3中右圖。結(jié)果表明，gp96的溶液顯示單一分子量條帶，對(duì)應(yīng)的分子量與預(yù)期一致。

實(shí)施例2、gp96在活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中劑量的確定

一、小鼠分組免疫

將100只體重為18～22g的小鼠隨機(jī)分成胎盤(pán)gp96處理組1、胎盤(pán)gp96處理組2、胎盤(pán)gp96處理組3、酵母gp96處理組1、gp96處理組2、酵母gp96處理組3、昆蟲(chóng)gp96處理組1、昆蟲(chóng)gp96處理組2、昆蟲(chóng)gp96處理組3和對(duì)照組(每組10只)，分別進(jìn)行如下處理：

胎盤(pán)gp96處理組1：實(shí)驗(yàn)第1天，腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤(pán)組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤(pán)組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤(pán)組織提取的gp96的溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

胎盤(pán)gp96處理組2：按照胎盤(pán)gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μg gp96/只替換為200μg gp96/只。

胎盤(pán)gp96處理組3：按照胎盤(pán)gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μg gp96/只替換為400μg gp96/只。

酵母gp96處理組1：實(shí)驗(yàn)第1天，腹腔注射實(shí)施例1利用漢遜酵母表達(dá)制備的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤(pán)組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用人胎盤(pán)組織提取的gp96的溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

酵母gp96處理組2：按照酵母gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μg gp96/只替換為200μg gp96/只。

酵母gp96處理組3：按照酵母gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μg gp96/只替換為400μg gp96/只。

昆蟲(chóng)gp96處理組1：實(shí)驗(yàn)第1天，腹腔注射實(shí)施例1利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)制備的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)制備的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射實(shí)施例1利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)制備的gp96的溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

昆蟲(chóng)gp96處理組2：按照昆蟲(chóng)gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μg gp96/只替換為200μg gp96/只。

昆蟲(chóng)gp96處理組3：按照昆蟲(chóng)gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μg gp96/只替換為400μg gp96/只。

gp96對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液。每次注射劑量均為100μL/只。

二、小鼠淋巴細(xì)胞分離

取完成步驟一后第8天的小鼠，獲取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(每只小鼠取3×10⁶個(gè)脾臟淋巴細(xì)胞)。

三、gp96在活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中劑量的確定

1、取步驟二獲取的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(少于1×10⁶個(gè))，1000rpm離心10min，收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。

2、完成步驟1后，取所述小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，加入100μL含5％(質(zhì)量體積比)BSA的pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液重懸，4℃封閉20min；然后1000rpm離心10min，用100μL上清液重懸沉淀，得到混合液甲。

3、完成步驟2后，取所述混合液甲，加入FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4和Percp-Cy5.5-anti-CD25，4℃避光孵育20min。

4、完成步驟3后，取所述混合液甲，加入1mL pH7.4、0.01mol/LPBS緩沖液，震蕩混勻，1000rpm離心10min，收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，然后用400μL pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液重懸，得到混合液乙。

5、完成步驟4后，取所述混合液乙，加入600μL固定/破膜劑，4℃破膜30min(實(shí)際操作過(guò)程中不超過(guò)1h即可)；然后1000rpm離心10min，收集沉淀，得到沉淀1。

6、完成步驟5后，取所述沉淀1，加入1mL 1×洗滌液重懸，1000rpm離心10min，得到沉淀2和上清液丙。取100μL上清液丙重懸沉淀2，得到混合液丙；向混合液丙中加入APC-anti-Foxp3，4℃避光孵育30min。

7、完成步驟6后，取所述混合液丙，加入1mL 1×洗滌液重懸，1000rpm離心10min，收集沉淀，得到沉淀3。取400μL含4％(質(zhì)量體積比)多聚甲醛的pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液重懸沉淀3，然后用流式細(xì)胞儀分析大鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明，胎盤(pán)、酵母和昆蟲(chóng)共9組gp96處理組中小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率顯著均高于對(duì)照組。因此，人胎盤(pán)組織、漢遜酵母重組表達(dá)和昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)的gp96蛋白均可以顯著誘導(dǎo)CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。而200μg gp96和400μg人胎盤(pán)組織、漢遜酵母重組表達(dá)和昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)的gp96蛋白均可以顯著誘導(dǎo)更高CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。

表1 gp96免疫對(duì)大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響(平均值±sd值)

注：與對(duì)照組相比，^*P<0.01.

實(shí)施例3、gp96在治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用

1、大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立

采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司)誘導(dǎo)的方法制備大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，具體方法如下：大鼠禁食24h后，異戊巴比妥麻醉。將鈍頭導(dǎo)管從肛門(mén)插至距肛門(mén)8cm處，按80mg/kg TNBS(20mg TNBS溶解于50％乙醇1mL，4mL/kg大鼠體質(zhì)量)緩慢灌腸，誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎。15d后再次給予30mg/kg TNBS溶液(20mg TNBS溶解于50％乙醇1mL，1.5mL/kg大鼠體質(zhì)量)灌腸，造成復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎。TNBS誘導(dǎo)時(shí)大鼠快速發(fā)展成嚴(yán)重結(jié)腸炎，其典型癥狀包括腹瀉、血便、體重明顯下降、活動(dòng)減少。TNBS結(jié)腸炎模型的病理學(xué)改變?yōu)榻Y(jié)腸炎黏膜灶性潰瘍形成，杯狀細(xì)胞及隱窩細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

將造模成功的大鼠按體重隨機(jī)分為4組(每組10只)，分別進(jìn)行如下處理：

gp96處理組1：實(shí)驗(yàn)第1天，腹腔注射實(shí)施例1制備胎盤(pán)組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射實(shí)施例1制備胎盤(pán)組織提取的gp96的溶液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射實(shí)施例1制備的胎盤(pán)組織提取gp96的溶液。每次注射劑量均為200μg gp96/只。

gp96處理組2：按照gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射用gp96蛋白改為酵母菌重組表達(dá)gp96蛋白。

gp96處理組3：按照gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射用gp96蛋白改為昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)gp96蛋白。

對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)第8天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液；實(shí)驗(yàn)第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液。每次注射劑量均為100μL/只。

造模前、造模后和處理后分別記錄大鼠體重。

末次注射后大鼠禁食24h。處死大鼠，取出距肛門(mén)8cm處結(jié)腸組織，沿腸系膜緣剪開(kāi)腸腔，用生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，置于中性甲醛溶液內(nèi)固定，石蠟包埋進(jìn)行常規(guī)病理切片、HE染色。高倍顯微鏡下選取視野，根據(jù)潰瘍大小、炎癥浸潤(rùn)和結(jié)構(gòu)損傷程度等進(jìn)行結(jié)腸組織病變損傷程度比較。

gp96免疫對(duì)大鼠體重影響的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)gp96免疫大鼠的體重顯著升高，3組gp96處理組無(wú)顯著差異。

表2 gp96免疫對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重的影響(平均值±sd值)

注：與對(duì)照組相比，^*P<0.01.

gp96免疫對(duì)大鼠結(jié)腸組織損傷影響的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，與對(duì)照組大鼠相比，經(jīng)gp96免疫大鼠的結(jié)腸損傷程度顯著降低，3組gp96處理組無(wú)顯著差異。

表3鏡檢潰瘍性結(jié)腸炎大鼠大腸組織損傷情況(400倍放大)

“-”:正常腸粘膜及腺體結(jié)構(gòu)；“±”:腸粘膜無(wú)炎癥灶；“+”:腸粘膜下局部炎癥反應(yīng)；“++”:腸粘膜下大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；“+++”:腸粘膜下大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，正常組織消失

上述結(jié)果表明，用gp96免疫小鼠，能夠有效的治療或減輕潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 北京熱休生物技術(shù)有限公司

<120> 熱休克蛋白gp96在治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用

<130> KHP171110215.9

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2352

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atggacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 60

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 120

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 180

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 240

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 300

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 360

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 420

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 480

gcacaggaag atggccagtc gtcttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 540

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 600

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 660

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 720

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 780

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 840

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 900

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 960

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1020

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1080

gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1140

tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcccagac 1200

gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1260

gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1320

aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1380

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1440

tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1500

attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1560

atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1620

aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1680

cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1740

agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1800

tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1860

acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1920

atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 1980

cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2040

attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2100

gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2160

agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2220

gaagaacctg aggagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2280

gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2340

gatgaattct aa 2352

<210> 2

<211> 783

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu Glu Asp Leu Gly

1 5 10 15

Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val Val Gln Arg Glu

20 25 30

Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Arg Glu

35 40 45

Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn Arg

50 55 60

Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Phe

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg

85 90 95

Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Glu Glu Leu

100 105 110

Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu Leu His Val Thr

115 120 125

Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val Lys Asn Leu Gly

130 135 140

Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys Met Thr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Ser Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly

165 170 175

Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys Val Ile Val Thr

180 185 190

Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn

195 200 205

Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly

210 215 220

Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser Asp Tyr Leu Glu

225 230 235 240

Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn

245 250 255

Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro

260 265 270

Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Asp

275 280 285

Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys

290 295 300

Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys

305 310 315 320

Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu Tyr Lys

325 330 335

Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp Pro Met Ala Tyr

340 345 350

Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys Ser Ile Leu Phe

355 360 365

Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu Tyr Gly Ser Lys

370 375 380

Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Pro Asp

385 390 395 400

Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe Val Lys Gly Val

405 410 415

Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln

420 425 430

Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu Val Arg Lys Thr

435 440 445

Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr Asn Asp Thr Phe

450 455 460

Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val Ile Glu Asp His

465 470 475 480

Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe Gln Ser Ser His

485 490 495

His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val Glu Arg Met Lys

500 505 510

Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser Ser Arg Lys Glu

515 520 525

Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gly Tyr Glu

530 535 540

Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys Ile Gln Ala Leu

545 550 555 560

Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala Lys Glu Gly Val

565 570 575

Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg Glu Ala Val Glu

580 585 590

Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp Lys Ala Leu Lys

595 600 605

Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu Thr Glu Ser Pro

610 615 620

Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly Asn Met Glu Arg

625 630 635 640

Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp Ile Ser Thr Asn

645 650 655

Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn Pro Arg His Pro

660 665 670

Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp Glu Asp Asp Lys

675 680 685

Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr Ala Thr Leu Arg

690 695 700

Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly Asp Arg Ile Glu

705 710 715 720

Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp Ala Lys Val Glu

725 730 735

Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu Asp Thr Thr Glu

740 745 750

Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val Gly Thr Asp Glu

755 760 765

Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys Asp Glu Phe

770 775 780

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattca tggacgatga agttgatg 28

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagc tattagaatt catctttttc agctgtag 38