本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，涉及熱休克蛋白gp96在制備治療特發(fā)性血小板減少性紫癜藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自身免疫性血小板減少性紫癜，是一種自身免疫性出血性疾病，以血小板減少、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)正?；蛟黾影槌墒焓茏瑁约叭狈θ魏卧虬ㄍ庠吹幕蚶^發(fā)性因素為特征，又稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura，itp)。血小板減少性紫癜雖發(fā)病率較低，但死亡率卻較高。血小板減少性紫癜的檢驗指標(biāo)除作血常規(guī)外尚需查血小板計數(shù)(急性型一般低于20×10⁹/l，慢性型多在(30～80)×10⁹/l之間)，并注意觀察血小板形態(tài)，促凝血時間，血塊收縮時間，凝血酶原時間，血小板表面相關(guān)免疫球蛋白(paig)測定，抗人球蛋白試驗，補(bǔ)體測定，毛細(xì)血管脆性試驗，骨髓象檢查。

血小板減少性紫癜藥物治療首選糖皮質(zhì)激素。此外，經(jīng)多種藥物治療4-6個月，不能控制癥狀或仍有反復(fù)發(fā)作者，可考慮脾摘除。凡摘脾后又發(fā)作者，仍可考慮用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。

熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)是一類在生物進(jìn)化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。hsp根據(jù)同源程度和分子量大小可分為hsp110、hsp90、hsp70、hsp60、hsp40、小分子hsp和泛素等多個亞家族。熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)gp96屬于hsp90亞家族的成員，該蛋白是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上含量最豐富的熱休克蛋白。研究表明gp96在免疫調(diào)節(jié)中具有重要的作用。低劑量的外源gp96注射小鼠能顯著激活小鼠的免疫系統(tǒng)，高劑量的外源gp96注射小鼠后顯著抑制小鼠的免疫系統(tǒng)。gp96調(diào)節(jié)免疫功能可能與調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)相關(guān)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供gp96蛋白(即熱休克蛋白gp96)在制備治療特發(fā)性血小板減少性紫癜藥物中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的gp96蛋白在制備治療特發(fā)性血小板減少性紫癜藥物中的應(yīng)用，其中，所述gp96蛋白為：

i)seqidno:2所示的氨基酸序列；或

ii)seqidno:2去掉第一個蛋氨酸后的氨基酸序列；或

iii)在i)或ii)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白；或

iv)seqidno:2所示的氨基酸序列，或seqidno:2去掉第一個蛋氨酸后的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子，可為d1)或d2)或d3)或d4)：

d1)seqidno:1自5’端起第4位至2352位所示的dna分子；

d2)seqidno:1所示的dna分子；

d3)與d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述熱休克蛋白gp96的dna分子；

d4)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述熱休克蛋白gp96的dna分子。

所述嚴(yán)格條件為在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。

所述藥物的功能為如下a1)至a3)中的至少一種：

a1)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生；

a2)提高血小板的數(shù)量；

a3)降低脾臟系數(shù)。

本發(fā)明還提供gp96蛋白在制備誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞產(chǎn)生的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述調(diào)節(jié)性t細(xì)胞包括cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞等。

本發(fā)明還提供gp96蛋白在制備升血小板藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供用于治療特發(fā)性血小板減少性紫癜的藥物，其有效成分為gp96蛋白。

本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞產(chǎn)生的藥物，其有效成分為gp96蛋白。

本發(fā)明還提供一種升血小板藥物，其有效成分為gp96蛋白。

本發(fā)明所述藥物的單次劑量單元為小鼠免疫單次劑量為100-400μg/18-22g體重，人免疫劑量為100-1500μg/人次。

施用對象為人和哺乳動物。優(yōu)選所述哺乳動物為小鼠。更優(yōu)選balb/c小鼠。

本發(fā)明所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為：

1)細(xì)胞和組織中天然純化；或

2)利用酵母菌表達(dá)重組蛋白；或

3)利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組蛋白。

本發(fā)明首次將熱休克蛋白gp96用于治療特發(fā)性血小板減少性紫癜藥物的制備中，實驗證明，熱休克蛋白gp96具有誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生、降低脾臟系數(shù)、提高血小板的數(shù)量的功能。因此，熱休克蛋白gp96對治療自身免疫性血小板減少性紫癜和/或緩解自身免疫性血小板減少性紫癜的癥狀具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中人胎盤組織制備的gp96提取物的sds-page和westernblot鑒定結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實施例1中利用漢遜酵母表達(dá)重組gp96蛋白的sds-page和westernblot鑒定結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實施例1中利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組gp96蛋白的sds-page和westernblot的鑒定結(jié)果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

balb/c小鼠購自南京模式動物研究所；balb/c小鼠在實施例中簡稱小鼠。

豚鼠，雌性，體重350g，共10只，購自南京模式動物研究所。弗氏完全佐劑(dh-1341-1)和弗氏不完全佐劑(dh-1341-2)購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。草酸氨購自廣東光華科技股份有限公司。

獲取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的具體方法參考文獻(xiàn)：zhenliu，xinghuili，lipengqiu，etal.tregsuppressctlresponsesuponimmunizationwithhspgp96.eur.j.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.

hepg2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)購自atcc(美國菌種保藏中心)，產(chǎn)品目錄號為hb-8065^tm。sf9細(xì)胞為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為11496-015。cellfectiniireagent為lifetechnologies公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為10362-100。質(zhì)粒pfastbac^tm1為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為10359-016。gp96單克隆抗體為santacruz公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為sc-56399。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為zb-2307。hitrap-qsepharose離子交換層析柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17-5053-01。superdex20010/300gl分子篩層析柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17517501。大腸桿菌dh10bac感受態(tài)細(xì)胞為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為cl108-01。fitc-anti-cd3、pe-anti-cd4、percp-cy5.5-anti-cd25、固定/破膜劑和apc-anti-foxp3均為ebioscience公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號分別為11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00和17-5773-80。insect-xpress^tmprotein-freeinsectcellsmediumwithl-glutamine為lonza公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為12-730q。

實施例1熱休克蛋白gp96的獲得

(一)胎盤組織中純化gp96蛋白

1、組織勻漿

勻漿緩沖液配方：在ph7.0的碳酸氫鈉緩沖液中加pmsf(苯甲基磺酰氟，分子式為c7h7fo2s)至終濃度1mm(置于冰上的燒杯中配制：pmsf在水溶液中數(shù)小時內(nèi)分解，該溶液不可過夜)。

取燒杯至于冰上，將胎盤組織在燒杯中迅速用剪刀剪成直徑約1-2毫米的碎塊，然后加入組織8倍重量的勻漿緩沖液。將組織碎塊攪勻倒入玻璃勻漿器，勻漿至底部組織塊消失后再上下勻漿15次以上。勻漿液倒入離心管，50,000g離心60min，取上清加入1/10體積的10×pbs(ph7.5，200mmnacl)，用于步驟2的cona-sepharose層析。

2、cona-sepharose親和層析

載體為cona-sepharose(購自ge公司，產(chǎn)品號為17-0440-01)，按“1ml載體/4g組織”計算使用量。層析柱的內(nèi)徑和柱長是1.6×2.5cm。

將步驟1得到的上清用蠕動泵上樣，0.25ml/min。在pbs(ph7.5，200mmnacl)中加pmsf至終濃度1mm，作為洗脫液甲，用蠕動泵將10倍柱體積的洗脫液甲過層析柱(0.5ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。在pbs(ph7.5，200mmnacl)中加α-d-吡喃葡萄糖至終濃度10％(10mg/ml)，加pmsf至終濃度1mm，作為洗脫液乙，用蠕動泵將3倍柱體積的洗脫液乙過柱層析(0.25ml/min)，收集洗脫液。

3、hitrap-qsepharose離子交換層析

載體為hitrap-qsepharose(層析柱為hitrapqhp，購自ge公司，產(chǎn)品號為17-1153-01)。層析柱的內(nèi)徑和柱長是0.7×2.5cm。

將載體裝柱后，先用5mlpbs(ph7.5，200mmnacl)清洗(1ml/min)。將步驟2得到的洗脫液上樣(1ml/min)，然后將5mlpbs(ph7.5，200mmnacl)過層析柱(1ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。然后將10mlpbs(ph7.5，300mmnacl)過層析柱(1ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。然后將3mlpbs(ph7.5，600mmnacl)過層析柱(1ml/min)，收集洗脫液，即為gp96提取物。

將gp96提取物進(jìn)行10％sds-page，然后考馬斯亮藍(lán)染色。

將gp96提取物進(jìn)行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購自santacruz，產(chǎn)品號為sc-56339)。

除了胎盤外，也可用如下細(xì)胞或者組織制備gp96提取物：黑色素瘤(b16)細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞系hepg2培養(yǎng)細(xì)胞、臨床手術(shù)切除的人腫瘤組織(乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、腸癌、肝癌、胃癌)，提取方法參照胎盤的提取。

gp96提取物的sds-page和westernblot鑒定結(jié)果見圖1。其中，1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：用胎盤組織制備的gp96提取物的sds-page電泳圖；3：westernblot鑒定圖。

(二)利用漢遜酵母表達(dá)重組gp96蛋白

1、重組質(zhì)粒phfmdz-r1l2gamy-gp96的構(gòu)建

①提取人肝癌細(xì)胞hepg2的mrna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna。

②以步驟①的cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

pcr引物如下：

fp：5'-ccggaattcatggacgatgaagttgatg-3'

rp：5'-ccgctcgagctattagaattcatctttttcagctgtag-3'

③用限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi雙酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

④用限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi雙酶切質(zhì)粒phfmdz-r1a(購自invitrogen公司，產(chǎn)品號為v20520)，回收載體骨架。

⑤將步驟③的酶切產(chǎn)物和步驟④的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96并測序。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96的骨架載體為phfmdz-r1a，在ecori和xhoi酶切位點之間插入了gp96蛋白的編碼序列。

⑥在重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96的bglii酶切位點插入leu2片段，leu2的核苷酸序列如seqidno.3所示。bamhi酶切位點插入α-淀粉酶報告系統(tǒng)如seqidno.4所示，得到重組質(zhì)粒phfmdz-r1l2gamy-gp96。

2、gp96蛋白的表達(dá)

①采用電轉(zhuǎn)化法將步驟1得到的重組質(zhì)粒phfmdz-r1l2gamy-gp96導(dǎo)入漢遜酵母(購自atcc，產(chǎn)品號為mya-335)細(xì)胞，得到重組菌。

②將重組菌接種于5mlsd液體培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號為gms12117.7)，37℃培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)接到100mlsyn6培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號為gms12116.1)，30℃培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。

③將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2lsyn6培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)。使用氨水控制ph維持在5.5，每4h檢測1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補(bǔ)加甘油，控制甘油終濃度在0.5％左右，同時控制溶氧在20％以上。根據(jù)菌體的生成情況檢測菌體濕重，等菌體濕重達(dá)到180-200g/l的時候停止補(bǔ)加甘油，開始誘導(dǎo)重組gp96蛋白產(chǎn)生(補(bǔ)加甲醇，使甲醇濃度維持在0.5-0.8％左右)，誘導(dǎo)開始72小時后停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。

3、gp96蛋白的分離純化

將步驟2得到的發(fā)酵液離心，收集菌體。用pbs緩沖液洗滌細(xì)胞2次，在球磨機(jī)(dyno-millmodelkdl)中，按照廠家提供的操作手冊使用玻璃珠球磨的方法破碎細(xì)胞，破碎后的細(xì)胞12000rpm/min離心20min，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜進(jìn)行過濾，得到濾液。將濾液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。

將濾液進(jìn)行親和層析，具體步驟如下：采用英俊公司(invitrogencorporation)的ni-ntapurificationsystem進(jìn)行親和層析，主要步驟為：先用pbs平衡柱子2h，然后用pbs(含20mm咪唑)平衡柱子2h。將濃縮液用pbs(含20mm咪唑)稀釋后上樣，用pbs(含20mm咪唑)沖洗柱子至od值<0.01，用pbs(含200mm咪唑)洗脫1.5h，收集洗脫液。所有操作均在4℃下進(jìn)行，流速為0.5ml/min。

每升步驟2得到的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液再進(jìn)行離子交換層析，主要步驟為：200mmnacl的pbs液平衡柱子，上樣，300mmnacl的pbs液洗雜質(zhì)，800mmnacl的pbs液洗脫目的蛋白。

將步驟2的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液和離子交換層析后的洗脫液進(jìn)行10％sds-page，然后考馬斯亮藍(lán)染色。將gp96蛋白進(jìn)行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購自santacruz，產(chǎn)品號為sc-56399)，結(jié)果見圖2。其中，1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：步驟2的發(fā)酵液；3：親和層析后的洗脫液；4：離子交換層析后的洗脫液；5：westernblot鑒定圖。

圖2結(jié)果顯示，離子交換層析后的洗脫液中的gp96蛋白純度很高。

(三)利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組gp96蛋白

1、重組質(zhì)粒pfastbac^tm1-gp96的構(gòu)建

①采用trizol法提取hepg2細(xì)胞的rna，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。

②根據(jù)人gp96基因(genbank號為ay040226.1)的序列，人工合成引物f1：5’-ggaattcatggacgatgaagttgat-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶ecorⅰ識別序列)和r1：5’-gctctagactattagaattcatctttttc-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶xbaⅰ識別序列)。

③完成步驟1和2后，以步驟1獲得的cdna為模板，以步驟2合成的f1和r1為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

④用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ雙酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

⑤用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ酶切質(zhì)粒pfastbac^tm1，回收約4700bp的載體骨架。

⑥將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。

⑦將步驟⑥獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh10bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌，然后提取該重組大腸桿菌的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96。

根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pfastbac1的ecorⅰ和xbaⅰ識別序列間的片段(質(zhì)粒pfastbac1被限制性核酸內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ切成一個大片段和一個小片段，該dna為該小片段)替換為seqidno:1所示的雙鏈dna分子。重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96表達(dá)重組熱休克蛋白gp96，gp96的氨基酸序列如seqidno:2所示。

2、gp96的表達(dá)

①將步驟1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞(每1×10⁶個sf9細(xì)胞約轉(zhuǎn)染4μg重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96；共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為cellfectiniireagent，培養(yǎng)基為insect-xpress^tmprotein-freeinsectcellsmediumwithl-glutamine，27℃孵育72h，離心，上清液即為p1代病毒。

②將sf9細(xì)胞懸浮液1(含1×10⁸個sf9細(xì)胞)27℃培養(yǎng)8～10h，得到培養(yǎng)細(xì)胞；然后向所述培養(yǎng)細(xì)胞中加入p1代病毒(劑量為0.05～0.1moi)，27℃孵育72h，4000rpm離心5min，上清液即為p2代病毒。

③向sf9細(xì)胞懸浮液2(含1.6×10⁸個sf9細(xì)胞)中加入p2代病毒(劑量為0.05～0.1moi)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，4000rpm離心5min，上清液即為p3代病毒。

以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗，對p3代病毒進(jìn)行western雜交，western雜交具體步驟參考如下文獻(xiàn)：張悅鳴，段躍強(qiáng)，羅德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性il-5α受體在bac-to-bac系統(tǒng)中的表達(dá)及其鑒定[j].中國生物制品學(xué)雜志，2013，26：5.

westernblot實驗結(jié)果表明，gp96在sf9細(xì)胞中表達(dá)。

3、gp96的純化

①向300ml的sf9細(xì)胞懸浮液3(含4.5×10⁸個sf9細(xì)胞)中加入p3代病毒(劑量為5moi)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，得到懸浮液。

②取所述懸浮液，7000rpm離心20min，獲得上清液1。

③取所述上清液1，經(jīng)0.22mm濾膜過濾，獲得上樣液。

④將所述上樣液上樣于hitrap-qsepharose離子交換層析柱(流速為1ml/min)，然后先用5ml的ph7.5、200mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)；再用10ml的ph7.5、300mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)；最后用3ml的ph7.5、600mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)，收集過柱后溶液并采用截留分子量為50kd的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到1ml左右的濃縮液。所述濃縮液即含有g(shù)p96。

⑤將步驟④得到的濃縮液上樣于superdex20010/300gl分子篩層析柱(流速為0.25ml/min)，然后用ph7.5、150mm的pbs緩沖液洗滌(流速為0.25ml/min)，收集為9～12ml處的穿透液，進(jìn)一步采用截留分子量為50kd的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到gp96溶液。采用bca法測定gp96溶液中的蛋白濃度，最后分裝，貯存于-80℃。

將步驟⑤得到的gp96溶液進(jìn)行sds-page電泳分析，實驗結(jié)果見圖3，泳道1為高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，泳道2為gp96。將步驟⑤得到的重組熱休克蛋白gp96溶液進(jìn)行westernblot(以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗)，實驗結(jié)果見圖3中泳道3。結(jié)果表明，gp96溶液顯示單一分子量條帶，對應(yīng)的分子量與預(yù)期一致。

實施例2熱休克蛋白gp96在活化調(diào)節(jié)性t細(xì)胞中的確定

一、小鼠分組免疫

將100只體重為18～22g的小鼠隨機(jī)分成胎盤gp96處理組1、胎盤gp96處理組2、胎盤gp96處理組3、酵母gp96處理組1、gp96處理組2、酵母gp96處理組3、昆蟲gp96處理組1、昆蟲gp96處理組2、昆蟲gp96處理組3和對照組(每組10只)，分別進(jìn)行如下處理：

胎盤gp96處理組1：實驗第1天，腹腔注射實施例1利用人胎盤組織提取的gp96溶液；實驗第8天，再次腹腔注射實施例1利用人胎盤組織提取的gp96溶液；實驗第22天，再次腹腔注射實施例1利用人胎盤組織提取的gp96溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

胎盤gp96處理組2：按照胎盤gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為200μggp96/只。

胎盤gp96處理組3：按照胎盤gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為400μggp96/只。

酵母gp96處理組1：實驗第1天，腹腔注射實施例1利用漢遜酵母表達(dá)制備的gp96溶液；實驗第8天，再次腹腔注射實施例1利用人胎盤組織提取的gp96溶液；實驗第22天，再次腹腔注射實施例1利用人胎盤組織提取的gp96溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

酵母gp96處理組2：按照酵母gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為200μggp96/只。

酵母gp96處理組3：按照酵母gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為400μggp96/只。

昆蟲gp96處理組1：實驗第1天，腹腔注射實施例1利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)制備的gp96溶液；實驗第8天，再次腹腔注射實施例1利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)制備的gp96溶液；實驗第22天，再次腹腔注射實施例1利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)制備的gp96溶液。每次注射劑量均為100μggp96/只。

昆蟲gp96處理組2：按照昆蟲gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為200μggp96/只。

昆蟲gp96處理組3：按照昆蟲gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射劑量100μggp96/只替換為400μggp96/只。

對照組：實驗第1天腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液，實驗第8天，再次腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液；實驗第22天，再次腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液。每次注射劑量均為100μl/只。

二、小鼠淋巴細(xì)胞分離

取完成步驟一后第8天的小鼠，獲取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(每只小鼠取3×10⁶個脾臟淋巴細(xì)胞)。

三、gp96在活化調(diào)節(jié)性t細(xì)胞中劑量的確定

1、取步驟二獲取的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(少于1×10⁶個)，1000rpm離心10min，收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。

2、完成步驟1后，取所述小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，加入100μl含5％(質(zhì)量體積比)bsa的ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液重懸，4℃封閉20min；然后1000rpm離心10min，用100μl上清液重懸沉淀，得到混合液甲。

3、完成步驟2后，取所述混合液甲，加入fitc-anti-cd3、pe-anti-cd4和percp-cy5.5-anti-cd25，4℃避光孵育20min。

4、完成步驟3后，取所述混合液甲，加入1mlph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液，震蕩混勻，1000rpm離心10min，收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，然后用400μlph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液重懸，得到混合液乙。

5、完成步驟4后，取所述混合液乙，加入600μl固定/破膜劑，4℃破膜30min(實際操作過程中不超過1h即可)；然后1000rpm離心10min，收集沉淀，得到沉淀1。

6、完成步驟5后，取所述沉淀1，加入1ml1×洗滌液重懸，1000rpm離心10min，得到沉淀2和上清液丙。取100μl上清液丙重懸沉淀2，得到混合液丙；向混合液丙中加入apc-anti-foxp3，4℃避光孵育30min。

7、完成步驟6后，取所述混合液丙，加入1ml1×洗滌液重懸，1000rpm離心10min，收集沉淀，得到沉淀3。取400μl含4％(質(zhì)量體積比)多聚甲醛的ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液重懸沉淀3，然后用流式細(xì)胞儀分析小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的頻率。

實驗結(jié)果見表1，結(jié)果表明，胎盤、酵母和昆蟲共9組gp96處理組中小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞中cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的頻率顯著均高于對照組。因此，人胎盤組織、漢遜酵母重組表達(dá)和昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的gp96蛋白均可以顯著誘導(dǎo)cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生。而200μggp96和400μg人胎盤組織、漢遜酵母重組表達(dá)和昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的gp96蛋白均可以顯著誘導(dǎo)更高cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生。

表1gp96免疫對小鼠調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的影響(平均值±sd值)

注：與對照組相比，^*p<0.01

實施例3gp96在治療免疫性血小板減少性紫癜中的應(yīng)用

一、血小板數(shù)量的分析

1、豚鼠抗血小板抗血清(aps)的制備

取健康balb/c小鼠，眼眶取血，靜止1-2h，700rpm/min離心10min，取上層血清1500rpm/min離心15min，取上層血清900rpm/min離心10min，取上層血清3000rpm/min離心10min，棄去血清，得底部沉淀血小板，加入1％(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))草酸氨1ml，靜止5min，3000rpm/min離心10min，棄去上層液體，底部血小板用生理鹽水洗滌3次，計數(shù)，用生理鹽水稀釋到濃度為1×10⁹-2×10⁹個/l,分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按1:1比例混合成弗氏完全佐劑血小板抗原混合物與弗氏不完全佐劑血小板抗原混合物，備用。取健康豚鼠10只，于第一周注射弗氏完全佐劑血小板抗原混合物于其四肢、腹股溝、背部皮下，每處注射100μl，于第2，3，4周注射同劑量的弗氏不完全佐劑血小板抗原混合物。第4周麻醉豚鼠，心臟取血。1500rpm/min離心10min，取上層血清，余下全血繼續(xù)3000rpm/min離心10min。合并兩次血清，得豚鼠抗小鼠血小板血清(aps)。在96孔板中滴加50μl血小板懸液(500×10⁹個/l)，滴加2倍比例稀釋豚鼠抗小鼠血小板血清，37℃孵育24h。通過沉淀弧評價抗血清效價。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、小鼠分組免疫

120只六周齡的體重為18～22g的健康balb/c小鼠，隨機(jī)分成4組(每組30只)，分別進(jìn)行如下處理：

gp96處理組1：實驗第1天，腹腔注射實施例1制備胎盤組織提取的gp96蛋白；實驗第8天，再次腹腔注射實施例1制備胎盤組織提取的gp96蛋白；實驗第22天，再次腹腔注射實施例1制備的gp96蛋白。每次注射劑量均為200μggp96/只。

gp96處理組2：按照gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射用gp96蛋白改為酵母菌重組表達(dá)gp96蛋白。

gp96處理組3：按照gp96處理組1的操作步驟進(jìn)行，僅將注射用gp96蛋白改為昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)gp96蛋白。

處理組1～3中注射的蛋白是指將實施例1中制備的gp96蛋白或重組gp96蛋白制成凍干粉針劑后，溶于適量溶劑(例如pbs緩沖液)中，按每只小鼠200μggp96蛋白的給藥量進(jìn)行注射。

對照組：實驗第1天腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液，實驗第8天，再次腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液；實驗第22天，再次腹腔注射ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液。每次注射劑量均為100μl/只。

3、免疫性血小板減少性紫癜小鼠的制備

豚鼠抗小鼠血小板血清(aps)于56℃水浴30min滅活補(bǔ)體，以生理鹽水稀釋到1：4效價，對gp96免疫過的balb/c小鼠和對照小鼠進(jìn)行腹腔注射。于0，2，4，6，8，10d按照100μg/只小鼠腹腔注入稀釋的抗血清。

第10天后，眼眶取血，檢測血小板計數(shù)；處死小鼠，解剖取出脾臟，稱重，計算脾臟系數(shù)。

小鼠的血小板數(shù)量檢測結(jié)果見表2。結(jié)果表明，與對照組小鼠相比，經(jīng)gp96免疫小鼠的血小板數(shù)量顯著升高，3組gp96處理組無顯著差異。

小鼠的脾臟系數(shù)檢測結(jié)果見表2。結(jié)果表明，與對照組小鼠相比，經(jīng)gp96免疫小鼠的脾臟系數(shù)顯著下降，3組gp96處理組無顯著差異。上述結(jié)果表明，用gp96免疫小鼠，能夠有效的治療或減輕免疫性血小板減少性紫癜癥狀。

表2gp96免疫對小鼠血小板和脾臟系數(shù)的影響(平均值±sd值)

注：與對照組相比，^**p<0.01

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>北京熱休生物技術(shù)有限公司

<120>gp96蛋白在制備治療特發(fā)性血小板減少性紫癜藥物中的應(yīng)用

<130>khp171110217.1

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2352

<212>dna

<213>熱休克蛋白gp96

<400>1

atggacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaa60

ggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagaggaagaagctattcagttggatgga120

ttaaatgcatcacaaataagagaacttagagagaagtcggaaaagtttgccttccaagcc180

gaagttaacagaatgatgaaacttatcatcaattcattgtataaaaataaagagattttc240

ctgagagaactgatttcaaatgcttctgatgctttagataagataaggctaatatcactg300

actgatgaaaatgctctttctggaaatgaggaactaacagtcaaaattaagtgtgataag360

gagaagaacctgctgcatgtcacagacaccggtgtaggaatgaccagagaagagttggtt420

aaaaaccttggtaccatagccaaatctgggacaagcgagtttttaaacaaaatgactgaa480

gcacaggaagatggccagtcgtcttctgaattgattggccagtttggtgtcggtttctat540

tccgccttccttgtagcagataaggttattgtcacttcaaaacacaacaacgatacccag600

cacatctgggagtctgactccaatgaattttctgtaattgctgacccaagaggaaacact660

ctaggacggggaacgacaattacccttgtcttaaaagaagaagcatctgattaccttgaa720

ttggatacaattaaaaatctcgtcaaaaaatattcacagttcataaactttcctatttat780

gtatggagcagcaagactgaaactgttgaggagcccatggaggaagaagaagcagccaaa840

gaagagaaagaagaatctgatgatgaagctgcagtagaggaagaagaagaagaaaagaaa900

ccaaagactaaaaaagttgaaaaaactgtctgggactgggaacttatgaatgatatcaaa960

ccaatatggcagagaccatcaaaagaagtagaagaagatgaatacaaagctttctacaaa1020

tcattttcaaaggaaagtgatgaccccatggcttatattcactttactgctgaaggggaa1080

gttaccttcaaatcaattttatttgtacccacatctgctccacgtggtctgtttgacgaa1140

tatggatctaaaaagagcgattacattaagctctatgtgcgccgtgtattcatcccagac1200

gacttccatgatatgatgcctaaatacctcaattttgtcaagggtgtggtggactcagat1260

gatctccccttgaatgtttcccgcgagactcttcagcaacataaactgcttaaggtgatt1320

aggaagaagcttgttcgtaaaacgctggacatgatcaagaagattgctgatgataaatac1380

aatgatactttttggaaagaatttggtaccaacatcaagcttggtgtgattgaagaccac1440

tcgaatcgaacacgtcttgctaaacttcttaggttccagtcttctcatcatccaactgac1500

attactagcctagaccagtatgtggaaagaatgaaggaaaaacaagacaaaatctacttc1560

atggctgggtccagcagaaaagaggctgaatcttctccatttgttgagcgacttctgaaa1620

aagggctatgaagttatttacctcacagaacctgtggatgaatactgtattcaggccctt1680

cccgaatttgatgggaagaggttccagaatgttgccaaggaaggagtgaagttcgatgaa1740

agtgagaaaactaaggagagtcgtgaagcagttgagaaagaatttgagcctctgctgaat1800

tggatgaaagataaagcccttaaggacaagattgaaaaggctgtggtgtctcagcgcctg1860

acagaatctccgtgtgctttggtggccagccagtacggatggtctggcaacatggagaga1920

atcatgaaagcacaagcgtaccaaacgggcaaggacatctctacaaattactatgcgagt1980

cagaagaaaacatttgaaattaatcccagacacccgctgatcagagacatgcttcgacga2040

attaaggaagatgaagatgataaaacagttttggatcttgctgtggttttgtttgaaaca2100

gcaacgcttcggtcagggtatcttttaccagacactaaagcatatggagatagaatagaa2160

agaatgcttcgcctcagtttgaacattgaccctgatgcaaaggtggaagaagagcccgaa2220

gaagaacctgaggagacagcagaagacacaacagaagacacagagcaagacgaagatgaa2280

gaaatggatgtgggaacagatgaagaagaagaaacagcaaaggaatctacagctgaaaaa2340

gatgaattctaa2352

<210>2

<211>783

<212>prt

<213>熱休克蛋白gp96

<400>2

metaspaspgluvalaspvalaspglythrvalglugluaspleugly

151015

lysserarggluglyserargthraspaspgluvalvalglnargglu

202530

gluglualaileglnleuaspglyleuasnalaserglnileargglu

354045

leuargglulysserglulysphealapheglnalagluvalasnarg

505560

metmetlysleuileileasnserleutyrlysasnlysgluilephe

65707580

leuarggluleuileserasnalaseraspalaleuasplysilearg

859095

leuileserleuthraspgluasnalaleuserglyasnglugluleu

100105110

thrvallysilelyscysasplysglulysasnleuleuhisvalthr

115120125

aspthrglyvalglymetthrargglugluleuvallysasnleugly

130135140

thrilealalysserglythrserglupheleuasnlysmetthrglu

145150155160

alaglngluaspglyglnsersersergluleuileglyglnphegly

165170175

valglyphetyrseralapheleuvalalaasplysvalilevalthr

180185190

serlyshisasnasnaspthrglnhisiletrpgluseraspserasn

195200205

glupheservalilealaaspproargglyasnthrleuglyarggly

210215220

thrthrilethrleuvalleulysgluglualaserasptyrleuglu

225230235240

leuaspthrilelysasnleuvallyslystyrserglnpheileasn

245250255

pheproiletyrvaltrpserserlysthrgluthrvalgluglupro

260265270

metgluglugluglualaalalysgluglulysglugluseraspasp

275280285

glualaalavalgluglugluglugluglulyslysprolysthrlys

290295300

lysvalglulysthrvaltrpasptrpgluleumetasnaspilelys

305310315320

proiletrpglnargproserlysgluvalglugluaspglutyrlys

325330335

alaphetyrlysserpheserlysgluseraspaspprometalatyr

340345350

ilehisphethralagluglygluvalthrphelysserileleuphe

355360365

valprothrseralaproargglyleupheaspglutyrglyserlys

370375380

lysserasptyrilelysleutyrvalargargvalpheileproasp

385390395400

aspphehisaspmetmetprolystyrleuasnphevallysglyval

405410415

valaspseraspaspleuproleuasnvalserarggluthrleugln

420425430

glnhislysleuleulysvalilearglyslysleuvalarglysthr

435440445

leuaspmetilelyslysilealaaspasplystyrasnaspthrphe

450455460

trplysglupheglythrasnilelysleuglyvalilegluasphis

465470475480

serasnargthrargleualalysleuleuargpheglnserserhis

485490495

hisprothraspilethrserleuaspglntyrvalgluargmetlys

500505510

glulysglnasplysiletyrphemetalaglyserserarglysglu

515520525

alagluserserprophevalgluargleuleulyslysglytyrglu

530535540

valiletyrleuthrgluprovalaspglutyrcysileglnalaleu

545550555560

proglupheaspglylysargpheglnasnvalalalysgluglyval

565570575

lyspheaspgluserglulysthrlysgluserargglualavalglu

580585590

lysgluphegluproleuleuasntrpmetlysasplysalaleulys

595600605

asplysileglulysalavalvalserglnargleuthrgluserpro

610615620

cysalaleuvalalaserglntyrglytrpserglyasnmetgluarg

625630635640

ilemetlysalaglnalatyrglnthrglylysaspileserthrasn

645650655

tyrtyralaserglnlyslysthrphegluileasnproarghispro

660665670

leuileargaspmetleuargargilelysgluaspgluaspasplys

675680685

thrvalleuaspleualavalvalleuphegluthralathrleuarg

690695700

serglytyrleuleuproaspthrlysalatyrglyaspargileglu

705710715720

argmetleuargleuserleuasnileaspproaspalalysvalglu

725730735

glugluprogluglugluproglugluthralagluaspthrthrglu

740745750

aspthrgluglnaspgluaspgluglumetaspvalglythraspglu

755760765

gluglugluthralalysgluserthralaglulysaspgluphe

770775780