本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及細(xì)胞因子il-17c及其在免疫系統(tǒng)中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及試劑在制備藥物中的用途、激活免疫細(xì)胞的方法、疫苗及篩選藥物的方法。

背景技術(shù)：

白細(xì)胞介素即是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子。大量文獻(xiàn)證實(shí)白介素17(il-17)家族的細(xì)胞因子在免疫性疾病中起著非常重要的作用。il-17家族包括六個(gè)成員：il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e以及il-17f。研究發(fā)現(xiàn)，il-17家族的另一個(gè)成員il-17c以il-17ra和il-17re二聚體為受體。與家族其他成員一樣，il-17c也以act1為接頭蛋白，被認(rèn)為參與宿主抗檸檬酸桿菌(citrobacterrodentium)感染以及諸多自身免疫性疾病的病理過程如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、牛皮癬以及關(guān)節(jié)炎等。

然而，il-17c以及其受體il-17re在免疫系統(tǒng)中生物學(xué)作用仍有待研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。為此，本發(fā)明提出了一種試劑在制備藥物中的用途、激活免疫細(xì)胞的方法、疫苗及篩選藥物的方法。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于抑制肝臟免疫系統(tǒng)的激活，所述試劑為選自下列的至少之一：(i)il-17c拮抗劑或其功能類似物；(ii)il-17re拮抗劑或其功能類似物；和(iii)il-17c或il-17re的表達(dá)抑制劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地抑制免疫細(xì)胞活化，從而抑制免疫系統(tǒng)的激活。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療自身免疫性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地抑制免疫細(xì)胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療自身免疫性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療自身免疫性肝炎。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地抑制肝臟免疫細(xì)胞活化，抑制肝臟免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療自身免疫性肝炎的效果。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于激活肝臟免疫系統(tǒng)，所述試劑為選自下列的至少之一：(a)il-17c或其功能類似物；(b)分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞；(c)il-17c激動(dòng)劑或其功能類似物；(d)il-17re或其功能類似物；(e)il-17re激動(dòng)劑或其功能類似物；和(f)(a)～(e)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠促使免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療免疫缺陷疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地使得免疫細(xì)胞活化，激活免疫系統(tǒng)，從而起到治療免疫缺陷疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞為肝細(xì)胞。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地使得免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種激活免疫細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：使免疫細(xì)胞與選自下列的至少之一接觸：(a)il-17c或其功能類似物；(b)分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞；(c)il-17c激動(dòng)劑或其功能類似物；(d)il-17re或其功能類似物；(e)il-17re激動(dòng)劑或其功能類似物；和(f)(a)～(e)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠有效地使得免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞是cd4⁺t細(xì)胞，所述分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞為肝細(xì)胞。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠有效地使得免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種疫苗。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述疫苗含有抗原以及選自下列的至少之一：(a)il-17c或其功能類似物；(b)分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞；(c)il-17c激動(dòng)劑或其功能類似物；(d)il-17re或其功能類似物；(e)il-17re激動(dòng)劑或其功能類似物；和(f)(a)～(e)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的疫苗能夠在機(jī)體內(nèi)使免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種篩選藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將候選試劑與免疫細(xì)胞接觸，所述免疫細(xì)胞表達(dá)il-2；確定所述接觸前后，所述免疫細(xì)胞的il-2表達(dá)水平；所述接觸后il-2表達(dá)水平變化是所述候選試劑作為藥物的指示，其中，所述接觸后il-2表達(dá)水平降低是所述候選試劑作為自體免疫性疾病藥物的指示，所述接觸后il-2表達(dá)水平提高是所述候選試劑作為免疫激活藥物的指示。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選藥物的方法能夠獲得自體免疫疾病藥物或免疫激活藥物。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的il-17c缺陷對(duì)ast和alt的表達(dá)水平的影響示意圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的自身免疫性肝炎小鼠肝臟中il-17c表達(dá)水平示意圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的il-17c缺陷的自身免疫性肝炎小鼠的免疫應(yīng)答分析示意圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的cd4⁺t、cd8⁺t、nkt和nk細(xì)胞中cd25和cd69的表達(dá)水平示意圖；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的il-17c作用于t細(xì)胞的效果分析示意圖；以及

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的il-17c依賴性肝損傷中nk細(xì)胞分析示意圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

定義和一般術(shù)語

本發(fā)明意圖涵蓋所有的替代、修改和等同技術(shù)方案，它們均包括在如權(quán)利要求定義的本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，許多與本文所述類似或等同的方法和材料能夠用于實(shí)踐本發(fā)明。本發(fā)明絕不限于本文所述的方法和材料。在所結(jié)合的文獻(xiàn)、專利和類似材料的一篇或多篇與本申請(qǐng)不同或相矛盾的情況下(包括但不限于所定義的術(shù)語、術(shù)語應(yīng)用、所描述的技術(shù)，等等)，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。

應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的某些特征，為清楚可見，在多個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但也可以在單個(gè)實(shí)施例中以組合形式提供。反之，本發(fā)明的各種特征，為簡潔起見，在單個(gè)實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但也可以單獨(dú)或以任意適合的子組合提供。

除非另外說明，本發(fā)明所使用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解相同的含義。本發(fā)明涉及的所有專利和公開出版物通過引用方式整體并入本發(fā)明。

除非另有說明或者上下文中有明顯的沖突，本文所使用的冠詞“一”、“一個(gè)(種)”和“所述”旨在包括“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”。因此，本文所使用的這些冠詞是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))賓語的冠詞。例如，“一組分”指一個(gè)或多個(gè)組分，即可能有多于一個(gè)的組分被考慮在所述實(shí)施方案的實(shí)施方式中采用或使用。

術(shù)語“含有”為開放式表達(dá)，即包括本發(fā)明所指明的內(nèi)容，但并不排除其他方面的內(nèi)容。

術(shù)語“功能類似物”是指具有相似功能的物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)不限定相同，只要具有相同或類似的功能即可。

術(shù)語“激動(dòng)劑”是指與某生物活性物質(zhì)的受體結(jié)合，呈現(xiàn)該活性物質(zhì)的作用的物質(zhì)或藥品。

術(shù)語“拮抗劑”是指能與受體結(jié)合，但不具備內(nèi)在活性的一類物質(zhì)。拮抗劑分為競爭性拮抗劑和非競爭性拮抗劑。

本發(fā)明所使用的“自身免疫性疾病”是指與體液或細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)身體自身組分應(yīng)答相關(guān)的組織損傷的任意疾病的集合。

本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途、激活免疫細(xì)胞的方法、疫苗及篩選藥物的方法，下面將分別對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述。

試劑在制備藥物中的用途

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，藥物用于激活肝臟免疫系統(tǒng)，試劑為選自下列的至少之一：(a)il-17c或其功能類似物；(b)分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞；(c)il-17c激動(dòng)劑或其功能類似物；(d)il-17re或其功能類似物；(e)il-17re激動(dòng)劑或其功能類似物；和(f)(a)～(e)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠促使免疫細(xì)胞活化，從而激活肝臟免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，il-17c或其功能類似物能夠結(jié)合并激活il-17re，進(jìn)而進(jìn)一步促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，當(dāng)分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞活化。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，il-17c激動(dòng)劑或其功能類似物的作用下，il-17c表達(dá)活性提高，進(jìn)一步在高表達(dá)活化的il-17c作用下，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，il-17re或其功能類似物通過與il-17c結(jié)合，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，il-17re激動(dòng)劑或其功能類似物的作用下，il-17re活性提高，進(jìn)一步在活化的il-17re作用下，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，(a)～(e)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑的作用下，能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，藥物用于治療免疫缺陷疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物能夠激活免疫系統(tǒng)，從而治療免疫缺陷疾病。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞為肝細(xì)胞。t細(xì)胞分裂素cona誘導(dǎo)的小鼠肝炎是一種廣泛應(yīng)用的與人自身免疫性肝炎非常相似的動(dòng)物模型。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)cona處理后的小鼠中該試劑大量分泌。經(jīng)深入研究發(fā)現(xiàn)，該試劑能夠刺激肝臟局部cd4⁺t細(xì)胞中il-2的表達(dá)，從而促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化，從而激活免疫系統(tǒng)。進(jìn)一步地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，il-17c主要是由肝細(xì)胞分泌的，其受體il-17re主要表達(dá)在肝臟浸潤的t細(xì)胞表面。

試劑在制備藥物中的用途

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，藥物用于抑制肝臟免疫系統(tǒng)的激活，試劑為選自下列的至少之一：(i)il-17c拮抗劑或其功能類似物；(ii)il-17re拮抗劑或其功能類似物；和(iii)il-17c或il-17re的表達(dá)抑制劑。由此，可有效地抑制免疫細(xì)胞活化，從而抑制免疫系統(tǒng)的激活。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，藥物用于治療自身免疫性疾病。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，藥物用于治療自身免疫性肝炎。由此，該藥物能夠有效地抑制免疫細(xì)胞活化，從而抑制免疫系統(tǒng)的激活，以便治療自身免疫性疾病。具體地，該藥物能夠抑制肝臟局部cd4⁺t細(xì)胞中il-2的表達(dá)抑制免疫細(xì)胞的活化，從而抑制自身免疫肝炎的發(fā)生。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，il-17c主要是由肝細(xì)胞分泌的，其受體il-17re主要表達(dá)在肝臟浸潤的t細(xì)胞表面。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，前面所描述的藥物還可以進(jìn)一步包括可接受的輔料、賦形劑、載體、溶媒或它們的組合。

激活免疫細(xì)胞的方法

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種激活免疫細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：使免疫細(xì)胞與選自下列的至少之一接觸：(a)il-17c或其功能類似物；(b)分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞；(c)il-17c激動(dòng)劑或其功能類似物；(d)il-17re或其功能類似物；(e)il-17re激動(dòng)劑或其功能類似物；和(f)(a)～(e)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞是cd4⁺t細(xì)胞，分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞為肝細(xì)胞。上述(a)～(f)任一項(xiàng)能夠刺激肝臟局部cd4⁺t細(xì)胞中il-2的表達(dá)，從而促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

疫苗

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種疫苗。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該疫苗含有抗原以及選自下列的至少之一：(a)il-17c或其功能類似物；(b)分泌il-17或其功能類似物的細(xì)胞；(c)il-17c激動(dòng)劑或其功能類似物；(d)il-17re或其功能類似物；(e)il-17re激動(dòng)劑或其功能類似物；和(f)(a)～(e)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的疫苗能夠在機(jī)體內(nèi)使免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

篩選藥物的方法

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種篩選藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，方法包括：將候選試劑與免疫細(xì)胞接觸，免疫細(xì)胞表達(dá)il-2；確定接觸前后，免疫細(xì)胞的il-2表達(dá)水平；接觸后il-2表達(dá)水平變化是候選試劑作為藥物的指示，其中，接觸后il-2表達(dá)水平降低是候選試劑作為自體免疫性疾病藥物的指示，接觸后il-2表達(dá)水平提高是候選試劑作為免疫激活藥物的指示。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選藥物的方法能夠獲得自體免疫疾病藥物或免疫激活藥物。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

在以下實(shí)施例中，所涉及的關(guān)鍵技術(shù)如下所述：

1、cona誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型的建立

以12mg/kg的劑量自小鼠尾靜脈注射，誘導(dǎo)t細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎。在過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，劑量調(diào)整為12mg/kg。在注射后的指定時(shí)間點(diǎn)采集血清檢測(cè)alt和ast的表達(dá)水平。

2、肝細(xì)胞分離

小鼠肝臟pbs原位灌注后，采用1mg/ml膠原酶a進(jìn)行消化，然后鈍性撕裂組織，將過濾洗滌好的細(xì)胞懸液離心后重懸于50％percoll中并離心，底部的肝細(xì)胞采用10％fbs-dmem-f12培養(yǎng)基以5×10⁵密度種于6孔板中，培養(yǎng)基中含1μm胰島素、0.1μm地塞米松、15mmhepes、2mml-glutamin以及1％非必需氨基酸。隔天更換培養(yǎng)基后采用細(xì)胞因子刺激4小時(shí)。

3、酶聯(lián)免疫吸附(elisa)

在不同時(shí)間點(diǎn)收集cona誘導(dǎo)的肝炎小鼠血清，按照ebioscience和bdpharmingen公司試劑說明書測(cè)定血清中tnf-α、il-6、ifn-γ、il-2和il-17a的表達(dá)量。

4、單核細(xì)胞分離及流式分析

采用上述原位灌注消化的方法得到肝臟單核細(xì)胞，經(jīng)40％percoll離心后富集得到肝臟單個(gè)核細(xì)胞，然后采用cd16/32孵育封閉后，進(jìn)行所需要的表面抗體染色；對(duì)于胞內(nèi)細(xì)胞因子il-2和ifn-γ的染色，細(xì)胞須50ng/mlpma和500ng/mlionomycin刺激5小時(shí)，其中刺激1小時(shí)后加入golgiplug。采用bdlsrfortessa進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，分析軟件采用flowjo；此外，細(xì)胞分選部分，經(jīng)過各自表面抗體染色后，如nk(cd3^-nk1.1⁺),nkt(cd3⁺nk1.1⁺),cd4⁺t(cd3⁺nk1.1^-cd4⁺),cd8⁺t(cd3⁺nk1.1^-cd8⁺),bcell(cd3^-cd19⁺),andmacrophage(f4/80⁺cd11b⁺)，采用bdfacsariaiii進(jìn)行分選。

5、實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-timepcr)

用trizol(invitrogen)試劑提出細(xì)胞以及肝臟組織的rna并按照cdna反轉(zhuǎn)試劑盒(invitrogen)將rna反轉(zhuǎn)成cdna。應(yīng)用iqsyrbgreensupermix(bio-radlaboratories)進(jìn)行cdna樣本的實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)程序?yàn)椋侯A(yù)變性(95度，3分鐘)；變性(95度，10秒)，退火(60度，30秒)，延伸(72度，30秒)，40個(gè)循環(huán)。以gapdh為內(nèi)參，以2-△△ct為計(jì)算方法。

6、肝臟白細(xì)胞體外刺激和過繼轉(zhuǎn)移

正常肝臟白細(xì)胞在2μg/mlcona(sigma)，1μg/mlcd3(bioxcell)，或1μg/mlcd3和cd28(bioxcell)刺激條件下加或不加100ng/mlil-17c(r&d)處理3天。再在golgiplug存在條件下用50ng/mlpma和500ng/mlionomycin刺激5小時(shí)，用流式的方法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：2×10⁶肝臟白細(xì)胞在cd3和cd28刺激情況下加或不加il-17c處理3天后過繼轉(zhuǎn)移到野生型小鼠體內(nèi)，1天后注射cona建立自身免疫性肝炎模型，檢測(cè)未處理組和il-17c處理組小鼠肝損傷嚴(yán)重程度。

7、組織學(xué)檢測(cè)和免疫組織化學(xué)

收集cona誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎小鼠的肝臟，用10％甲醛溶液固定后石蠟包埋，切成5μm厚的切片。再進(jìn)行二甲苯脫蠟和剃度酒精至水后，進(jìn)行he染色以評(píng)估肝損傷。免疫組織化學(xué)：脫蠟至水后，抗原修復(fù)液(碧云天)孵育進(jìn)行抗原修復(fù)；3％h2o2室溫孵育15min去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；5％bsa室溫孵育15min去除非特異性結(jié)合；分別孵育兔抗鼠il-17c一抗(bioss)或山羊抗人il-17c一抗(r&d)，兔抗人/鼠il-17re一抗4度過夜；孵育hrp標(biāo)記的二抗，dab顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，剃度酒精脫水。

8、nk細(xì)胞敲除

50μl抗-asialogm1(wakopurechemicalindustries)用200μlpbs稀釋后腹腔注射入小鼠體內(nèi)，2天后流式檢測(cè)nk細(xì)胞敲除效率并注射cona建立肝炎模型。

實(shí)施例1il-17c/il-17re在cona誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的作用

為了闡明il-17c/il-17re信號(hào)通路在自身免疫性肝炎中的作用，我們分別給野生型小鼠(wt)，il-17re缺陷型小鼠(il-17re^-/-)，il-17受體家族其他成員il-17rb以及il-17rd缺陷型小鼠(il-17rb^-/-,il-17rd^-/-)，act1(il-17re下游信號(hào)通路接頭蛋白)缺陷小鼠(act1^-/-)，il-17c缺陷小鼠(il-17c^-/-)尾靜脈注射12ug/gcona建立自身免疫性肝炎模型。結(jié)果如圖1所示，其中圖a～c分別表示wt,il-17rb^-/-,il-17rd^-/-,il-17re^-/-,act1^-/-,il-17c^-/-各組小鼠經(jīng)cona尾靜脈注射后，在8小時(shí)和24小時(shí)分別采集血清，檢測(cè)ast和alt的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)il-17rb缺陷和il-17rd缺陷并不影響小鼠肝損傷程度，但是il-17c^-/-、il-17re^-/-和act1^-/-小鼠的肝損傷程度顯著減輕。

實(shí)施例2il-17c在肝炎小鼠及自身免疫性肝炎病人肝臟中的表達(dá)

鑒于以上結(jié)果，我們下一步通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr和免疫組化的方法，闡明il-17c在自身免疫性肝炎肝臟中的表達(dá)及產(chǎn)生的細(xì)胞來源。結(jié)果如圖2所示，其中圖a顯示了il-17cmrna水平在cona注射后8小時(shí)達(dá)到高峰；圖b的ihc結(jié)果同樣顯示cona注射后8小時(shí)肝組織中il-17c表達(dá)分布明顯高于igg對(duì)照組。圖c顯示了血管瘤病人和自身免疫性肝炎(aih)病人組織樣本ihc檢測(cè)il-17c的表達(dá)。圖d顯示了正常和cona處理過的小鼠肝組織中il-17re的表達(dá)情況，以及血管瘤病人和aih病人組織樣本ihc檢測(cè)il-17re的表達(dá)。(e)正常和cona處理過的小鼠肝組織中肝細(xì)胞和分選出的各類型免疫細(xì)胞中il-17c的mrna水平。圖f顯示了正常和rag1^-/-小鼠經(jīng)cona處理后肝組織中il-17c的mrna水平。圖g顯示了原代肝細(xì)胞經(jīng)以下不同細(xì)胞因子刺激4小時(shí)后il-17c的mrna表達(dá)水平：il-6(20ng/ml)、il-4(20ng/ml)、il-1α(10ng/ml)、il-17a(50ng/ml)、ifn-γ(20ng/ml)、il-1β(10ng/ml)、tnf-α(10ng/ml)。

我們發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，cona處理小鼠肝臟組織中il-17c和il-17re的表達(dá)顯著增加(圖2a,2b,2d)。而且，與血管瘤病人相比，il-17c和il-17re的表達(dá)在自身免疫性肝炎病人肝臟中的表達(dá)顯著增加(圖2c,2d)。為了進(jìn)一步理解il-17c產(chǎn)生的細(xì)胞來源，我們分別分離出正常小鼠和自身免疫性肝炎小鼠肝臟中的肝細(xì)胞以及肝臟浸潤免疫細(xì)胞包括nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞、cd4⁺t細(xì)胞、cd8⁺t細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和b細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)il-17c的表達(dá)主要來源于肝細(xì)胞而不是免疫細(xì)胞(圖2e)；而且，在自身免疫性肝炎中il-17c表達(dá)的升高依賴于t細(xì)胞(圖2f)。另外，我們發(fā)現(xiàn)tnf-α、il-1α和il-17a能夠顯著地刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生il-17c，而il-1β和il-4能輕微地上調(diào)il-17c的表達(dá)(圖2g)。

實(shí)施例3il-17c缺陷下調(diào)自身免疫性肝炎小鼠的炎癥免疫應(yīng)答

為了進(jìn)一步了解il-17c調(diào)節(jié)肝炎的機(jī)制，我們分析了cona處理后的野生型小鼠和il-17c缺陷小鼠炎癥免疫應(yīng)答情況。結(jié)果如圖3所示，其中，圖a顯示了elisa檢測(cè)血清中炎癥因子il-2、il-6、tnf-α及ifn-γ的表達(dá)。圖b顯示了real-timepcr檢測(cè)肝組織中細(xì)胞因子如il-2、ifn-γ及il-17a的表達(dá)水平。圖c顯示了正常和il-17c^-/-小鼠肝組織中肝細(xì)胞和各類型免疫細(xì)胞數(shù)目的比較。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)與正常小鼠相比，il-17c缺陷小鼠的血清中il-2、il-6、tnf-α、ifn-γ的表達(dá)顯著下降(圖3a)；(2)與正常小鼠相比，il-17c缺陷小鼠的肝臟組織中il-2mrna的表達(dá)也顯著下降(圖3b)，但是il-17c缺失并不影響肝臟組織中ifn-γ和il-17a的表達(dá)；(3)與正常小鼠相比，il-17c缺陷小鼠肝臟中免疫細(xì)胞浸潤也明顯減少，尤其是nk細(xì)胞，但是il-17c缺失并不影響cd3⁺t細(xì)胞、cd4⁺t細(xì)胞、cd8⁺t細(xì)胞、nkt細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量(圖3c)。以上數(shù)據(jù)表明il-17c是cona誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中炎癥免疫應(yīng)答所必須的。

實(shí)施例4il-17c在cona誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎小鼠中促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化

根據(jù)以上的結(jié)果，il-17c缺失顯著下調(diào)了肝炎小鼠肝臟組織中il-2的表達(dá)水平。由于il-2與免疫細(xì)胞的活化密切相關(guān)，因而我們進(jìn)一步比較了兩組小鼠中免疫細(xì)胞的活化情況。結(jié)果如圖4所示，其中圖a-f分別顯示了經(jīng)cona處理后24小時(shí)，檢測(cè)正常和il-17c^-/-小鼠肝組織中cd4⁺t、cd8⁺t、nkt和nk細(xì)胞中cd25和cd69的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示：肝炎小鼠中il-17c缺失顯著下調(diào)了肝臟組織中cd4⁺t細(xì)胞、cd8⁺t細(xì)胞和nk細(xì)胞表面活化分子cd25和cd69的表達(dá)，但是il-17c缺失并不影響nkt細(xì)胞的活化。

實(shí)施例5il-2產(chǎn)生的細(xì)胞來源以及il-17c的作用機(jī)制

結(jié)果如圖5所示，其中圖a顯示了cona處理的野生型和il-17c敲除小鼠的肝臟cd4⁺t細(xì)胞、cd8⁺t細(xì)胞、nk細(xì)胞和nkt細(xì)胞il-2mrna的實(shí)時(shí)定量rt-pcr分析。圖b顯示了cona處理的野生型小鼠和il-17c敲除小鼠肝臟白細(xì)胞用cona再刺激5小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)il-2染色分析。圖c顯示了cona處理前30分鐘或者4小時(shí)后對(duì)野生型和il-17c敲除小鼠進(jìn)行或不進(jìn)行1.5ug的ril-17c的腹腔注射，細(xì)胞因子il-2染色分析。圖d顯示了在cona注射24小時(shí)之后血清中ast和alt的活性。圖e和f顯示了96孔板(2x10⁵個(gè)細(xì)胞/孔)培養(yǎng)正常肝臟白細(xì)胞，在添加或者不添加il-17c的情況下用cona、anti-cd3、或者anti-cd3和anti-cd28刺激3天。cd4⁺t細(xì)胞的il-2表達(dá)量的流式分析(e)；在這些刺激下，肝臟白細(xì)胞培養(yǎng)上清液中il-2的含量用elisa測(cè)量(f)。圖g和h分別顯示了在添加或不添加il-17c情況下用anti-cd3和anti-cd28共同刺激的2×10⁶個(gè)肝臟白細(xì)胞移植到b6小鼠體內(nèi)，24小時(shí)之后用10mg/kg的cona處理。在cona注射的8小時(shí)和24小時(shí)之后測(cè)量血清的ast和alt活性(g)。在cona處理的24小時(shí)之后，用elisa檢測(cè)血清中il-2、il-6、tnf-α和ifn-γ的含量(h)。

由于il-2主要由cd4⁺t細(xì)胞分泌而且我們之前的研究表明il-17c能夠作用于cd4⁺t細(xì)胞，基于這兩個(gè)原因，為了證明il-17c能夠刺激cd4⁺t細(xì)胞產(chǎn)生il-2，我們首先從cona處理的野生型小鼠和il-17c缺陷小鼠的肝臟組織中分選出nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞、cd4⁺t細(xì)胞和cd8⁺t細(xì)胞，real-timepcr結(jié)果顯示：il-17c缺陷顯著降低了cd4⁺t細(xì)胞中il-2的mrna表達(dá)(圖5a)。我們的流式結(jié)果也證實(shí)il-17c缺失導(dǎo)致cd4⁺t細(xì)胞il-2的表達(dá)量下降(圖5b)，給予il-17c缺失小鼠注射il-17c能夠上調(diào)cd4⁺t細(xì)胞中il-2表達(dá)(圖5c,5d)。

體外實(shí)驗(yàn)中，我們分別在(1)cona，(2)cd3，(3)cd3和cd28刺激條件下加或不加il-17c處理正常肝臟白細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這三種刺激情況下il-17c處理組均能夠顯著地上調(diào)cd4+t細(xì)胞中il-2的表達(dá)(圖5e,5f)。值得注意的是，il-17c并不影響cd4⁺t細(xì)胞中ifn-γ的表達(dá)，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中il-17c缺陷小鼠肝臟組織中ifn-γ的表達(dá)不受影響(圖3b)的結(jié)果是一致的。而且，當(dāng)把cd3和cd28刺激情況下加或不加il-17c的肝臟白細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到野生型小鼠體內(nèi)，1天后注射cona建立自身免疫性肝炎模型，我們發(fā)現(xiàn)il-17c處理組的肝損傷明顯比不加il-17c處理組嚴(yán)重(圖5g)。另外，與不加il-17c處理組相比，il-17c處理組小鼠血清中il-2的表達(dá)量增加(圖5h)。因此，il-17c在cona誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中能夠增強(qiáng)cd4+t細(xì)胞il-2的分泌。

實(shí)施例6il-17c依賴性肝損傷需要nk細(xì)胞的參與

以上數(shù)據(jù)表明il-17c缺失顯著影響了自身免疫性肝炎小鼠中il-2的表達(dá)量以及nk細(xì)胞的數(shù)量和活化程度，而大量文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)il-2在體內(nèi)能夠幫助nk細(xì)胞增殖和激活，因此il-17c依賴性肝損傷可能需要nk細(xì)胞的參與。結(jié)果如圖6所示，其中圖a顯示了cona處理24小時(shí)的野生型和il-17c敲除小鼠肝臟nk細(xì)胞比例。圖b顯示了cona處理的野生型和il-17c敲除小鼠的肝臟cd4⁺t細(xì)胞、cd8⁺t細(xì)胞、nk細(xì)胞和nkt細(xì)胞中trailmrna的表達(dá)分析。圖c-e顯示了在cona處理2天前對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射asialo-gm1單克隆抗體來敲除nk細(xì)胞，nk細(xì)胞敲除效率的分析(c)；注射cona8小時(shí)和24小時(shí)后收集血清分析ast和alt的水平(d)以及il-2,ifn-γ的水平(e)。

實(shí)驗(yàn)證明il-17c缺陷型自身免疫性肝炎小鼠的肝臟中nk細(xì)胞的比例和trail的表達(dá)顯著下降(圖6a,6b)，說明il-17c缺失確實(shí)下調(diào)了肝炎小鼠肝臟中nk細(xì)胞的增殖和殺傷活性。為了進(jìn)一步研究cona誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中il-17c與nk細(xì)胞的關(guān)系，我們?cè)诟窝仔∈笾袘?yīng)用nk細(xì)胞敲除抗體(圖6c)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除nk細(xì)胞明顯減輕了野生型小鼠和il-17c缺陷小鼠的肝損傷程度和血清中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)(圖6d,6e)；與此同時(shí)，nk細(xì)胞的敲除明顯縮小了野生型小鼠和il-17c缺陷型小鼠之間肝損傷程度的差異(圖6d,6e)。因此，il-17c依賴性肝損傷需要nk細(xì)胞的參與。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。