本發(fā)明屬于脂肪干細胞培養(yǎng)及其分化再生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物和三維生物打印人體骨組織的方法。

背景技術(shù)：

由于齲病、牙周病、外傷、腫瘤等因素造成的頜面部的骨組織缺損，是口腔科醫(yī)師經(jīng)常要面對的難題，骨組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為骨缺損的修復(fù)提供了前景廣闊的新選擇。人脂肪間充質(zhì)干細胞（adscs）取材于脂肪組織，人體豐富的脂肪組織可為adscs的提取提供充足的來源。adscs與骨髓間充質(zhì)干細胞（bmscs）一樣具有多向分化潛能，能逃避免疫識別，具有免疫特赦作用；與bmscs相比，除了來源更加豐富外，其取材較bmscs方便、對供體損傷小，且干細胞含量高及體外擴增能力強，具有易于臨床推廣等優(yōu)點，已成為骨組織工程學(xué)研究中的熱點。目前的研究表明adscs還能自分泌功能性細胞因子，包括誘導(dǎo)軟骨形成的分子，adscs將可能替代bmscs成為理想的種子細胞。傳統(tǒng)的骨組織工程技術(shù)，其基本原理是講體外培養(yǎng)擴增的種子細胞復(fù)合到支架材料商，構(gòu)成細胞-支架復(fù)合體，在進行體外培養(yǎng)或植入體內(nèi)相應(yīng)的病損部位。傳統(tǒng)技術(shù)下，對支架材料內(nèi)部的細胞分布和密度難以精確控制。

三維打印(three-dimensionalprinting)技術(shù)，即快速成型技術(shù)，是一種以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，應(yīng)用粉末狀金屬或塑料等可粘合材料，通過逐層打印的方式來構(gòu)造物體的技術(shù)。隨著材料的增多及打印機及原材料價格的降低，其打印速度快、高易用性等優(yōu)勢使其應(yīng)用于多個領(lǐng)域，其中包括三維生物打印。三維生物打印是在快速成形技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，結(jié)合細胞生物學(xué)、計算機輔助設(shè)計(computeraideddesign，cad)和生物材料學(xué)等多個領(lǐng)域的研究成果，發(fā)展而來的一種新型的組織工程技術(shù)，其最終目標是實現(xiàn)器官打印。三維生物打印技術(shù)克服了傳統(tǒng)組織工程技術(shù)的局限性，不但可構(gòu)建形態(tài)、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織工程支架，而且可實現(xiàn)不同密度的種子細胞在不同支架材料中的三維精確定位，還可將細胞和打印基質(zhì)混合，在計算機輔助下，按照預(yù)先設(shè)計的特定的三維結(jié)構(gòu)，對活細胞、生物活性組織及相關(guān)生物材料等構(gòu)成的共混合物直接進行逐層堆積。從而更精確的實現(xiàn)細胞的合理分布，做出更接近自然生長骨組織的人工骨組織。目前，國內(nèi)外的研究中已經(jīng)證明，將骨髓干細胞進行三維生物打印后，體外培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)仍具有較高的活性以及分化能力。而用人脂肪間充質(zhì)干細胞打印人體骨組織的方法所得到的骨組織在強度結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)還存在不合理性，打印體內(nèi)部細胞難以形成營養(yǎng)供給的通道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物，采用人脂肪間充質(zhì)干細胞與海藻酸鈉-明膠混合物作為微打印基質(zhì)；材料具有可塑性并可通過溫度和交聯(lián)劑控制其交聯(lián)過程，符合細胞共混物三維生物打印的低溫打印過程的工藝要求和生物學(xué)要求。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種利用本發(fā)明所述的用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物三維生物打印人體骨組織的方法，按照預(yù)先設(shè)計的特定的三維結(jié)構(gòu)，通過結(jié)合傳統(tǒng)組織工程學(xué)支架結(jié)構(gòu)，使打印物具有合理的強度結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使打印物內(nèi)部細胞形成營養(yǎng)供給的通道。

為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物，其包含人脂肪間充質(zhì)干細胞、海藻酸鈉、明膠干粉以及作為溶劑的生理鹽水的混合物。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的混合物中，海藻酸鈉的濃度為15-25g/l，明膠的濃度為75-85g/l,人脂肪間充質(zhì)干細胞密度為0.5×10⁶-2×10⁶個/ml。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的混合物中海藻酸鈉的濃度為20g/l，明膠的濃度為80g/l,人脂肪間充質(zhì)干細胞密度為1×10⁶個/ml。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞是將購買的人脂肪間充質(zhì)干細胞中加入增值培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)后收集的第四代種子細胞。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的增殖培養(yǎng)基為dmem+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素。

一種利用本發(fā)明所述的用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物三維生物打印人體骨組織的方法，該方法包括：

傳代培養(yǎng)：將人脂肪間充質(zhì)干細胞置于增值培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)；

制備人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物：將海藻酸鈉與明膠干粉分別用生理鹽水溶解，混合后制成混合溶膠，上述傳代培養(yǎng)后的第四代人脂肪間充質(zhì)干細胞加入到混合溶膠中，攪拌均勻后得到人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物；

設(shè)計打印物形狀：參照傳統(tǒng)組織工程學(xué)支架結(jié)構(gòu)將打印體設(shè)計為多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；

三維打印成型：將上述人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物置于三維生物打印機的料盒中，打印成預(yù)先設(shè)計好的結(jié)構(gòu)，得到打印成型的組織結(jié)構(gòu)；

交聯(lián)處理：將上述打印成型的組織結(jié)構(gòu)用cacl2和kcl2的混合溶液對其進行交聯(lián)，得到打印人體骨組織。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的方法還包括對傳代培養(yǎng)后的第四代人脂肪間充質(zhì)干細胞成骨分化能力的鑒定：待第四代人脂肪間充質(zhì)干細胞生長至70%-80%匯合后接種至六孔板，加入成骨培養(yǎng)基，成骨誘導(dǎo)7天后，進行堿性磷酸酶染色，以細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)藍紫色判斷為陽性；成骨誘導(dǎo)14天后，進行茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色，pbs沖洗細胞三次，體積分數(shù)為95%冰乙醇固定30分鐘；蒸餾水沖洗3次，每孔加1ml茜素紅染液，常溫放置，染色20-30分鐘；染色結(jié)束后洗去染液，蒸餾水沖洗，以細胞間質(zhì)出現(xiàn)紅染結(jié)節(jié)判斷為陽性。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的成骨培養(yǎng)基為dmem+10%胎牛血清+1青、鏈霉素+10mmol/lβ-磷酸甘油+200mmol/l抗壞血酸+100nmol地塞米松。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的制備人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物具體步驟為：將購買的人脂肪間充質(zhì)干細胞加入增值培養(yǎng)基中，置于體積分數(shù)5%的co2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至6-8天，細胞生長至70%-80%匯合狀態(tài)后，進行細胞傳代，每個培養(yǎng)皿中的細胞依次經(jīng)過胰酶消化、中和、離心和重懸后，接種至3個培養(yǎng)皿中，6-7天匯合度達到80%-90%后，再次進行傳代；傳代兩次后的標記為p4，作為種子細胞待用。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的三維打印成型過程中，具體參數(shù)如下：打印溫度15℃，打印噴頭直徑250μm，打印微絲直徑200μm，微絲中心間距400μm；打印時打印噴頭運動，將噴出的共混合物拉成絲狀，沉積到載有無菌細胞培養(yǎng)皿的平臺上，逐層完成打印。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下：

1.本發(fā)明所述的用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物，采用人脂肪間充質(zhì)干細胞與海藻酸鈉-明膠混合物作為微打印基質(zhì)；材料具有可塑性并可通過溫度和交聯(lián)劑控制其交聯(lián)過程，符合細胞共混物三維生物打印的低溫打印過程的工藝要求和生物學(xué)要求；

2.本發(fā)明所述的利用本發(fā)明所述的用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物三維生物打印人體骨組織的方法參照傳統(tǒng)組織工程學(xué)支架結(jié)構(gòu)，將人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體設(shè)計為多孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，既可以保證打印物有一定的結(jié)構(gòu)強度，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)本身的空隙大小，又可保證打印體內(nèi)部細胞有營養(yǎng)供給的通道。

下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體的顯微鏡圖；其中箭頭所指為細胞；

圖2是本發(fā)明所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物成骨誘導(dǎo)7天后堿性磷酸酶染色結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物成骨誘導(dǎo)14天后茜素紅染色結(jié)果圖；

圖4是人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體細胞活性雙熒光染色結(jié)果；

圖5是實施例4的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體和對比實施例1的打印體植入6周后取出大體觀察圖；其中a為對比實施例1的打印體，b為實施例4的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體；

圖6是實施例4的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體的microct檢測結(jié)果圖；

圖7是實施例4的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體的he染色結(jié)果，a是放大20倍的結(jié)果圖，b是放大40倍的結(jié)果圖；

圖8是實施例4的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體的馬松三色法染色結(jié)果圖，a是放大20倍的結(jié)果圖，b是放大40倍的結(jié)果圖；

圖9是實施例4的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體的骨鈣蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果圖；a是放大20倍的結(jié)果圖，b是放大40倍的結(jié)果圖。

具體實施方式

本發(fā)明所述的用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物，其包含人脂肪間充質(zhì)干細胞、海藻酸鈉、明膠干粉以及作為溶劑的生理鹽水的混合物。

本發(fā)明中采用海藻酸鈉-明膠混合物微打印基質(zhì)，此類凝膠類材料具有可塑性，可通過擠壓方式成型，并可通過溫度和交聯(lián)劑控制其交聯(lián)過程，符合細胞共混物三維生物打印的低溫打印過程的工藝要求和生物學(xué)要求。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的混合物中，海藻酸鈉的濃度為15-25g/l，明膠的濃度為75-85g/l,人脂肪間充質(zhì)干細胞密度為0.5×10⁶-2×10⁶個/ml。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的混合物中海藻酸鈉的濃度為20g/l，明膠的濃度為80g/l,人脂肪間充質(zhì)干細胞密度為1×10⁶個/ml。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞是將購買的人脂肪間充質(zhì)干細胞中加入增值培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)后收集的第四代種子細胞。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的增殖培養(yǎng)基為dmem+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素。

一種利用本發(fā)明所述的用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物三維生物打印人體骨組織的方法，該方法包括：

傳代培養(yǎng)：將人脂肪間充質(zhì)干細胞置于增值培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)；

制備人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物：將海藻酸鈉與明膠干粉分別用生理鹽水溶解，混合后制成混合溶膠，上述傳代培養(yǎng)后的第四代人脂肪間充質(zhì)干細胞加入到混合溶膠中，攪拌均勻后得到人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物；

設(shè)計打印物形狀：參照傳統(tǒng)組織工程學(xué)支架結(jié)構(gòu)將打印體設(shè)計為多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；可以保證打印物有一定的結(jié)構(gòu)強度，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)本身的空隙大小，又可保證打印體內(nèi)部細胞有營養(yǎng)供給的通道；

三維打印成型：將上述人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物置于三維生物打印機的料盒中，打印成預(yù)先設(shè)計好的結(jié)構(gòu)，得到打印成型的組織結(jié)構(gòu)；

交聯(lián)處理：將上述打印成型的組織結(jié)構(gòu)用cacl2和kcl2的混合溶液對其進行交聯(lián)，得到打印人體骨組織。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的方法還包括對傳代培養(yǎng)后的第四代人脂肪間充質(zhì)干細胞成骨分化能力的鑒定：待第四代人脂肪間充質(zhì)干細胞生長至70%-80%匯合后接種至六孔板，加入成骨培養(yǎng)基，成骨誘導(dǎo)7天后，進行堿性磷酸酶染色，以細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)藍紫色判斷為陽性；成骨誘導(dǎo)14天后，進行茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色，pbs沖洗細胞三次，體積分數(shù)為95%冰乙醇固定30分鐘；蒸餾水沖洗3次，每孔加1ml茜素紅染液，常溫放置，染色20-30分鐘；染色結(jié)束后洗去染液，蒸餾水沖洗，以細胞間質(zhì)出現(xiàn)紅染結(jié)節(jié)判斷為陽性。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的成骨培養(yǎng)基為dmem+10%胎牛血清+1青、鏈霉素+10mmol/lβ-磷酸甘油+200mmol/l抗壞血酸+100nmol地塞米松。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的制備人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物具體步驟為：將購買的人脂肪間充質(zhì)干細胞加入增值培養(yǎng)基中，置于體積分數(shù)5%的co2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至6-8天，細胞生長至70%-80%匯合狀態(tài)后，進行細胞傳代，每個培養(yǎng)皿中的細胞依次經(jīng)過胰酶消化、中和、離心和重懸后，接種至3個培養(yǎng)皿中，6-7天匯合度達到80%-90%后，再次進行傳代；傳代兩次后的標記為p4，作為種子細胞待用。

作為進一步的方案，本發(fā)明所述的三維打印成型過程中，具體參數(shù)如下：打印溫度15℃，打印噴頭直徑250μm，打印微絲直徑200μm，微絲中心間距400μm；打印時打印噴頭運動，將噴出的共混合物拉成絲狀，沉積到載有無菌細胞培養(yǎng)皿的平臺上，逐層完成打印。

以下是本發(fā)明具體的實施例，在下述實施例中所用到的儀器和試劑如下；

主要儀器：bioplotter三維生物打印機夠自得過envision公司，inveon微型ct(microct)及inveonacquisitionworkplace軟件鉤子得過siemens公司，激光共聚焦顯微鏡及imageproplus6.0軟件夠自得過carlzein公司；

主要試劑：dascs細胞株夠自美國sciencell公司，海藻酸鈉、明膠、無水cacl2、成骨誘導(dǎo)因子貝塔-磷酸甘油、抗壞血酸、地塞米松、茜素紅、乙二胺四乙酸均購自美國sigma公司，杜爾伯科改良伊戈爾培養(yǎng)基、10%（體積分數(shù)）胎牛血清、1%（體積分數(shù)）細胞培養(yǎng)用青、鏈霉素混合液均購自美國gibco公司，鈣黃素-am(calcein-am，cam)、碘化丙啶均購自日本dojindo公司，兔源osteocalcin抗體購自美國santacruzbiotechnology公司，抗兔熒光二抗、抗兔源熒光二抗購自美國cellsignalingtechnology公司，堿性磷酸酶染色試劑盒購自中國康為世紀公司，裸鼠購自中國維通利華公司。

實施例1

一種用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物，其包含人脂肪間充質(zhì)干細胞、海藻酸鈉、明膠干粉以及作為溶劑的生理鹽水的混合物；其中海藻酸鈉的濃度為15g/l，明膠的濃度為85g/l,人脂肪間充質(zhì)干細胞密度為0.5×10⁶個/ml。

實施例2

一種用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物，其包含人脂肪間充質(zhì)干細胞、海藻酸鈉、明膠干粉以及作為溶劑的生理鹽水的混合物；其中海藻酸鈉的濃度為20g/l，明膠的濃度為80g/l,人脂肪間充質(zhì)干細胞密度為1×10⁶個/ml。

實施例3

一種用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物，其包含人脂肪間充質(zhì)干細胞、海藻酸鈉、明膠干粉以及作為溶劑的生理鹽水的混合物；其中海藻酸鈉的濃度為25g/l，明膠的濃度為75g/l,人脂肪間充質(zhì)干細胞密度為2×10⁶個/ml。

實施例4

利用本發(fā)明所述的用于三維生物打印的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物三維生物打印人體骨組織的方法，該方法包括

傳代培養(yǎng)：將p2代dascs加入增值培養(yǎng)基，成分為dmem+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素，置于5%（體積分數(shù)）co2，37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至7天左右，細胞生長至70%-80%匯合狀態(tài)后，進行細胞傳代，每個培養(yǎng)皿中的細胞經(jīng)過胰酶消化、中和、離心和重懸后，接種至3個培養(yǎng)皿中，6-7天匯合度達到80%-90%后，再次進行傳代；傳代兩次后的dascs標記為p4，作為實驗所需種子細胞；

制備人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物：按照實施例2的配比用生理鹽水分別溶解海藻酸鈉、明膠干粉，配置20g/l海藻酸鈉和80g/l明膠混合溶膠，收集前面培養(yǎng)的p4代dascs細胞離心，用培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，確認細胞存貨率大于90%后，漿細胞懸液與海藻酸鈉-明膠水溶膠混合，輕柔攪拌，制備dascs細胞密度為1×10⁶個/ml的共混合物；

設(shè)計打印物形狀：參照傳統(tǒng)組織工程學(xué)支架結(jié)構(gòu)將打印體設(shè)計為多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；可以保證打印物有一定的結(jié)構(gòu)強度，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)本身的空隙大小，又可保證打印體內(nèi)部細胞有營養(yǎng)供給的通道；

三維打印成型：將上述共混物置于bioplotter三維生物打印機的料盒中，與打印噴頭相連，設(shè)定主要打印參數(shù)如下：打印溫度15℃，打印噴頭直徑250μm，打印微絲直徑200μm，微絲中心間距400μm；打印設(shè)備配套軟件系統(tǒng)根據(jù)上述設(shè)定參數(shù)自動生成打印結(jié)構(gòu)，驅(qū)動打印噴頭運動，將噴出的共混合物拉成絲狀，沉積到載有無菌細胞培養(yǎng)皿的平臺上，逐層完成打?。坏玫酱蛴〕尚偷慕M織結(jié)構(gòu)；

交聯(lián)處理：上述打印成型的組織結(jié)構(gòu)用使用100mmkl/lcacl2和50mmol/lkcl2的混合溶液進行5分鐘交聯(lián)處理；得到人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體，打印體在顯微鏡下的結(jié)構(gòu)圖參見圖1。

對比實施例1

按照實施例4的方法和參數(shù)，僅采用海藻酸鈉-明膠的作為打印基質(zhì)作為與實施例4的對比實施例1。

效果檢驗

1.人脂肪間充質(zhì)干細胞成骨分化能力鑒定

將p4代dascs生長至70%-80%匯合后接種至六孔板，加入成骨培養(yǎng)基，成分為dmem+10%胎牛血清+1青、鏈霉素+10mmol/l貝塔=磷酸甘油+200mmol/l抗壞血酸+100nmol地塞米松;成骨誘導(dǎo)7天后，進行堿性磷酸酶染色，染色后采用成品試劑盒，步驟按照商品說明書完成，以細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)藍紫色判斷為陽性（參見圖2）；成骨誘導(dǎo)14天后，進行茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色，pbs沖洗細胞三次，95%（體積分數(shù)）冰乙醇固定30分鐘；蒸餾水沖洗3次，每孔加1ml茜素紅染液，常溫放置，染色20到30分鐘；染色結(jié)束后洗去染液，蒸餾水沖洗，以細胞間質(zhì)出現(xiàn)紅染結(jié)節(jié)判斷為陽性（參見圖3）。

2.共混合物三維生物打印得到的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體活性檢測

將實施例4所得到的人脂肪間充質(zhì)干細胞共混物打印體置于增殖培養(yǎng)基中，體外培養(yǎng)24小時，生理鹽水漂洗3次，使用含5微摩爾每升cam和3微摩爾每升pi的生理鹽水在細胞培養(yǎng)箱中孵育45分鐘，生理鹽水漂洗3次，使用激光共聚焦顯微鏡分別在488nm（cam激發(fā)波長）和543nm（pi激發(fā)波長）的激發(fā)光下觀察打印體內(nèi)細胞的活性，沿z軸每隔20微米對打印體進行拍照。每個打印體任意選取5個激光共聚焦掃描層面圖像，用imageproplus6.0軟件對圖像中綠色、紅色點的個數(shù)進行計數(shù)（紅色光點代表死細胞，綠色光點代表活細胞），計算細胞成活率，細胞成活率=活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）×100%。結(jié)果參見圖4。

圖4的結(jié)果表明：打印24小時后，激光共聚焦顯微鏡觀察可見，dascs共混物打印體內(nèi)細胞均勻分布，大部分細胞呈綠的熒光染色，少量死細胞染成紅色；用imageproplus6。0軟件對活細胞、死細胞進行計數(shù)后，計算出細胞存活率為89%±2%。

應(yīng)用實施例1

分別將實施例4和對比實施例1的打印體植入裸鼠皮下，體植入六周后，可見裸鼠皮下植入?yún)^(qū)域呈現(xiàn)包狀隆起；處死裸鼠后取材，可見實施例4的打印體基本保持原有大小，強度變大，韌性增強，除去表面軟組織可見打印體中有血管長入；而對比實施例1的打印體呈白色團塊不定形樣，打印體部分降解，強度仍保持凝膠態(tài)，不能成形（參見圖5）；microct觀察可見，實驗組打印體密度較高（附圖6），新生骨體積為18%，而對照組打印體結(jié)構(gòu)松散不定形，并且固定后發(fā)生吸水情況，進行microct檢測時因其密度較低而無法正常顯影。

應(yīng)用實施例2

分別將實施例4和對比實施例1的打印體用he染色后植入裸鼠皮下，體植入六周后，取出，組織切片he（伊紅染色法））染色，可見實施例4的打印體孔隙中出現(xiàn)粉染的新生骨基質(zhì)，深染的基質(zhì)材料則出現(xiàn)了部分的吸收（參見圖7），對比實施例1的打印體中基質(zhì)材料的染色與實驗組類似，但無骨基質(zhì)形成。

應(yīng)用實施例3

分別將實施例4和對比實施例1的打印體馬松三色法染色后植入裸鼠皮下，體植入六周后，組織切片馬松三色法染色可見，實施例4的打印體孔隙中可見綠染的新生骨基質(zhì)，深染微水凝膠材料（參見圖8），對比實施例1的打印體中僅可見深染的水凝膠材料。

應(yīng)用實施例4

分別將實施例4和對比實施例1的打印體采用免疫組織化學(xué)染色后植入裸鼠皮下，體植入六周后，取出，組織切片免疫組織化學(xué)染色可見，實施例4的打印體孔隙中的新生骨骨組織周圍有深棕色染色的骨鈣蛋白分布，顯示有新生骨形成（參見圖9）。

上述實施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護的范圍。