本發(fā)明涉及干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是指一種人間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的制備方法。
背景技術(shù)：
：至今世界上用于人體疾患治療和美容的干細(xì)胞主要為造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，后者主要來源于胎盤/臍帶、骨髓和脂肪組織。間充質(zhì)干細(xì)胞最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞憑借其高度的自我更新和多向分化潛能，易于分離培養(yǎng)和擴(kuò)增，無致瘤性及倫理道德問題，易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)，易于獲得、移植且可避免排斥反應(yīng)等諸多優(yōu)勢，逐漸成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)，并具有重要的研究和應(yīng)用前景，特別在細(xì)胞治療和基因治療中有重要的臨床應(yīng)用價值。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外能夠大量擴(kuò)增，在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下，可分化為皮膚、脂肪、毛發(fā)、骨骼、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝臟、心肌和內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞。從而可用來喚醒休眠的內(nèi)源性干細(xì)胞和功能細(xì)胞，修復(fù)受損的細(xì)胞，替換衰老的細(xì)胞和增補(bǔ)死亡和缺失的細(xì)胞。連續(xù)不斷地傳代培養(yǎng)可導(dǎo)致干細(xì)胞發(fā)生不同程度的分化和老化，降低他們的優(yōu)勢，這些弱點(diǎn)已構(gòu)成了大規(guī)模生產(chǎn)、保存和臨床使用的重大挑戰(zhàn)。其二，間充質(zhì)干細(xì)胞可以合成和分泌大量的細(xì)胞因子如細(xì)胞生長因子，血管誘導(dǎo)因子，免疫調(diào)節(jié)因子，炎性損傷因子等，從而來重塑皮膚的質(zhì)地和外觀，增強(qiáng)肌力和體力，恢復(fù)智力和記憶，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和功能。同樣，衰老的間充質(zhì)干細(xì)胞不但增殖分化能力下降，而且也會引起不同程度的副反應(yīng)如炎癥反應(yīng)、促瘤生長、易發(fā)生凋亡等。為了發(fā)揚(yáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)勢和避免其可能的劣勢，我們通常采用低傳代的間充質(zhì)干細(xì)胞來作為應(yīng)用的對象，絕對避免使用衰老和病變的干細(xì)胞。大量的研究表明這些低傳代的成體干細(xì)胞可用于抗衰老、治未病、防止和修復(fù)病變引起的組織器官損傷。近年來干細(xì)胞在美容整形等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛：自體間充質(zhì)干細(xì)胞在美容中最早應(yīng)用在整形外科中，如用于去疤痕、填皺紋、增膚質(zhì)、祛色斑、修損傷、抗衰老和豐胸等，它已成為應(yīng)用較多的一種干細(xì)胞美容技術(shù)。而傳統(tǒng)上所謂的干細(xì)胞美容術(shù)，一般都是直接注射干細(xì)胞針劑。這種注射用干細(xì)胞的來源主要是異體的胎盤/臍帶或自體的脂肪/皮膚干細(xì)胞，但是這些干細(xì)胞的獲取純化、培養(yǎng)擴(kuò)增、凍存運(yùn)輸和注射應(yīng)用都需要一系列昂貴的儀器設(shè)備、苛刻的GMP潔凈條件和熟練的專業(yè)技術(shù)人員。此外，操作流程和工藝非常復(fù)雜，不宜長期保存和快速運(yùn)輸，這就大大阻礙了干細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化和相關(guān)產(chǎn)品的推廣和使用。目前怎樣高效地凍存、干燥和復(fù)蘇大量的間充質(zhì)干細(xì)胞也面臨著許多技術(shù)問題。如常規(guī)細(xì)胞凍存液含有DMSO和異種血清，對細(xì)胞有毒，可引起過敏和可能排斥反應(yīng)，不利于干細(xì)胞在美容和醫(yī)療等方面的推廣應(yīng)用。其二鮮活的干細(xì)胞由于操作復(fù)雜、數(shù)量小，耗時長，運(yùn)送使用受限，也不利于干細(xì)胞在美容和醫(yī)療等方面的推廣應(yīng)用。再者常規(guī)的含血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液易引起細(xì)胞的分化和老化，不能保障大規(guī)模干細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量，也不利于干細(xì)胞在美容和醫(yī)療等方面的推廣應(yīng)用。最后，怎樣復(fù)活冷凍的干細(xì)胞和保持其內(nèi)在的活性成分也是急需解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提出一種人間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞冷凍技術(shù)存在的細(xì)胞毒副效應(yīng)、異源血清可能導(dǎo)致過敏和排斥反應(yīng)、冷凍后無活的干細(xì)胞以及干細(xì)胞中的活性成分不能完好保留的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種人間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的制備方法，包括以下步驟：1)收集：收集傳代數(shù)為2～8代之間的優(yōu)質(zhì)人間充質(zhì)干細(xì)胞；2)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：用無血清的培養(yǎng)基擴(kuò)增和傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞；3)間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存：使用細(xì)胞凍存保護(hù)液將傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞冷凍至-80度；4)凍干粉的制備：將步驟3)中處理后的人間充質(zhì)干細(xì)胞制備成凍干粉；5)添加復(fù)活液：向步驟4)制備的凍干粉中添加復(fù)活液。優(yōu)選的，步驟3)中所述細(xì)胞凍存保護(hù)液包含活性成分物質(zhì)及含量如下：海藻糖0.1-10.0g/100ml，右旋糖酐0.1-20.0g/100ml，多聚精氨酸0.1-10mg/100ml，甘露醇0.1-5.0g/100ml，羥乙基淀粉0.1-5.0g/100ml，泊洛沙姆(P188)0.1-5.0g/100ml，丙三醇0.1-10.0g/100ml，蔗糖0.1-5.0g/100ml(0.25mol/L)，聚乙烯吡咯烷酮0.1-5.0g/100ml，其余為注射用水和無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。海藻糖是由兩個葡萄糖分子以a，a，1，1-糖苷鍵構(gòu)成非還原性糖，自身性質(zhì)非常穩(wěn)定，海藻糖對生物體具有神奇的保護(hù)作用，是因為海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓、干燥失水、強(qiáng)紫外線輻射等惡劣環(huán)境條件下在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。它作為新一代的超級保濕因子成為化妝品市場消費(fèi)的一個熱點(diǎn)。它可以降低溶液中蛋白質(zhì)的水化作用，干燥時則能取代水或作為玻璃樣穩(wěn)定劑。右旋糖酐系蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌-1226(Leuconostocmesenteroides)發(fā)酵合成的一種高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血漿代用品之一。臨床上常用的有中分子右旋糖酐(Dextran70，平均分子量6萬-8萬，美國Baxter公司)，主要用作血漿代用品，用于出血性休克、創(chuàng)傷性休克及燒傷性休克等。多聚精氨酸有4-9個精氨酸組成，是一種具有細(xì)胞膜穿透能力的小分子多肽，可有效攜帶比其分子質(zhì)量大數(shù)十倍的外源性疏水大分子進(jìn)入細(xì)胞，并對宿主細(xì)胞沒有顯著毒副作用。丙三醇和甘露醇可用來保證凍干過程的順利進(jìn)行和調(diào)節(jié)滲透壓，這些保護(hù)基上的羥基能替代蛋白質(zhì)表面的水的羥基，使蛋白質(zhì)表面形成一層假定的水化膜，這樣可保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。很多糖類如蔗糖和多元醇被用于溶液凍融和凍干過程中非特定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑，它們既是有效的低溫保護(hù)劑又是很好的凍干保護(hù)劑。泊洛沙姆188(Poloxamer188)是聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物的非專利名，平均分子量：7680～9510，可作為一種高分子藥用輔料，為非離子型表面活性劑，具有較佳的乳化能力和安全性，5％的泊洛沙姆188可有效改善固體脂質(zhì)納米粒的吸收，從而提高其口服生物利用度。P188穩(wěn)定由于多種原因引起的細(xì)胞膜缺陷。還具有對抗氧化的應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用。中羥乙基淀粉的平均分子量為70,000-80,000道爾頓。適應(yīng)癥為血容量補(bǔ)充藥。并增加細(xì)胞膜負(fù)電荷，使已聚集的細(xì)胞解聚，降低全身血粘度，抑制血管內(nèi)紅細(xì)胞聚集作用，用于改善微循環(huán)障礙，臨床用于低血容量性休克，如失血性、燒傷性及手術(shù)中休克等；血栓閉塞性疾患。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)簡稱PVP，是一種非離子型高分子化合物，分子量：MW：58000，不參與人體新陳代謝，又具有優(yōu)良的生物相容性，對皮膚、粘膜、眼等不形成任何刺激。從生物學(xué)的觀點(diǎn)來看，PVP的分子結(jié)構(gòu)特色類似于用簡單的蛋白質(zhì)模型的那種結(jié)構(gòu)，在快速冷凍和復(fù)蘇過程中能更有效地保護(hù)細(xì)胞。優(yōu)選的，步驟5)中所述復(fù)活液包含活性成分物質(zhì)及含量如下：海藻糖0.1-10.0g/100ml，丙三醇0.1-8g/100ml，泊洛沙姆(P188)0.1-5.0g/100ml，維生素C0.01-0.1g/100ml，注射用水與凍干前的水含量相等。優(yōu)選的，步驟2)中所述無血清的培養(yǎng)基采用申請?zhí)枮镃N2017100038074的培養(yǎng)基。優(yōu)選的，步驟4)凍干粉的制備方法：a、在100級安全柜和GMP細(xì)胞培養(yǎng)間中消化、離心和清洗低傳代數(shù)的人間充質(zhì)干細(xì)胞；b、在100級安全柜中打開離心管，用無菌槍頭吸出離心管中的清洗液，在0.75ml的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.25ml的特殊無DMSO和血清的凍存保護(hù)液，混勻移至一無菌的收集管中平衡20min，然后-80度直接凍存；c、將-80℃凍存的干細(xì)胞保存液抽真空，升華干燥，除去冰晶，最后制得凍干粉，4℃保存。優(yōu)選的，所述無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM和F12按溶液體積比1∶1的比例混合均勻而成。本發(fā)明的有益效果：1)本發(fā)明的冷凍保護(hù)液，不含對細(xì)胞有毒副作用的DMSO，也不含有可能引起免疫反應(yīng)的異種血清和蛋白。采用海藻糖、蔗糖和右旋糖酐等調(diào)節(jié)滲透壓防止對細(xì)胞膜的破壞；用泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮保護(hù)細(xì)胞膜和有關(guān)的蛋白質(zhì)，用多聚精氨酸和丙三醇利于細(xì)胞內(nèi)水分子的通透和避免冰晶的形成。2)本發(fā)明的冷凍復(fù)活液和高效的復(fù)活技術(shù)，由雙蒸水、海藻糖、透明質(zhì)酸、P188和維生素C組成，采用二步復(fù)活法，現(xiàn)用冷凍前干細(xì)胞凍存液總體積的三分之一的復(fù)活液快速溶解2分鐘，繼而再將另三分之二的復(fù)活液加入，將細(xì)胞外高滲恢復(fù)到等滲狀態(tài)，從而避免細(xì)胞水化而引起的突然腫脹，保證細(xì)胞的高效復(fù)活。3)本發(fā)明的干細(xì)胞冷凍保護(hù)液和復(fù)活液，能最大程度地防止干細(xì)胞在冷凍干燥和復(fù)蘇過程中多種原因造成的細(xì)胞損傷和死亡，從而能保持干細(xì)胞的存活，進(jìn)行正常的生理代謝和各種功能，同時也最大程度地保存了各種細(xì)胞因子的活性，有利于干細(xì)胞凍干粉用于美容抗衰老等大健康領(lǐng)域。4)本發(fā)明的干細(xì)胞冷凍保護(hù)液和復(fù)活液體系成分簡單清晰，無批次之間的差異，重復(fù)性好；可高效地獲得大量優(yōu)質(zhì)的人間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉，最大程度保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞的活性；防止了冷凍干燥和復(fù)蘇過程中干細(xì)胞的損傷和死亡，確保了間充質(zhì)干細(xì)胞凍干前后生物學(xué)特性保持不變；為細(xì)胞治療和美容提供高純度和高活力的干細(xì)胞建立了實(shí)用的技術(shù)平臺。5)本發(fā)明的干細(xì)胞冷凍保護(hù)液和復(fù)活液中的一些成分本身就是皮膚美容和抗衰老的有效成分，如海藻糖和透明質(zhì)酸可保濕防紫外、維生素C可美白，聚乙烯吡咯烷酮可保護(hù)皮膚。這樣有助于干細(xì)胞凍干粉更有效地用于美容抗衰老。6)本發(fā)明采用了培養(yǎng)體系(CN2017100038074)，用于體外大規(guī)模培養(yǎng)人間充間質(zhì)干細(xì)胞，這種培養(yǎng)基不含動物來源的血清，因此可以控制感染風(fēng)險，具有改善細(xì)胞的生理代謝和增殖生長潛能和防止干細(xì)胞分化和衰老的功效。7)本發(fā)明所制備的凍干粉有效地保存了人間充質(zhì)干細(xì)胞中的各種具有生物活性的細(xì)胞因子、細(xì)胞膜成分、多種酶和核酸，可以有效地解決干細(xì)胞活性成分保存期有限這一瓶頸，為人間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了堅實(shí)的技術(shù)保障。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明原代和第8代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在我們研發(fā)的無血清無分化擴(kuò)增培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)；圖2為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍干粉，每管1ml干細(xì)胞凍干保護(hù)液，含有2百萬間充質(zhì)干細(xì)胞；圖3為凍干粉狀的間充質(zhì)干細(xì)胞在不同復(fù)活液作用后的形態(tài)表現(xiàn)，只有本發(fā)明公開的復(fù)活也具有一定的復(fù)活干細(xì)胞的效果，注射用水和生理鹽水都不能有效復(fù)活動感后的干細(xì)胞；圖4為流式細(xì)胞儀檢測復(fù)蘇傳代后的細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示凍干前后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物無任何差異。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例一一種人間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的制備方法，包括以下步驟：1)收集：收集傳代數(shù)為2～8代之間的優(yōu)質(zhì)人間充質(zhì)干細(xì)胞；2)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：用無血清的培養(yǎng)基擴(kuò)增和傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞；所述無血清的培養(yǎng)基采用申請?zhí)枮镃N2017100038074的培養(yǎng)基；3)間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存：使用細(xì)胞凍存保護(hù)液將傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞冷凍至-80度；所述細(xì)胞凍存保護(hù)液包含活性成分物質(zhì)及含量如下：序號活性成分含量(％)1海藻糖0.1g/100ml2右旋糖酐0.1g/100ml3多聚精氨酸0.1mg/100ml4甘露醇0.1g/100ml5羥乙基淀粉0.1g/100ml6泊洛沙姆(P188)0.1g/100ml7丙三醇0.1g/100ml8蔗糖0.1g/100ml(0.25mol/L)9聚乙烯吡咯烷酮0.1g/100ml其余為注射用水和無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM和F12按溶液體積比1∶1的比例混合均勻而成；4)凍干粉的制備：將步驟3)中處理后的人間充質(zhì)干細(xì)胞制備成凍干粉；凍干粉的制備方法：a、在100級安全柜和GMP細(xì)胞培養(yǎng)間中消化、離心和清洗低傳代數(shù)的人間充質(zhì)干細(xì)胞；b、在100級安全柜中打開離心管，用無菌槍頭吸出離心管中的清洗液，在0.75ml的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.25ml的特殊無DMSO和血清的凍存保護(hù)液，混勻移至一無菌的收集管中平衡20min，然后-80度直接凍存；c、將-80℃凍存的干細(xì)胞保存液抽真空，升華干燥，除去冰晶，最后制得凍干粉，4℃保存；5)添加復(fù)活液：向步驟4)制備的凍干粉中添加復(fù)活液，間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的復(fù)活液可使凍干粉中60％以上的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)活，復(fù)蘇后的含有活細(xì)胞的液體可以直接用于機(jī)體，此凍存保護(hù)液的成分如下：海藻糖0.1g/100ml，丙三醇0.1g/100ml，泊洛沙姆(P188)0.1g/100ml，維生素C0.01g/100ml，注射用水與凍干前的水含量相等。復(fù)活液的配制：取80ml的注射用水，加入海藻糖0.1克、丙三醇O.1克、泊洛沙姆0.1克、維生素C10.01克，充分混勻后以0.22um濾膜的濾器過濾，最后用注射用水補(bǔ)齊到100ml即可，作為冷凍間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)活液于4度冰箱待用。實(shí)施例二一種人間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的制備方法，包括以下步驟：1)收集：收集傳代數(shù)為2～8代之間的優(yōu)質(zhì)人間充質(zhì)干細(xì)胞；2)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：用無血清的培養(yǎng)基擴(kuò)增和傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞；所述無血清的培養(yǎng)基采用申請?zhí)枮镃N2017100038074的培養(yǎng)基；3)間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存：使用細(xì)胞凍存保護(hù)液將傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞冷凍至-80度；所述細(xì)胞凍存保護(hù)液包含活性成分物質(zhì)及含量如下：序號活性成分含量(％)1海藻糖9g/100ml2右旋糖酐15g/100ml3多聚精氨酸5mg/100ml4甘露醇5g/100ml5羥乙基淀粉5g/100ml6泊洛沙姆(P188)3g/100ml7丙三醇4g/100ml8蔗糖5g/100ml(0.25mol/L)9聚乙烯吡咯烷酮5g/100ml其余為注射用水和無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM和F12按溶液體積比1∶1的比例混合均勻而成；4)凍干粉的制備：將步驟3)中處理后的人間充質(zhì)干細(xì)胞制備成凍干粉；凍干粉的制備方法：a、在100級安全柜和GMP細(xì)胞培養(yǎng)間中消化、離心和清洗低傳代數(shù)的人間充質(zhì)干細(xì)胞；b、在100級安全柜中打開離心管，用無菌槍頭吸出離心管中的清洗液，在0.75ml的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.25ml的特殊無DMSO和血清的凍存保護(hù)液，混勻移至一無菌的收集管中平衡20min，然后-80度直接凍存；c、將-80℃凍存的干細(xì)胞保存液抽真空，升華干燥，除去冰晶，最后制得凍干粉，4℃保存；5)添加復(fù)活液：向步驟4)制備的凍干粉中添加復(fù)活液，間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的復(fù)活液可使凍干粉中60％以上的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)活，復(fù)蘇后的含有活細(xì)胞的液體可以直接用于機(jī)體，此凍存保護(hù)液的成分如下：海藻糖2g/100ml，丙三醇2g/100ml，泊洛沙姆(P188)2g/100ml，維生素C0.01g/100ml，注射用水與凍干前的水含量相等。復(fù)活液的配制：取80ml的注射用水，加入海藻糖2克、丙三醇2克、泊洛沙姆2克、維生素C0.01g克，充分混勻后以0.22um濾膜的濾器過濾，最后用注射用水補(bǔ)齊到100ml即可，作為冷凍間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)活液于4度冰箱待用。實(shí)施例三一種人間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的制備方法，包括以下步驟：1)收集：收集傳代數(shù)為2～8代之間的優(yōu)質(zhì)人間充質(zhì)干細(xì)胞；2)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：用無血清的培養(yǎng)基擴(kuò)增和傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞；所述無血清的培養(yǎng)基采用申請?zhí)枮镃N2017100038074的培養(yǎng)基；3)間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存：使用細(xì)胞凍存保護(hù)液將傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞冷凍至-80度；所述細(xì)胞凍存保護(hù)液包含活性成分物質(zhì)及含量如下：其余為注射用水和無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM和F12按溶液體積比1∶1的比例混合均勻而成；4)凍干粉的制備：將步驟3)中處理后的人間充質(zhì)干細(xì)胞制備成凍干粉；凍干粉的制備方法：a、在100級安全柜和GMP細(xì)胞培養(yǎng)間中消化、離心和清洗低傳代數(shù)的人間充質(zhì)干細(xì)胞；b、在100級安全柜中打開離心管，用無菌槍頭吸出離心管中的清洗液，在0.75ml的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.25ml的特殊無DMSO和血清的凍存保護(hù)液，混勻移至一無菌的收集管中平衡20min，然后-80度直接凍存；c、將-80℃凍存的干細(xì)胞保存液抽真空，升華干燥，除去冰晶，最后制得凍干粉，4℃保存5)添加復(fù)活液：向步驟4)制備的凍干粉中添加復(fù)活液，間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉的復(fù)活液可使凍干粉中60％以上的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)活，復(fù)蘇后的含有活細(xì)胞的液體可以直接用于機(jī)體，此凍存保護(hù)液的成分如下：海藻糖10.0g/100ml，丙三醇8g/100ml，泊洛沙姆(P188)5.0g/100ml，維生素C0.1g/100ml，注射用水與凍干前的水含量相等。復(fù)活液的配制：取80ml的注射用水，加入海藻糖10.0克、丙三醇8克、泊洛沙姆5.0克、維生素C0.1g，充分混勻后以0.22um濾膜的濾器過濾，最后用注射用水補(bǔ)齊到100ml即可，作為冷凍間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)活液于4度冰箱待用。臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)的分離培養(yǎng)。無菌取剖宮產(chǎn)新鮮臍帶約10cm，生理鹽水洗去臍帶殘留血液，剪成2-3cm的小段，再次漂洗，縱行剖開臍帶，剔除1條臍靜脈、兩條臍動脈，剝離華通膠。用眼科剪將華通膠剪碎成1mm3的小組織塊，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入特殊的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基(見專利申請?zhí)朇N2017100038074)、其它成分為100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素和的DMEM/F12培養(yǎng)液，于5％CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長情況：間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)呈梭形、紡錘形，局部可成集落生長。接種培養(yǎng)5-7d左右細(xì)胞形成片狀融合達(dá)90％，呈旋渦狀生長(圖1A)，傳到8代后細(xì)胞生長能力無變化，細(xì)胞在增殖傳代過程中形態(tài)也無明顯變化(圖1B)。說明這種特殊的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基確實(shí)能使間充質(zhì)干細(xì)胞保持無分化良好的擴(kuò)增。待細(xì)胞長至85-90％融合時用胰蛋白酶/EDTA消化液消化制成1X106/ml細(xì)胞懸液，用上述凍存保護(hù)液凍存。UC-MSCs的凍干粉的制備。凍干粉的制備在100級GMP車間中進(jìn)行，收集第4～8代融合度`為85％的UC-MSCs，用胰蛋白酶/EDTA消化液消化細(xì)胞，細(xì)胞變圓剛脫離培養(yǎng)版面時終止消化，用PBS清洗2遍，1000rp/min，離心5min。離心后，取前處理后的200萬UC-MSCs/0.75mlDMEM/F12與保護(hù)液按體積比3∶1混合1份保護(hù)劑終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％聚乙烯毗咯烷酮、10％海藻糖、10％右旋糖酐、6％羥乙基淀粉、6％P188、5％丙三醇、5％蔗糖、5％甘露醇和0.01％多聚精氨酸充分均勻。在冷凍干燥過程干細(xì)胞一般會受到冰晶損傷、溶質(zhì)損傷和干燥脫水損傷。先將間充質(zhì)干細(xì)胞依次在凍干保護(hù)液中平衡后，逐漸恢復(fù)到等滲狀態(tài)，可以減小滲透壓變化對細(xì)胞膜的損傷；即先可在4℃下平衡20min，然后快速置入-80度低溫冰箱冷凍。將上述-80度的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(2×106/ml)以及冷凍保護(hù)液置于-60℃平衡1小時，然后快速裝入凍干機(jī)的干箱內(nèi)，此時凍干機(jī)干箱的溫度控制在-40℃左右(制品凍結(jié)到共晶點(diǎn)以下)，隨后使得凍干機(jī)冷凝筒的溫度迅速達(dá)-50--55℃，對凍干機(jī)干箱抽真空，使其真空度達(dá)10Pa使制品升華干燥，控制擱板溫度在-55--35℃，時間14持續(xù)小時；最后制品解吸干燥，溫度-30-20℃，時間在10小時內(nèi)，真空度低于10Pa，使含水量小于3％，出箱包裝(圖2)。制備出的凍干粉外觀無缺損，表面平整，體積與凍結(jié)時的體積基本相等，顏色均勻一致，溶解度好，澄明度好，穩(wěn)定性好，不易受到污染，保質(zhì)期長。凍干粉狀的UC-MSCs的復(fù)蘇MSCs的凍干及復(fù)蘇：凍干粉3個月后復(fù)蘇細(xì)胞，采用二步復(fù)活法：1)從包裝箱中取出凍干管，現(xiàn)用冷凍前干細(xì)胞凍存液總體積的三分之一的37度復(fù)活液快速溶解1分鐘，將細(xì)胞外高滲恢復(fù)到等滲狀態(tài)，從而避免細(xì)胞水化而引起的突然腫脹，2)繼而再將另三分之二的復(fù)活液加入，直接放入37℃水浴箱中融化，保證細(xì)胞的高效復(fù)活。繼而，用PBS洗滌2遍，取100ul用胎盤蘭染色，統(tǒng)計活細(xì)胞數(shù)。其余的細(xì)胞置入特殊的無血清(CN2017100038074)的DMEM/F12培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到85％匯合度時，消化離心后用流式細(xì)胞儀檢測鑒定。凍存3個月后再復(fù)蘇，鏡下可見細(xì)胞飽滿，邊緣整齊，形態(tài)完整，細(xì)胞成活率為65％～70％(圖3A)。傳代后生長良好，與凍存前基本一致，圖3B顯示細(xì)胞匯合度為90％時的細(xì)胞生長狀態(tài)。相反，用與冷凍干燥前相等的注射用水(圖3C)或醫(yī)用的生理鹽水(圖3D)復(fù)蘇凍干粉狀的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，絕大多數(shù)都死亡，不能存活生長。用流式細(xì)胞儀檢測復(fù)蘇傳代后的細(xì)胞表面標(biāo)志物，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD29-PE、PDGFR，CD90-PE、SCa-1，CD-44PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-PE各10ul，充分混勻，室溫下反應(yīng)30min，每管加入1.5mlPBS，1000rpm/min離心5min，棄上清，每管加入100ulPBS，流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果如圖4，與凍干前的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物無任何差異。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉中細(xì)胞因子的含量人間充質(zhì)干細(xì)胞通過規(guī)模化培養(yǎng)，在數(shù)量上可達(dá)到醫(yī)療美容所需要的水平。ELISA免疫組化試劑盒(R&DSystems公司)檢測結(jié)果顯示凍干前后間充質(zhì)干細(xì)胞合成和分泌的一些細(xì)胞因子沒有明顯差異，主要的如：堿性成纖維生長因子(FGF-b)，胰島素樣的生長因子(IGF-1)，血小板生長因子(PDGF)，角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，表皮細(xì)胞生長因子(EGF)，肝細(xì)胞生長因子(HGF)等，結(jié)果如下表所示每毫升100萬個間充質(zhì)干細(xì)胞在凍干前后所含不同細(xì)胞因子的量。這說明本發(fā)明的冷凍保護(hù)液和復(fù)蘇液不但能夠完好的保護(hù)細(xì)胞，而且能有效地防止蛋白酶的激活和降解細(xì)胞因子，從而使凍干的間充質(zhì)細(xì)胞能夠較長期而更方便的保存，在應(yīng)用上更有利于產(chǎn)業(yè)化和推廣。大量研究表明在功能上，間充質(zhì)干細(xì)胞可提供人體細(xì)胞所需要的各種脂質(zhì)和核酸，它們還含有許多細(xì)胞因子(蛋白質(zhì))。如表皮生長因子能促進(jìn)表皮細(xì)胞新陳代謝，快速代謝老化角質(zhì)，修復(fù)痘印，細(xì)化皺紋，增強(qiáng)自身肌膚的保水及鎖水能力，具有增強(qiáng)肌膚彈性、減少皺紋，防止肌膚衰老和滲透滋養(yǎng)等作用。IGF是人體內(nèi)非常重要的細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)劑，對維持與細(xì)胞分化有關(guān)蛋白質(zhì)水平十分重要，與一些生長因子合用能促進(jìn)細(xì)胞分裂和成熟。IGF-1還參與創(chuàng)傷愈合的過程。實(shí)驗證明，損傷的神經(jīng)、肌肉和肉皮細(xì)胞中IGF-1濃度增加IGF-1還參與創(chuàng)傷愈合的過程。FGF-b促進(jìn)真皮細(xì)胞的增殖、分化，改善細(xì)胞生活微環(huán)境，促進(jìn)受損皮膚的修復(fù)和細(xì)化皺紋，恢復(fù)細(xì)胞活力，內(nèi)源性調(diào)節(jié)膠原蛋白讓皮膚充盈有彈性，煥發(fā)健康光澤，可用于問題性皮膚的深層修復(fù)和除皺。KGF是角質(zhì)細(xì)胞伸張因子，其主要功能有：促進(jìn)表皮角質(zhì)細(xì)胞生長，修復(fù)受損細(xì)胞，加速細(xì)胞的新陳代謝，通過KGF角皮層成纖維修復(fù)因子專一性的角皮修復(fù)后，增加皮膚的免疫力和抵抗力，使肌膚回復(fù)健康，亮白狀態(tài)。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，同時可增加血管通透性使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，使肌膚白里透紅。HGF可以激活Bcl-2基因表達(dá)并抑制Bax蛋白向線粒體膜表面移位，維持線粒體膜內(nèi)外的電化學(xué)梯度、阻止線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c漏出，從而抑制凋之相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的活性，產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用；HGF可以刺激血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶一1以及c-met在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)，并顯著增加ets-1的mRNA表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，從而在新生血管形成過程中發(fā)揮重要作用。NGF主要作用是：1)在機(jī)體發(fā)育過程中促使神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育；2)在機(jī)體成熟后對正常神經(jīng)細(xì)胞有營養(yǎng)保護(hù)作用；3)神經(jīng)損傷(如腦血管意外和腦外傷)后可促使神經(jīng)元再生和功能恢復(fù)；4)提高學(xué)習(xí)和記憶功能。PDGF有下述功能：1)修復(fù)皮膚的微血管系統(tǒng)，為皮膚提供充足營養(yǎng)。皮膚衰老一個重要的原因就是皮下血管萎縮，從而導(dǎo)致皮膚供血不足，故細(xì)胞缺乏營養(yǎng)，致使皺紋的產(chǎn)生。許多生長因子參與血管生成的生理調(diào)節(jié)。它們各自在其中起至關(guān)緊要作用。其中PDGF的再生血管功能對于延緩衰老有明顯療效。2)促進(jìn)膠原蛋白的合成，有效延緩衰老。PDGF可以成功促進(jìn)膠原蛋白的生成。通過PDGF生成的膠原蛋白比直接涂抹或食用膠原蛋白更能有效延緩皮膚衰老。3)PDGF是一種重要的促有絲分裂因子，具有刺激特定細(xì)胞群分裂增殖的能力，促進(jìn)纖維母細(xì)胞的生成，從而使皺紋自然長平。每毫升100萬個間充質(zhì)干細(xì)胞在凍干前后所含不同細(xì)胞因子的量因此，常規(guī)細(xì)胞凍存液含有DMSO和異種血清，對細(xì)胞有毒，可因其過敏和可能排斥反應(yīng)，不利于干細(xì)胞在美容和醫(yī)療等方面的推廣應(yīng)用。其二鮮活的剛獲得干細(xì)胞由于操作復(fù)雜、數(shù)量小，耗時長，運(yùn)送使用受限，也不利于干細(xì)胞在美容和醫(yī)療等方面的推廣應(yīng)用。再者常規(guī)的含血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液易引起細(xì)胞的分化和老化，不能保障大規(guī)模干細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量，也不利于干細(xì)胞在美容和醫(yī)療等方面的推廣應(yīng)用。而本發(fā)明人間充質(zhì)凍干粉的制備方法所制備的凍干粉有效地保存了人間充質(zhì)干細(xì)胞中的各種具有生物活性的細(xì)胞因子和其他細(xì)胞成分，保存期可延長到2年，有效地解決干細(xì)胞產(chǎn)品的數(shù)量、質(zhì)量和保存期有限多種瓶頸，為人間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了堅實(shí)的技術(shù)保障。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3