發(fā)明背景

1.發(fā)明領(lǐng)域

本申請涉及用于預防齲齒的組合物和方法。具體而言，本申請涉及用于提高牙齒的機械強度的含水組合物和方法。

2.相關(guān)技術(shù)描述

齲齒是困擾全世界人和非人動物的最常見的可預防疾病之一。齲齒(蛀牙、齲洞)是由損傷堅硬牙齒結(jié)構(gòu)(例如，釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì))的細菌過程引起的。這些牙結(jié)構(gòu)逐漸分解，從而在牙齒上產(chǎn)生孔(齲齒)。兩組細菌-變形鏈球菌(Streptococcus mutansans)和乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)-在可發(fā)酵碳水化合物例如蔗糖、果糖和葡萄糖存在時產(chǎn)生乳酸，并且是引發(fā)齲齒的主要原因。主要由礦物質(zhì)構(gòu)成的牙齒不斷經(jīng)受牙齒和周圍唾液之間的脫礦和再礦化作用。

羥磷灰石，一種結(jié)晶磷酸鈣，為牙釉質(zhì)表面的主要礦物質(zhì)并且具有通式Ca₅(PO₄)₃(OH)，但通常將它寫作Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂以表示晶胞包括兩種實體。當牙齒表面的pH降至5.5以下時，脫礦比再礦化進行得快(即牙齒表面發(fā)生羥磷灰石的凈損失)。礦物質(zhì)結(jié)構(gòu)的這種損失導致蛀牙。如果不治療，該疾病可導致疼痛、牙齒脫落、感染并且在極端情況下導致死亡。

為了預防齲齒，牙科專家建議每天用去除菌斑的含氟化物的牙粉刷牙至少兩次。氟化物通過與牙釉質(zhì)中的羥磷灰石表面結(jié)合，形成氟磷灰石并使釉質(zhì)更加抗脫礦(因而更加抗腐蝕)來幫助預防齲齒。通常將氟化物添加到城市供水中以預防蛀牙，但最近國家研究理事會(National Research Council)(在國家科學院、國家工程院、醫(yī)學研究所的資助下運作)得出結(jié)論：城市供水中存在的氟化物水平和已知導致毒性效應(yīng)的氟化物水平彼此接近相當危險。

自20世紀中期以來商業(yè)牙膏幾乎沒有創(chuàng)新。所有商業(yè)牙膏中的活性抗齲成分為0.24％氟化鈉(NaF、0.15％w/v氟離子)或0.76％單氟磷酸鈉(Na₂FPO₃、0.14％w/v氟離子)。商業(yè)牙膏市場中最近的創(chuàng)新定位于香料、磨擦劑或漂白劑，而不是抗齲活性。

可可堿(IUPAC名稱：3,7-二甲基-2,3,6,7-四氫-lH-嘌呤-2,6-二酮；也稱為3,7-二甲基黃嘌呤)為白色(或無色)苦味、結(jié)晶性粉末，升華點為290-295℃，熔點為357℃，且分子量為180.16g/mol?？煽蓧A在水中的溶解度為1.0g/2L；在沸水中的溶解度為1.0g/150mL，且在95％乙醇中的溶解度為1.0g/2.2L?？煽蓧A與咖啡堿和茶堿化學上相關(guān)，并且存在于包括巧克力、可可、茶葉和阿薩伊莓果(acai berry)的多種食物中。可可堿、茶堿(1,3-二甲基黃嘌呤)和咖啡堿(1,3,7-三甲基黃嘌呤)的化學結(jié)構(gòu)分別如式I、II和III所給出。

可可堿以約1.5％至約3％的濃度天然存在于可可豆(可可)，并且以約0.7％至約1.2％或約15至約30g/Kg的濃度存在于可可豆的殼中(Winholdz,1983)。雖然是相同化學家族的部分，人們必須區(qū)分可可堿與咖啡堿的刺激作用?？Х葔A作用相對較快，它對人的主要作用是提高精神警覺性；可可堿的作用較為微妙，并且引起比咖啡堿更溫和更持久的情緒高漲。血流中可可堿的血漿半衰期(t_1/2)為6小時，而咖啡堿的血漿半衰期僅為2小時。另一個差別是可可堿為非生理上癮的，長期定期攝入后也不會產(chǎn)生戒斷癥狀，而咖啡堿已被證實為生理上癮的并且與許多已證明的戒斷情況關(guān)聯(lián)。

20世紀80年代進行的兩項獨立研究發(fā)現(xiàn)8個品種的商業(yè)可可粉中可可堿的平均水平為1.89％(Shively&Tarka,1984和Zoumas等人，1980)。表1中示出，商購食品中存在的可可堿的正常水平具有特別的關(guān)聯(lián)性。

來源：Zoumas等人，1980；Blauch&Tarka,1983；Shivley&Tarka,1984；Craig&Nguyen,1984。

*可可堿含量通過HPLC/反相柱色譜法測定

在任何類型的巧克力中，黑巧克力含有最高水平的可可堿/份，但濃度往往在約0.36％和約0.63％之間變化。將其與表1中提及的食品進行比較可得出：1盎司黑巧克力塊含有約130mg可可堿，而1盎司牛奶巧克力塊含有約44mg可可堿。因此，1盎司黑巧克力塊中可可堿的濃度為一杯5盎司熱巧克力的量的大約兩倍。對于143-10磅的人而言，要在其血液中達到可可堿的毒性水平，他們將需要一次性攝入大約86塊1盎司的牛奶巧克力。

可可堿也可作為胺鹽(例如，其乙二胺鹽)或其復鹽(例如，與有機酸的堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如乙酸、葡糖酸、苯甲酸或水楊酸的堿金屬或堿土金屬鹽)分離或產(chǎn)生?？芍苽鋸望}以使可可堿的水溶性更強或制備不溶性復合物。

在1966年，報道了用富含巧克力的膳食喂養(yǎng)的侖鼠齲齒減少。的研究通過與可可粉、脫脂可可粉和可可脂比較調(diào)查了對侖鼠齲齒的影響。當可可粉構(gòu)成侖鼠膳食的20％、10％、5％和2％百分比時，純可可粉分別將齲齒抑制84％、75％、60％和42％。脫脂可可顯示出比含脂可可粉顯著更高的抗齲作用，但單獨的可可油(構(gòu)成侖鼠膳食的15％)顯著增加了齲齒(A."Effect on Hamster Caries by Dialyzed,Detanned or Carbon-treated Water-Extract of Cocoa"Arch Oral BioI.1966；11:609-15.

在隨訪研究中，研究了可可粉的脫脂部分并且證明用水洗滌的可可粉具有比未洗滌的可可粉顯著降低的抗致齲作用。然而，仍在洗滌的可可粉組觀察到顯著的抗齲作用，“表明存在非水溶性的致齲因子”并且暗示“可可中存在兩種齲齒抑制物質(zhì)：一種是水溶性的，且另一種是微溶于水的”(A.,1966)。

后續(xù)研究表明在可可堿存在時在體外生長的磷灰石晶體顯著大于比不存在可可堿時生長的磷灰石晶體(參見，例如，美國專利No.5,919,426和6,183,711，每個專利均以引用方式整體并入本文)。哺乳期大鼠的可可堿攝入與接觸可可堿的哺育期幼鼠的整個第一顆臼齒中羥磷灰石微晶尺寸的增加(更高結(jié)晶度)(與對照相比)，以及抗酸溶解性的提高相關(guān)(見同處)。接觸可可堿的哺育期雌性幼鼠的股骨比性別匹配的對照顯示出更高結(jié)晶度，且更強壯和更堅韌；然而，雄性幼鼠的股骨未顯示出這種關(guān)系(見同處)。

然而，Hall-Petch關(guān)系指示固體材料對永久變形的抗性(例如，其壓痕硬度)隨著粒度的減小而增加。因此，在接觸可可堿后觀察到的羥磷灰石結(jié)晶度提高與Hall-Petch關(guān)系一起表明骨和牙齒對壓痕和永久變形的抗性在接觸可可堿后由于結(jié)晶尺寸較大而應(yīng)該降低。該結(jié)論在最近的工作中得到了支持，證實“當晶粒尺寸從亞微米降至納米時[羥磷灰石]的硬度遵循Hall-Petch關(guān)系”(Wang J.等人"Nanocrystalline hydroxyapatite with simultaneous enhancements in hardness and toughness"Biomaterials.2009；30:6565-72)。另一項研究表明羥磷灰石的“硬度”與粒度幾乎無關(guān)，這表明隨著晶粒尺寸減小硬度幾乎無變化，但表明羥磷灰石的“斷裂韌度”隨著粒度減小而提高(Mazaheri M,等人"Effect of a novel sintering process on mechanical properties of hydroxyapatite ceramics."J.Alloys Compd.2009；471:180-4)。一項成人牙齒和乳牙(乳齒)的研究表明“[當]與成人牙齒相比較時，乳牙釉質(zhì)更薄、更軟、更易于斷裂且具有更大的[羥磷灰石]晶?！?Low IM,等人"Mapping the structure,composition and mechanical properties of human teeth."Mater Sci Eng C Mater BiolApp.2008；28:243-47.)。

由于此類沖突和矛盾的結(jié)果，人們無法推斷已知的特性并且用于預測可靠或準確結(jié)果的羥磷灰石對環(huán)境因素的反應(yīng)無法僅通過評價現(xiàn)有技術(shù)和推測某個結(jié)果來預測。

發(fā)明概述

在一個實施方案中，本公開提供了一種組合物，所述組合物包含分離的可可堿、至少一種鈣源、至少一種磷酸鹽源以及約6.0至約8.5，的pH。至少一種鈣源可選自氯化鈣、碳酸鈣、葡糖酸鈣、磷酸鈣及其組合。至少一種磷酸鹽源可選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸三鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉及其組合。所述組合物可進一步包含至少一種等滲劑。等滲劑可為多元醇。多元醇可選自木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖醇、拉克替醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、甘油及其組合。所述組合物可進一步包含至少一種增稠劑。增稠劑可選自甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素及其組合。所述組合物可進一步包含抗菌劑。抗菌劑可為三氯生(triclosan)、過氧化氫(H₂O₂)、4-羥基苯甲酸甲酯、丁香油、苯扎氯銨或其組合。

在此實施方案的一個方面，提供了用于增強至少一種牙齒的硬度的組合物，其中所述組合物比含有0％至約1.1％氟化鈉或單氟磷酸鈉的牙粉更能增強所述硬度。在相關(guān)方面，所述組合物比含有0％至約0.5％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更能增強所述硬度。在相關(guān)方面，所述組合物比含有0％至約0.25％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更能增強所述硬度。在相關(guān)方面，所述組合物比含有0％至約0.15％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更能增強所述硬度。

在一個實施方案中，本公開提供了治療有需要的哺乳動物的牙齒表面的方法，所述方法包括：提供包含分離的可可堿、可可堿鹽或可可堿復鹽、至少一種鈣源和至少一種磷酸鹽源的組合物，其中所述組合物的pH為約6.0至約8.5；及向所述哺乳動物施用所述組合物。至少一種鈣源可選自氯化鈣、碳酸鈣、葡糖酸鈣、磷酸鈣及其組合。至少一種磷酸鹽源可選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸三鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉及其組合。所述方法的組合物可進一步包含至少一種等滲劑。等滲劑可為多元醇。多元醇可選自木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖醇、拉克替醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、甘油及其組合。所述方法的組合物可進一步包含至少一種增稠劑。增稠劑可選自甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素及其組合。所述組合物可進一步包含抗菌劑、抗微生物劑或其組合?？咕鷦┛蛇x自三氯生、過氧化氫、4-羥基苯甲酸甲酯、丁香油及其組合。

在此實施方案的一個方面，提供了用于治療至少一種牙齒的牙齒表面的組合物，其中所述組合物比含有0％至約1.1％氟化鈉或單氟磷酸鈉的牙粉更好地治療所述牙齒表面。在所述方法的一個方面，組合物比含有0％至約0.5％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更好地治療所述牙齒表面。在所述方法的一個方面，組合物比含有0％至約0.25％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更好地治療所述牙齒表面。在所述方法的一個方面，組合物比含有0％至約0.15％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更好地治療所述牙齒表面。在一個方面，所述牙齒表面經(jīng)劃傷、崩裂、腐蝕、磨損、凹陷、齲齒致?lián)p壞和/或其它外傷致?lián)p傷。

在一個實施方案中，本公開提供了增強至少一種牙齒的壓痕硬度的方法，所述方法包括提供包含分離的可可堿、可可堿鹽或可可堿復鹽、至少一種鈣源和至少一種磷酸鹽源的組合物，其中所述組合物的pH為約6.0至約8.5；及向所述哺乳動物施用所述組合物。至少一種鈣源可選自氯化鈣、碳酸鈣、葡糖酸鈣、磷酸鈣及其組合。至少一種磷酸鹽源可選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸三鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉及其組合。所述方法的可進一步包含至少一種等滲劑。等滲劑可為多元醇。多元醇可選自木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖醇、拉克替醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、甘油及其組合。所述方法的可進一步包含至少一種增稠劑。增稠劑可選自甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素及其組合。所述方法的可進一步包含抗菌劑、抗微生物劑或其組合?？咕鷦┛蛇x自三氯生、過氧化氫、4-羥基苯甲酸甲酯、丁香油及其組合。所述增強可進一步包括沉積新的羥磷灰石和/或磷酸鈣至所述牙齒上。

在此實施方案的一個方面，提供了用于增強至少一種牙齒的壓痕硬度的組合物，其中所述組合物比含有0％至約1.1％氟化鈉或單氟磷酸鈉的牙粉更能增強所述壓痕硬度。在所述方法的一個方面，組合物比含有0％至約0.5％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更能增強所述壓痕硬度。在所述方法的一個方面，組合物比含有0％至約0.25％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更能增強所述壓痕硬度。在所述方法的一個方面，組合物比含有0％至約0.15％氟化鈉或0％至約0.76％單氟磷酸鈉的牙粉更能增強所述壓痕硬度。

附圖簡述

為了進一步理解本申請公開的實質(zhì)、目的和益處，應(yīng)參考以下詳細描述，結(jié)合下附圖進行閱讀，其中相同的附圖標記表示相同的要素。

圖1示出了顯微硬度測試后牙釉質(zhì)的壓痕。虛線表示用于計算努普硬度值(HK)的長對角線的長度(L)。

圖2示出了在不同放大率下對照牙齒的掃描電子顯微照片。

圖3示出了接觸0.15％NaF(750倍放大率)的牙齒的牙釉質(zhì)的壓痕。

圖4示出了接觸0.25％NaF(750倍放大率)的牙齒的牙釉質(zhì)的壓痕。

圖5示出了接觸5mg/L可可堿(750倍放大率)的牙齒的牙釉質(zhì)的壓痕。

圖6示出了接觸10mg/L可可堿(250×5mag.)的牙齒的牙釉質(zhì)的壓痕。

圖7示出了接觸200mg/L可可堿(750倍放大率)的牙齒的牙釉質(zhì)的壓痕。

圖8示出了接觸500mg/L可可堿(250倍放大率)的牙齒的牙釉質(zhì)的壓痕。圖8中的虛線框表示在750倍放大率下的圖9中示出的區(qū)域。

圖9示出了由圖8中虛線方框界定的區(qū)域，并且示出了接觸500mg/L可可堿(750倍放大率)的牙齒的牙釉質(zhì)的壓痕。

圖10為示出不同濃度的NaF和可可堿對顯微硬度影響的條形圖。

圖11為示出不同濃度的NaF和可可堿對顯微硬度影響的半對數(shù)散點圖。

圖12示出了用金剛石劃片劃傷的3種不同的牙齒樣品的3個掃描電子顯微照片。圖12A示出了在對照溶液(人工唾液)中孵育的此種牙齒；圖12B示出了在含有0.25％NaF的溶液中孵育的此種牙齒；且圖12C示出了在含有200mg/L可可堿的溶液中孵育的此種牙齒。

圖13為示出牙齒樣品的維氏顯微硬度的變化的條形圖，所述牙齒樣品經(jīng)歷齲齒模型，然后在人工唾液、0.25％NaF牙膏或200mg/L可可堿中孵育14天。

圖14為示出牙齒樣品的維氏顯微硬度變化的條形圖，所述牙齒樣品經(jīng)歷腐蝕模型，然后在人工唾液、0.25％NaF牙膏或200mg/L可可堿中孵育14天。

發(fā)明詳述

在進一步描述本申請的目的之前，應(yīng)理解本申請不限于以下描述的具體實施方案，因為具體實施方案可進行改變并且仍落在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。還應(yīng)理解使用的術(shù)語是為了描述具體實施方案，而并非旨在限制。相反，本申請的范圍將通過所附權(quán)利要求確定。

在此說明書和所附權(quán)利要求中，除非上下文中另外明確地規(guī)定，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復數(shù)個指示物。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本申請主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的含義相同。

本公開包括用于增強牙齒的機械抗性的可可堿組合物，以及增強牙齒的機械抗性的方法，所述方法包括向有需要的哺乳動物施用本公開的可可堿組合物。

本組合物和方法的可可堿可作為胺鹽(例如，其乙二胺鹽)或其復鹽(例如，與有機酸的堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如乙酸、葡糖酸、苯甲酸或水楊酸的堿金屬或堿土金屬鹽)分離或產(chǎn)生?？芍苽鋸望}以使可可堿水溶性更強或制備不溶性復合物?？煽蓧A的合適的酸加成鹽包括酸加成鹽，包括藥學上可接受的無機鹽，例如硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、氫氯化物和氫溴化物，以及藥學上可接受的有機酸加成鹽，例如乙酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、甲磺酸鹽、α-酮戊二酸鹽、α-甘油磷酸鹽和葡萄糖-1-磷酸鹽。優(yōu)選地，酸加成鹽為鹽酸鹽。國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer)的工作組綜述了甲基黃嘌呤的化學性質(zhì)、物理性質(zhì)、制備、用途、事件、代謝、毒性、分析和致癌性(World Health Organization,Coffee,tea,maté,methylxanthines and methylglyoxal,IARC Monograph on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans,第51卷(1991)。

可可堿組合物的化合物優(yōu)選呈藥學上可接受的形式。藥學上可接受的形式尤其是指藥學上可接受的純度水平，不包括正常的藥物添加劑，例如稀釋劑和載體，并且不包括在正常劑量水平下被視為有毒性的物質(zhì)。藥學上可接受的純度水平通常在至少50％，不包括正常的藥物添加劑，優(yōu)選75％，更優(yōu)選90％，還更優(yōu)選95％。

可可堿濃度可為約0.1至約1000、約0.25至約900、約0.5至約800、約0.5至約700、約0.75至約600、約1至約500、約5至約500、約10至約450、約25至約400、約50至約350、約100至約300、約150至約250、約175至約225，并且優(yōu)選約200mg/L。

因此，本公開提供了包含分離的可可堿或其鹽或復鹽、至少一種鈣源和至少一種磷酸鹽源的可可堿組合物，其中組合物的pH為約5至約10、約5.5至約9.5、約6.0至約9.0、約6.0至約8.5、約6.5至約8.5、約6.8至約8.2、約7.0至約8.0、約7.2至約7.8，并且優(yōu)選約7.4至約7.6。

可可堿組合物經(jīng)配制用于口服或局部口服施用，并且可經(jīng)配制用于活性成分的緩慢或快速釋放。例如，可可堿組合物可以為片劑(包括口腔崩解片)、膠劑(例如，口香糖)、囊劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、可復水的粉劑和液體、凝膠或糊狀制劑例如口服溶液或懸浮液的形式。還預期適當?shù)木植靠诜苿?例如，牙膏、漱口劑、牙線、非處方牙托、覆面帶材、正畸和兒科洞襯劑(varnishes)、牙粘固粉或粘合劑、拋光膏、牙齒漂白劑和齲洞填充材料和樹脂(UV活性和非-UV活性))以及將可可堿組合物摻入食品(例如，焙烤食品、飲料等)和牙髓材料(例如，含有可可堿組合物的杜仲膠等)，其所有可在事先進行或不進行牙齒表面酸蝕處理的情況下使用(參見，例如，以下實施例4)。為了獲得施用一致性，優(yōu)選但非必須地將組合物以單位劑量提供。

制劑可含有常規(guī)賦形劑，例如粘合劑(例如，糖漿例如玉米糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、黃蓍膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(PEG)、蠟和其它脂肪、可可油、可可油替代物、氫化脂、氫化植物油、氫化棉籽油、棕櫚仁油、大豆油、甾烷醇酯(stannol ester)、甘油酯、多元醇酯、親水疏水平衡值從0.5至高于20的聚氧乙烯酯和聚乙二醇、單糖、寡糖(右旋糖、一水右旋糖、乳糖、甘露糖、果糖及其衍生物和混合物)、多糖、樹膠溶液、氫化淀粉水解物、甘油及其混合物；填充劑(例如，二氧化硅、糖、淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、果糖、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、赤蘚醇(erythitol)、木糖醇、甘露醇、麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、右旋糖、麥芽糖、乳糖、微晶纖維素、玉米淀粉、甘氨酸及其混合物)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石、淀粉、二氧化硅及其混合物)；崩解劑(例如，淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥基乙酸淀粉鈉、微晶纖維素及其混合物)；粘合劑(例如，固體形式的聚乙二醇、單酸甘油脂(40-90％植物或動物脂肪的甘油酯)、乙?；膯嗡岣视椭⑺z體(hydrocolloidal gum)、其它乳化劑或脂肪及其混合物)；或藥學上可接受的濕潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。

固體、口服可崩解或可咀嚼口服組合物可通過共混、填充、壓片、浸泡等常規(guī)方法制備，并且可為例如片劑(包括口腔崩解片)、膠劑、囊劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、可復水粉劑、液體、凝膠或糊狀制劑，例如口服溶液或懸浮液，和食品例如薄荷、樹膠、糖果和焙烤食品的形式。重復共混操作可用于使活性劑分散在整個利用大量填充劑的那些組合物中。尤其，可通過使含有載體材料的原料經(jīng)受閃流加工，從而產(chǎn)生剪切成型基質(zhì)或“線”而產(chǎn)生可咀嚼或口服可崩解組合物，如現(xiàn)有技術(shù)所教導。然后可通過常規(guī)技術(shù)將剪切成型基質(zhì)與活性成分(例如，分離的可可堿、鈣源、磷酸鹽源)混合。牙髓治療后(例如，根管治療后)用于封閉牙齒內(nèi)空間的主要材料杜仲膠可用本公開的可可堿組合物浸漬(例如，通過浸泡)。

液體口服制劑可為，例如，乳劑、糖漿、漱口劑(沖洗劑)或酏劑的形式，或可作為干燥產(chǎn)品存在，使用前用水或其它合適的媒介物(例如，如運動飲料)復水。此類液體制劑可含有常規(guī)添加劑例如懸浮劑，例如山梨糖醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠、氫化食用脂；乳化劑，例如卵磷脂、去水山梨糖醇單油酸酯或阿拉伯膠；無水媒介物(其可包括食用油)，例如杏仁油、分餾的椰子油、油性酯例如甘油、丙二醇或乙醇的酯；防腐劑，例如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯或山梨酸；以及常規(guī)調(diào)味劑或著色劑(在需要時)。

局部口服制劑可以例如，軟膏、乳膏、洗液、浸滲敷料(impregnated dressing)、凝膠、凝膠棒、噴霧劑和氣溶膠存在，并且可含有適當?shù)某Ｒ?guī)添加劑例如防腐劑和/或幫助藥物滲透的溶劑以及軟膏和乳膏形式的潤滑藥。制劑可含有相容性常規(guī)載體，例如乳膏或軟膏基質(zhì)和用于洗液的乙醇或油醇。

可可堿組合物和制劑可含有約0.01％至約0.1％、至約1.0％、至約2.5％、至約5％、至約10％、至約20％、至約50％或至約99％(按重量計)，優(yōu)選約0.01％至約0.1％、至約1.0％、至約2.5％、至約5％、至約10％、至約20％或至約50％(按重量計)，并且更優(yōu)選約0.1％至約0.1％、至約1.0％、至約2.5％、至約5％、至約10％、至約20％、至約50％分離的可可堿，這取決于配方。

重要的是注意，固體材料對變形的抗性取決于其在任何方向的微耐久性(microdurability)(小型剪切模量)，并且不取決于任何剛性或剛度性質(zhì)例如其體積模量或楊氏模量(Young's modulus)。觀察者經(jīng)常將剛度和硬度混淆。例如，報道偶爾將材料描述為比金剛石更堅硬，但未能說明材料固體晶胞的各向異性(當在不同方向測量時，測量屬性的不同值)。這種疏忽導致報道的材料傾向于在其它維度以鱗狀或針狀方式層裂和剝落(例如，鋨比金剛石堅韌，但與石英一樣堅硬)。

Hall-Petch關(guān)系描述了固體材料的粒度與其抗永久變形(例如，其壓痕硬度)之間的關(guān)系，并且預測屈服強度隨著粒度減小而增加。該關(guān)系基于這樣的觀察，即晶界(多晶材料的晶粒之間的界面)通過材料破壞位錯的運動的觀察以及晶粒內(nèi)位錯的數(shù)量影響位錯穿過晶界及從晶粒行進到晶粒的容易性。因此，改變晶粒尺寸(例如，通過熱處理，或通過改變固化速率)可影響位錯運動和屈服強度。然而，在粒度小于約10nm的情況下，屈服強度保持恒定或隨著粒度減小而降低。

此前的研究表明當在可可堿的存在下生長時體外生長的磷灰石晶體表現(xiàn)出結(jié)晶度增高(晶粒尺寸增加)。由其中飼喂可可堿的哺乳期雌性大鼠的實驗的結(jié)果反映體外結(jié)果并且測量來自哺乳的幼鼠的牙齒和股骨的羥磷灰石結(jié)晶度。雌性幼鼠的股骨顯示出屈服應(yīng)力增加，但是雄性幼鼠的股骨顯示出屈服應(yīng)力降低。因此，接觸可可堿后觀察到的晶粒尺寸增加表明屈服強度降低，尤其鑒于Wang等人的工作，表明“當晶粒尺寸從亞微米降至納米時[羥磷灰石]的硬度遵循Hall-Petch關(guān)系”。雌性大鼠的股骨的屈服強度增加而雄性大鼠的屈服強度不增加表明，對于骨骼而言可能涉及混雜因素(例如，改善降低的屈服強度的因素，盡管增加雌性的晶粒尺寸但不增加雄性的晶粒尺寸)。

不希望受理論束縛，申請人認為侵蝕牙齒表面可增強新的磷酸鈣和/或羥磷灰石的沉積。可使用以下任何無機酸利用一步侵蝕法，所述無機酸包括但不限于HCl(鹽酸)、HNO₃(硝酸)、H₂SO₄(硫酸)和/或H₃PO₄(磷酸)，和/或任何有機酸，包括但不限于乳酸、丙酮酸、乙醇酸、氯乙酸、二氯乙酸(dichioroacetic acid)、三氯乙酸、氰基乙酸、酒石酸、琥珀酸、戊二酸、馬來酸、延胡索酸、丙二酸、檸康酸、鄰苯二甲酸、間酞酸、對酞酸、檸檬酸、丙三羧酸(tricarballyic acid)、1,3,5-戊三羧酸、苯偏三酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(2-acrylamido-2-methyipropane sulfonic acid)、苯磺酸、苯甲酸、溴乙酸、10-莰醌磺酸、10-樟腦磺酸、二溴乙酸、2,4-二硝基苯酚、甲酸、延胡索酸、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸、馬來酸、2-萘磺酸、硝酸、草酸、對硝基苯酚、苯酚、亞磷酸酯(例如2,2'-二(α-甲基丙烯酰氧基-β-羥基丙氧基苯基)丙烷二膦酸酯(雙-GMA二膦酸酯)、亞磷酸二丁酯、二-2-乙基-己基磷酸酯、二-2-乙基-己基亞磷酸酯、羥乙基甲基丙烯酸酯單磷酸鹽、甘油二甲基丙烯酸酯磷酸鹽、甘油-2-磷酸酯、甘油磷酸(glyceryiphosphoric acid)、甲基丙烯酰氧乙基磷酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯單磷酸鹽、季戊四醇三甲基丙烯酸酯單磷酸鹽、二季戊四醇五丙稀酸酯單磷酸鹽和二季戊四醇五甲基丙烯酸酯單磷酸鹽)、甲苯磺酸、三溴乙酸、三氟乙酸、三氟甲磺酸和/或三羥基苯甲酸)及其混合物。還可如實施例4所述使用兩步侵蝕法，使用任何上述的酸。所述一種或多種酸的濃度可為(獨立地)約0.01M至約2M、約0.025M至約1.5M、約0.05M至約1M、約0.075M至約0.75M、約0.085M至約0.5M、約0.09M至約0.4M、約0.1M至約0.3M、約0.1M至約0.25M、約0.1M至約0.2M，并且優(yōu)選約0.1M。優(yōu)選地，使用兩步侵蝕法，所述兩步侵蝕法包括在0.1M HCl中沖洗/浸泡/接觸約15秒，用蒸餾水沖洗，然后在0.1M草酸溶液中沖洗/浸泡/接觸約15秒，然后再用蒸餾水沖洗一次。

此處，申請人提交了意外和令人吃驚的結(jié)果，接觸可可堿組合物的人牙齒表現(xiàn)出顯著增強的壓痕硬度，雖然晶粒尺寸隨之增加。申請人還提交了更意外和令人吃驚的結(jié)果，這種接觸在牙齒表面產(chǎn)生新的羥磷灰石/磷酸鈣的顯著沉積，并且這種沉積比對照的情況或使用NaF觀察到的程度更高。此發(fā)現(xiàn)代表在預防包括牙齒斷裂(通常情況)、釉質(zhì)斷裂、崩裂和齲齒的齲齒損傷中的顯著進展。

實施例1

測試氟化物與可可堿

使用裝備有15HC系列金剛石刀片的Buehler isomet低速鋸，將13顆人牙齒各自切割為4個大致相等的部分，從而提供13個組，每個組中含有4個樣品。將每個樣品的后側(cè)(切割面)磨平并且用粘合劑將其固著于青銅壓縮冠上，使牙齒原來的外表面暴露并可用于實驗。將來自每個組的一個樣品(即，來自每顆牙齒的一個樣品)用于3種實驗條件中的每一種，每個組保留一個樣品(即，每顆牙齒保留一個樣品)以防適于顯微硬度測試的平面區(qū)域不可用。

將樣品浸泡于對照溶液(人工唾液，如表2中所示)、含有NaF的對照溶液或含有可可堿的對照溶液，每天30分鐘。在每天進行此種浸泡方案后，將樣品用蒸餾水沖洗并且在其余24小時期間置于對照溶液(人工唾液)。此沖洗方案僅有的例外發(fā)生于第8天，這天省略沖洗步驟以避免在對樣品進行掃描電子顯微術(shù)(SEM)之前破壞釉質(zhì)表面。

在0.15％(約35.7mM)、0.25％(約59.5mM)、0.5％(約119mM)和1.1％(約262mM)的濃度檢驗氟化鈉，所述濃度代表商購(非處方)氟化鈉濃度的較低端和1.1％的處方強度水平。在1mg/L(約0.006mM)、5mg/L(約0.028mM)、10mg/L(約0.056mM)、25mg/L(約0.139mM)、50mg/L(約0.278mM)、100mg/L(約0.556mM)、200mg/L(約1.11mM)和500mg/L(約2.78mM)的濃度下研究可可堿的作用。將較寬的劑量范圍用于可可堿，因為有效劑量未知。可可堿的最高劑量500mg/L對應(yīng)于如上所述商業(yè)可可粉(約1.89％)中存在的可可堿的平均水平，并且代表水中可可堿的溶解度上限。通過每升人工唾液混合1890mg(1.89g)可可堿來制備500mg/L可可堿。

純羥磷灰石的鈣與磷(Ca:P)的比率為1.67:1。磷酸三鈣Ca₃(PO₄)₂或“TCP”是羥磷灰石中存在的主要雜質(zhì)并且可通過x射線衍射檢測為Ca:P比率從目標比率1.67:1的偏離。通過確保人工唾液溶液中存在充足的鈣(例如，如氯化鈣)可易于使磷酸三鈣的形成減至最少(Van Der Bijl和De Waal(1993),Kelly等人(2004))。申請人的配方與文獻不同，因為人工唾液溶液含有為通常用量(0.32g/L CaCl₂·2H₂O)兩倍的氯化鈣，以使TCP的形成減至最少。有效閾值水平的鈣的添加也是申請人開發(fā)牙粉所特別關(guān)注的。

實施例2

努普顯微硬度測試

每天使用安裝有細長菱形壓頭尖端的Buehlet Micromet-1顯微硬度計對每個樣品進行努普顯微硬度測試，持續(xù)8天。第1天的測量結(jié)果代表每個樣品的基線硬度。因為每顆牙齒被切割成4個不同的樣品，所以申請人能夠比較對大致相同的釉質(zhì)表面的不同實驗條件。對于其中來自一顆牙齒的所有四個切片樣本具有適于努普顯微硬度測試的平面的組，檢驗另外的可可堿劑量，因為可可堿實驗組中存在更多檢驗的基準值。

降低Micromet-1金剛石尖端以使其與每個牙齒樣本的釉質(zhì)表面接觸。一旦接觸，顯微硬度壓頭向每個樣品的釉質(zhì)表面施加50克的力，持續(xù)5秒。施加的力與釉質(zhì)表面大致垂直。當結(jié)束時，金剛石尖端自動縮回，并且通過掃描電子顯微術(shù)測量在每個樣品的釉質(zhì)表面明顯的壓痕的長對角線的長度(參見，例如，圖1)。根據(jù)式1使用壓痕長度計算顯微硬度值(努普硬度數(shù)或“HK”)：

其中HK值的范圍通常為100至1000帕(Pa，或kgf/mm²；其中1kgf/mm²＝9.80665MPa)；P＝荷重(此處為50gf)；面積＝印痕面積；C_p＝壓頭形狀相關(guān)的校正因子，使壓痕的投影面積與長對角線長度的平方相關(guān)(此處，對于使用的菱形壓頭為0.07)；并且L＝沿其長軸的壓痕長度(μm)。

實施例3

掃描電子顯微照片

使用Amray 1820數(shù)字SEM在15kv加速電壓和18mm工作距離、25°樣品傾斜度及400μm終孔徑下拍攝掃描電子顯微照片(SEM)。通過EDS 2006收集多個512×512像素24-位tiff圖像，EDS 2006為IXRF Systems Inc.的集成軟件包的一部分。(參見，例如，圖1-9)。

如以上實施例2中所說明，在顯微鏡下測量每個樣品的釉質(zhì)表面上明顯的每個壓痕的長度(參見，例如，圖1、3-9)。根據(jù)式1使用壓痕長度計算顯微硬度值(HK)。使用本公開的可可堿組合物處理的牙齒在釉質(zhì)表面上顯示出大量的頁狀剝離和表面重結(jié)晶。使用500mg/L(約2.78mM)可可堿組合物處理的牙齒顯示出相當多的表面重結(jié)晶，使得新沉積的羥磷灰石沉積開始覆蓋原來的凹陷和多孔表面(參見圖8和9)。這些掃描電子顯微照片表明本文公開的可可堿組合物充當一種在牙齒表面形成羥磷灰石的催化劑。

如圖10的坐標圖所示，在實施例1中所述的條件下使牙齒接觸本公開的可可堿組合物后，顯著且意外的是，低至1mg/L的可可堿(約0.006mM)產(chǎn)生的結(jié)果與使用0.25％(w/v)氟化鈉(約59.5mM)(商業(yè)牙粉中通常存在的氟化物的量)實現(xiàn)的結(jié)果相等。因為單氟磷酸鈉(Na₂FPO₃)含有一個氟離子/分子(正如氟化鈉)，預期使用NaF觀察到的劑量/反應(yīng)曲線與Na₂FPO₃大致相同。如圖10清楚地顯示，低至25mg/L可可堿(約0.139mM)產(chǎn)生的結(jié)果與使用1.1％氟化鈉(約262mM)(處方加強型牙膏中存在的量)所實現(xiàn)的結(jié)果相等。顯著地，在8天測試期間內(nèi)介于100mg/L和500mg/L之間的可可堿使得顯微硬度值顯著提高。須知500mg/L可可堿對應(yīng)商業(yè)可可粉(約1.89％)中存在的可可堿的平均水平，如上所述。

在圖11的半對數(shù)圖中進一步示出了公開的可可堿組合物的令人驚訝的和意外的效果，其中沿著X-軸示出了來自圖10的氟化鈉和可可堿溶液的摩爾濃度(以對數(shù)標度繪制)。圖11清楚地示出可可堿組合物比氟化鈉在分子-分子基礎(chǔ)上在增強牙齒的壓痕硬度方面更顯著有效。

實施例4

比較劃傷的人牙齒上的可可堿和NaF

在釉質(zhì)表面用金剛石劃片劃傷分離的人牙齒。然后將每顆牙齒在0.1M HCl中侵蝕15秒，用蒸餾水沖洗，然后在0.1M草酸溶液中接觸15秒，然后再用蒸餾水沖洗一次。然后將牙齒置于0.2M Na₂HPO₄溶液中，向所述Na₂HPO₄溶液添加可可堿(至終濃度200mg/L)、NaF(至終濃度0.25％)或水(對照)。將pH調(diào)節(jié)至7.4-7.6，此后在攪拌下加入0.2M CaCl₂溶液(溶液立即從磷酸鈣沉淀變混濁)。檢驗pH并且按照需要將pH立即調(diào)節(jié)至介于7.4和7.6之間。如上所述，可可堿和NaF的終濃度分別為200mg/L和0.25％。使用體積比為約3:5的Na₂HPO₄溶液與CaCl₂溶液以避免Ca或P的任何過量。將牙齒在室溫下如此孵育約90分鐘，此后將其從溶液取出，用蒸餾水小心洗滌若干次，然后在干燥器中干燥24小時。干燥后，將牙齒用碳包被以通過掃描電子顯微術(shù)(SEM)觀察。SEM結(jié)果在圖12-14中示出，并在下文論述。

圖12A示出了在對照溶液(無可可堿或NaF)中孵育90分鐘的劃傷牙齒。通過金剛石劃片產(chǎn)生的劃傷由箭頭示出，從圖的頂端移至低端，顏色深且明顯。圖12B示出了在0.25％NaF存在下孵育90分鐘的劃傷牙齒。由金剛石劃片產(chǎn)生的劃傷似乎是部分填充的，如指向牙齒表面的陰影的箭頭所示，但是劃傷仍然很寬。用NaF孵育的牙齒還顯示出在整個可視表面小的、集中的礦物質(zhì)沉積。與對照和NaF實驗形成鮮明對比，圖12C示出了在200mg/L可可堿存在下孵育90分鐘的劃傷的牙齒。由金剛石劃片產(chǎn)生的劃傷(箭頭示出的大致位置)幾乎完全被新沉積的磷酸鈣的光滑層所掩蓋。

實施例5

磷酸鈣沉積：可可堿與NaF

使用牙鉆，將孔鉆至分離的人牙齒的釉質(zhì)表面，每顆牙齒在3個獨立的位置鉆3個孔。鉆孔后，將牙齒孵育在如實施例4公開的溶液溶液中，不同的是另外一組牙齒在200mg/L和0.25％NaF存在下孵育。干燥后，切割每顆牙齒以使所鉆的孔能夠目測并且測量所述孔中的磷酸鈣沉積的量。按照實施例4通過SEM目測牙齒，且在每種實驗條件下測量磷酸鈣沉積的量。

如以下表3中所示，與對照相比，所有處理均使得沉積的磷酸鈣的量在統(tǒng)計學上顯著增加。雖然用NaF和可可堿雙重孵育使得沉積的磷酸鈣的平均量更高，但是與用單獨NaF所實現(xiàn)的結(jié)果無顯著差異。令人驚訝的是，在所有其它測試條件下，用單獨的可可堿孵育使得沉積的磷酸鈣的量在統(tǒng)計學上顯著增加。

實施例6

比較齲齒模型中的可可堿和NaF

通過在建立的體外再礦化/脫礦pH循環(huán)模型中測定早期齲損再礦化來比較含可可堿的牙膏制劑與標準NaF牙粉的抗齲齒潛力。

人工齲樣損傷的產(chǎn)生

經(jīng)供者同意后，從圣安東尼奧的得克薩斯大學健康科學中心(UTHSCSA)的牙科學院的不同診所收集新拔除的人臼齒。清除牙齒的碎屑/污漬，并且用透照器檢驗。選擇沒有齲齒或釉質(zhì)畸形的牙齒并且用浮石清潔以去除來自頰面的膜殘留部分。使用水冷金剛石線鋸，由所用30顆牙齒中的每一顆產(chǎn)生3顆牙塊，每顆牙塊經(jīng)測量為大約3mm長度×2mm寬度×1.5mm厚度。然后使用MultiPrep^TM精密拋光機(Allied High Tech,USA)中的平紋金剛石拋光膜(1μm)，對每顆牙塊的釉質(zhì)表面進行拋光以獲得平坦平面。此后，用兩層耐酸指甲油涂覆每顆牙塊的所有表面，除了頰面之外。然后，通過在Amaechi BT,Higham SM,Edgar WM."Factors affecting the development of carious lesions in bovine teeth in vitro"Archives of Oral Biology1998；43:619-628(通過引用整體并入本文)中所述的酸化凝膠系統(tǒng)中脫礦7天來在每顆牙塊的此暴露頰面形成早期齲齒樣損傷。通過將0.10M氫氧化鈉添加至0.10M乳酸達到給定的pH值4.5來制備凝膠。在快速攪拌的同時，向此溶液中添加6％w/v羥乙基纖維素。獲得的凝膠的終稠度顯示出100cP區(qū)域的粘度。

形成損傷后，用丙酮小心地完全去除指甲油。因此，總共從用于再礦化測試的每顆牙齒(30顆牙齒)獲得3顆具有損傷的牙塊(共計90顆牙塊)。

處理工序

基于待測的三種牙粉將來自每顆牙齒的3顆牙塊隨機分到三個處理組(n＝30，每個處理組)：組1：對照牙膏(既無氟化物也無可可堿)；組2：含有0.243％NaF的標準NaF牙膏(例如，通常的高露潔(Colgate)、佳潔士(Crest))；及組3：含有200mg/L可可堿的可可堿牙膏。將每個處理組的30顆牙塊分到3個亞組，每個亞組10顆牙塊。使用耐酸指甲油，將每個亞組的10顆牙塊黏著于與30-mL顏色編碼的處理小瓶的蓋子連接的圓棒上，向每個牙粉組提供總計3個小瓶。

使用pH循環(huán)(脫礦/再礦化)模型進行再礦化研究，盡可能地模擬口腔環(huán)境內(nèi)的活動(參見表4)。匯集的人唾液用作所有處理方案中的再礦化介質(zhì)，而上述用于形成早期齲損的酸化凝膠用作酸刺激介質(zhì)。每天使用匯集的新鮮人唾液。通過使用實驗室標準攪拌器混合1份牙粉和3份匯集的人唾液(9g:27mL)直至均質(zhì)來制備牙粉的標準漿液。每個處理過程之前制備每個組的新鮮漿液。每天的循環(huán)處理方案由3次1小時酸刺激、3次2分鐘牙粉處理時段及所后剩余時間的唾液處理組成，如以下表4的治療時間表所示(第1天進行全天唾液處理以使得膜形成；隨后幾天的處理在表4中示出)。

對于處理，將15mL處理介質(zhì)(匯集的人唾液、牙粉漿液或酸化凝膠)置于每個顏色編碼30mL處理小瓶中。在350rpm攪拌所有處理物。處理前每天測量每種產(chǎn)品(一種漿液)的pH一次。用一種介質(zhì)處理后，用流動的去離子水沖洗樣本，在浸入下一個試劑之前用紙巾干燥。重復每天的方案，持續(xù)14天，此后取出來自3個組的每一個中的10顆牙塊用于維氏顯微硬度測試，如下所述。

根據(jù)表4的處理時間表繼續(xù)處理來自3個組中的每一個的其余20顆牙塊(n＝60)，共計28天，并且如“基線橫向測顯微放射照相(TMR)數(shù)據(jù)分析”和“后處理加工”所述進行評價。

維氏顯微硬度分析

對每個樣品(3個組，每個組10顆牙塊，共計30顆)進行維氏顯微硬度測試，使用直立棱錐形狀的金剛石壓頭對測試材料壓痕。在上述處理工序前，測量這些牙塊中的每一顆的維氏顯微硬度，并且在進行處理工序14天后再次測量。金剛錐壓頭具有方形基底并且相反面之間的角度為136°，并且經(jīng)受25gf(克力)的荷重，停留時間15秒。施加的力與釉質(zhì)表面大致垂直。當結(jié)束時，金剛石尖端自動縮回，通過由掃描電子顯微術(shù)測量尖端產(chǎn)生的在每個樣品的釉質(zhì)表面明顯的兩條對角線的長度，并且計算它們的平均值。根據(jù)式2，通過用gf荷重(以kgf)除以壓痕的平方毫米面積(mm²)來計算維氏硬度(HV)，其中F＝荷重(kgf)，d＝兩條對角線的平均值(mm)。

如圖13所示，與用人工唾液(對照)或NaF牙膏處理14天的牙塊(表面硬度分別增加9.4％和8.5％)相比較，經(jīng)受齲齒模型然后用可可堿牙膏處理14天的牙塊顯示出顯著提高的HV(表面硬度增加27.5％)。

基線橫向測顯微放射照相(TMR)數(shù)據(jù)分析

使用水冷金剛石線鋸從每顆具有損傷的牙塊上切割牙齒切片(～150μm厚度)。此切片用作基線以用于確定在再礦化之前(測試前參數(shù))損傷的預處理TMR參數(shù)(礦物質(zhì)損失(ΔZ)和損傷深度(LD))。還使用對照切片的參數(shù)以選擇適于再礦化研究的損傷。對基線切片進行加工以用于如下TMR評價。首先，使用MultiPrep^TM精確拋光機(Allied High Tech,USA)上的Adhesive Back拋光膜將切片的兩側(cè)拋光以獲得平坦平行面并將切片的厚度減至100μm(用于TMR的合適厚度)。此后，使用為此目的設(shè)置的Phillips x-射線發(fā)生器系統(tǒng)，將切片在1A型高分辨率玻璃X-射線板上顯微放射照相(Microchrome Technology,CA,USA)。將板在20kV陽極電壓和10mA管電流下暴露10分鐘，然后加工。加工由在Kodak HR顯影劑中顯影5分鐘，及Kodak快速定影劑中定影15分鐘，然后最終30分鐘的洗滌過程組成。干燥后，對顯微放射照片進行目測并且使用電腦程序(TMR2006 3.0.0.6版)分析圖像。硬件為通過Sony模型XC-15 75CE CCTV照相機與個人電腦連接的Leica DMR光學顯微鏡。在光強度和放大率的標準條件下分析顯微放射照片的增強圖像，并且與來自感光級譜的圖像數(shù)據(jù)一起通過TMR程序處理。通過這種方法，對每個齲損定量綜合的礦物質(zhì)損失(ΔZ,體積％.μm)和損傷深度(LD,μm)的參數(shù)。

后處理加工

處理28天后，從60顆牙塊的每一顆上切割牙齒切片(～150μm厚度)，并且處理用于顯微放射照相術(shù)，如以上對照樣本所述。雖然對照切片經(jīng)顯微放射照相并且對經(jīng)分析以選擇合適的損傷，但它們將與測試后的切片一起再次顯微放射照相，并且對兩者一起分析以定量ΔZ和LD，如以上對照部分所述。這使得兩組能夠在相同的條件下顯微放射照相和分析。此加工產(chǎn)生以下信息：1)測試前TMR參數(shù)(損傷的ΔZ₁和LD1)；2)測試后TMR參數(shù)(損傷的ΔZ₂和LD2)；及3)損傷的測試前和測試后TMR圖像。

數(shù)據(jù)處理和解釋

對于3種處理牙粉中的每一種的測試前組和測試后組，計算損傷參數(shù)、礦物質(zhì)損失[ΔZ(體積％.μm)]和損傷深度[LD(μm)]的平均(n＝20)值。將使用數(shù)據(jù)和圖像進行以下檢驗：A)使用TMR圖像，檢驗和描述在每種損傷的內(nèi)部結(jié)構(gòu)內(nèi)由每種處理方法產(chǎn)生的再礦化形式和程度。這將通過并行比較測試前和測試后的圖像清楚地示出；及B)比較每種測試產(chǎn)品的測試前和測試后的損傷參數(shù)(ΔZ和LD)的平均值以確定測試產(chǎn)品產(chǎn)生的任何顯著變化(再礦化)。然而，為了在3個測試組之間進行比較，對每種測試產(chǎn)品測定相對于對照計算的損傷參數(shù)的百分比變化(百分比變化將用于分級和比較以作出規(guī)定，因為雖然3顆牙塊來自相同的牙齒，但牙塊的損傷參數(shù)可能在基線處不同)。這根據(jù)式3和4計算：

統(tǒng)計功效分析

功效分析通過使用nQuery Advisor軟件(Statistical Solutions,Cork,Ireland)進行并且基于Amaechi BT."Pattern of the Effect of Fluoride Varnishes On Early Caries"J.Dent Res.2008；87(特刊B):abst.1195(通過引用整體并入本文)獲得的先前結(jié)果。

實施例7

比較腐蝕模型中的可可堿和NaF

通過在建立的體外再礦化/脫礦pH循環(huán)模型中測定早期齲損再礦化來比較含可可堿牙膏制劑與標準NaF牙粉的抗齲齒潛力。

人工腐蝕損傷的產(chǎn)生

經(jīng)供者同意后，從圣安東尼奧的得克薩斯大學健康科學中心(UTHSCSA)的牙科學院的不同診所收集新拔除的人臼齒。清除牙齒的碎屑/污漬，并且用透照器檢驗。選擇沒有齲齒或釉質(zhì)畸形的牙齒并且用浮石清潔以去除來自頰面的膜殘留部分。使用水冷金剛石線鋸，由所用30顆牙齒中的每一顆產(chǎn)生3顆牙塊，每顆牙塊經(jīng)測量為大約3mm長度×2mm寬度×1.5mm厚度。然后使用MultiPrep^TM精密拋光機(Allied High Tech,USA)中的平紋金剛石拋光膜(1μm)，對每顆牙塊的釉質(zhì)表面進行拋光以獲得平坦表面。此后，用兩層耐酸指甲油涂覆每顆牙塊的所有表面，除了頰面之外。使用耐酸指甲油將90顆牙塊粘附到9個載玻片(10顆牙塊/切片)。將每個具有牙塊的載玻片浸入含有新鮮制備的1％檸檬酸(在磁力攪拌器持續(xù)攪拌下使1.0g無水粉末狀檸檬酸溶解于100mL去離子蒸餾水)的50mL燒杯中10分鐘，同時用磁力攪拌器持續(xù)攪拌。浸泡指定的時間后，將樣本用紙巾小心地干燥并從載玻片上去除，從而提供來自每顆牙齒的共計3顆具有損傷的牙塊以用于再礦化測試。

如上述實施例6所述進行處理工序。如同實施例6中，浸泡14天后將來自3個處理組(對照、NaF牙膏和可可堿牙膏)中的每一組的10顆牙塊取出，如以上針對實施例6所述進行維氏顯微硬度測試。

根據(jù)表4的處理時間表繼續(xù)處理來自3個組中的每一個的其余20顆牙塊(n＝60)，共計28天，并且按照上述實施例6中“基線橫向測顯微放射照相(TMR)數(shù)據(jù)分析”和“后處理加工”所述進行評價；對于這些20顆牙塊，如上述實施例6所述進行基線橫向測顯微放射照相(TMR)數(shù)據(jù)分析、后處理加工、數(shù)據(jù)處理和解釋及統(tǒng)計功效分析。

如圖14所示，與用人工唾液(對照)或NaF牙膏處理14天的牙塊(表面硬度分別增加4.6％和4.9％)相比較，經(jīng)受齲齒模型然后用可可堿牙膏處理14天的牙塊顯示出顯著提高的HV(表面硬度增加43.9％)。

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應(yīng)理解，上述要素中的每一種，或兩種或更多種也可一起在不同于上述類型的其它類型的方法中得到有用的應(yīng)用。無需進一步分析，以上所述充分地揭示了本申請的要點，使得其他人可通過運用現(xiàn)有知識就易于使其適應(yīng)各種應(yīng)用而不必省略從現(xiàn)有技術(shù)的觀點來看清楚地構(gòu)成所附權(quán)利要求中示出的本申請的一般或特定方面的本質(zhì)特征的特性。上述實施方案僅以實例的方式呈現(xiàn)；本申請的范圍僅受以下權(quán)利要求的限定。