本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種多級(jí)孔生物活性玻璃固載溶菌酶牙膏的制備與應(yīng)用，特別設(shè)計(jì)一種固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃材料，屬于生物活性玻璃領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

溶菌酶是一種用做水解微生物細(xì)胞壁的堿性酶，主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出，因此具有溶菌的特性。由于溶菌酶具有天然、易消化吸收并且無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)，所以在科研領(lǐng)域中極具應(yīng)用價(jià)值。在食品領(lǐng)域上主要用于殺菌防腐等；在生物醫(yī)藥領(lǐng)域上主要用于抗菌消炎等。因此，目前在國(guó)內(nèi)溶菌酶這種生物活性物質(zhì)的發(fā)展十分迅速。

最早在1969年由hench提出生物活性材料這一概念。1971年制備出來(lái)的生物活性玻璃是一種人工生物材料，可應(yīng)用到人體的組織修復(fù)，也是優(yōu)良的生物惰性玻璃陶瓷和生物可降解陶瓷。因其可應(yīng)用到人體并能適應(yīng)人體的特殊環(huán)境，所以具有較好的生物相容性，且無(wú)毒無(wú)排斥現(xiàn)象，還有良好的力學(xué)性能，材料的耐磨性很好，能與組織很好的結(jié)合，從而達(dá)到良好的修復(fù)效果。

多級(jí)孔生物活性玻璃是在1994年合成的介孔生物活性玻璃的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)，多級(jí)孔材料的孔徑優(yōu)于單一的介孔，孔徑多樣可調(diào)控，適合不同的蛋白質(zhì)或者藥物分子固載。

據(jù)了解，中國(guó)口腔病患病率高達(dá)97.6％，幾乎人人都有牙病。一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)顯示，目前，中國(guó)人口的齲齒總數(shù)約為25億顆。如果以現(xiàn)有口腔診所的診治水平，治療這些牙齒至少需要200年。而現(xiàn)代中國(guó)人口腔健康不僅僅是齲齒問(wèn)題，還有牙結(jié)石，牙菌斑，牙齦紅腫出血，牙本質(zhì)敏感，牙齒黑黃，口氣不清新等多重問(wèn)題。想要有效解決這些口腔問(wèn)題，僅依靠治療是不夠的，還需要做到“預(yù)防為主、防治結(jié)合”。因此，一款具備預(yù)防、治療于一體的牙膏將會(huì)擁有良好的市場(chǎng)前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是以天然花粉為硬模板，三嵌段聚合物為軟模板合成多級(jí)孔生物活性玻璃材料，將溶菌酶固載于其上，作為一種復(fù)合活性物質(zhì)加入到牙膏制備工業(yè)中，將實(shí)現(xiàn)多種材料的協(xié)同作用，骨修復(fù)性、抑菌抗炎性、補(bǔ)充牙齒所需營(yíng)養(yǎng)元素、促進(jìn)牙釉質(zhì)礦化等多種功效。本發(fā)明的技術(shù)方案由以下部分組成。

1)介孔生物活性玻璃的制備：于燒瓶中加入189ml無(wú)水乙醇，然后加入10g三嵌段共聚物(p123)、18ml正硅酸乙酯(teos)、1.17g四水合硝酸鈣、1.71ml磷酸三乙酯(tep)、5ml鹽酸(0.5mol/l)后，在室溫下磁力攪拌24h，制得介孔生物活性玻璃(mbg)。

2)多級(jí)孔生物活性玻璃的制備：將5g松花粉浸漬在50ml無(wú)水乙醇中，利用超聲波分散1h。將花粉轉(zhuǎn)移至體積比為1：1的乙醇與甲醛的混合液中，10min后用去離子水重復(fù)沖洗。最后利用濃硫酸進(jìn)行碳化處理，將上述固定化后的花粉加入50ml濃度為12mol/l的濃硫酸中，在80℃水浴條件下攪拌4h，當(dāng)溶液由黃色變成黑色時(shí)，過(guò)濾并反復(fù)用去離子水沖洗，直至ph＝7，將材料置于80℃干燥箱中干燥12h，將干燥后的材料用1)中制得的液體mbg進(jìn)行浸漬，重復(fù)15次，在30℃的烘箱中吹干，最終將材料置于電阻爐中700℃煅燒8h，制備出多級(jí)孔生物活性玻璃材料。

3)固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃的制備：取2)中多級(jí)孔生物活性玻璃10mg，與4ml溶菌酶溶液(4mg/l，ph＝9)混合，37℃下在振蕩器中以180rpm轉(zhuǎn)數(shù)震蕩2h。通過(guò)高速離心分離得到吸附后的材料，并用大量的去離子水進(jìn)行清洗。制備出固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃。

4)將3)中制得的固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃作為活性物質(zhì)應(yīng)用于口腔護(hù)理產(chǎn)品中牙膏的制備，制備方法按常規(guī)牙膏配制方法制得：

本發(fā)明以天然花粉為硬模板，三嵌段聚合物為軟模板合成多級(jí)孔生物活性玻璃材料，前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了其對(duì)溶菌酶優(yōu)異的固載能力，固載量大且酶活性保持完好，能夠提高酶的重復(fù)利用性。將其加入到牙膏制備工業(yè)中，將實(shí)現(xiàn)多種材料的協(xié)同作用，骨修復(fù)性、抑菌抗炎性、補(bǔ)充牙齒所需營(yíng)養(yǎng)元素、促進(jìn)牙釉質(zhì)礦化等多種功效，是一種集多種功效于一身的新型牙膏，將填補(bǔ)我國(guó)生物活性玻璃抑菌牙膏的技術(shù)空白，擁有良好的市場(chǎng)前景。

下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行描述。

附圖說(shuō)明

圖1、圖2本發(fā)明制得的多級(jí)孔生物活性玻璃的sem照片；

圖3本發(fā)明制得的多級(jí)孔生物活性玻璃的tem照片；

圖4本發(fā)明制得的多級(jí)孔生物活性玻璃的n2吸附-脫附圖；

圖5本發(fā)明制得的多級(jí)孔生物活性玻璃的孔徑分布圖；

圖6本發(fā)明制得的固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃的體外礦化6h體外礦化sem照片。

圖7本發(fā)明制得的固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃的體外礦化24h體外礦化sem照片。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

將10mg多級(jí)孔生物活性玻璃，與4ml0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml的濃度梯度溶菌酶溶液混合，恒溫下在振蕩器中高速震蕩2h。通過(guò)高速離心分離得到吸附后的材料，并用大量的去離子水進(jìn)行清洗。

經(jīng)上述方法獲得的最高吸附量的溶菌酶溶液濃度為4mg/ml。

實(shí)施例2

將10mg多級(jí)孔生物活性玻璃，與4ml溶菌酶溶液(4mg/ml)混合。利用高濃度的naoh溶液將混合液的ph調(diào)至4～11。恒溫下在振蕩器中高速震蕩2h。通過(guò)高速離心分離得到吸附后的材料，并用大量的去離子水進(jìn)行清洗。

經(jīng)上述方法獲得的最高吸附量的溶菌酶溶液的ph＝9。

實(shí)施例3

將10mg多級(jí)孔生物活性玻璃，與4ml溶菌酶溶液(4mg/ml，ph＝9)混合。在30℃、37℃、42℃的條件下在振蕩器中高速震蕩2h。通過(guò)高速離心分離得到吸附后的材料，并用大量的去離子水進(jìn)行清洗。

經(jīng)上述方法獲得的最高吸附量的溶菌酶溶液的最適振蕩溫度為37℃。

實(shí)施例4

將10mg多級(jí)孔生物活性玻璃，與4ml溶菌酶溶液(4mg/ml，ph＝9)混合。在37℃下在振蕩器中分別以50rpm、100rpm、150rpm、180rpm、200rpm的轉(zhuǎn)數(shù)振蕩2h。通過(guò)高速離心分離得到吸附后的材料，并用大量的去離子水進(jìn)行清洗。

經(jīng)上述方法獲得的最高吸附量的溶菌酶溶液的最適振蕩轉(zhuǎn)數(shù)為180rpm。

實(shí)施例5

制備的離子組成與人體體液相似的模擬體液(sbf)，其中na⁺，k⁺，ca²⁺，mg²⁺，cl^-，hco^3-，hpo4^2-和so4^2-的摩爾比例為142/5/2.5/1.5/147.8/4.2/1/0.5，模擬體液的ph為7.4。將上固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃浸泡在50毫升的模擬體液中，用醫(yī)用搖床在37℃震蕩6，24，72和168小時(shí)，用于觀察礦化情況。

實(shí)施例6

將固載溶菌酶的生物活性玻璃作為活性物質(zhì)，按常規(guī)牙膏配方制得，并按如下重量百分比稱(chēng)量牙膏中各原料成分：

或者

或者

牙膏制作工藝按常規(guī)制作方法，先將月桂?；“彼徕c、山梨醇、糖精鈉在預(yù)溶鍋中用甘油溶解均勻，加入制膏鍋中，加入粉料，再加入薄荷香精，進(jìn)行刮板攪拌、均質(zhì)攪拌、研磨，同時(shí)抽真空，合格后，加至儲(chǔ)存鍋中進(jìn)行陳化，裝罐至自動(dòng)裝罐線上完成。

實(shí)施例7

鈣磷沉降實(shí)驗(yàn)中，材料應(yīng)具備良好的離子釋放性。

本實(shí)施例利用ph儀測(cè)量記錄濃度為0.025％、0.05％、0.075％的配方三的牙膏水浸提液在不同時(shí)間ph的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。三種濃度的牙膏水溶液的ph值均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但最低ph>8。具相關(guān)文獻(xiàn)證明，較高ph具有抑菌作用。

實(shí)施例8

將嗜酸乳桿菌、具核梭桿菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3～14代菌液，配制成2.5×10⁷～2.5×10⁸cfu/ml的菌懸液。本實(shí)施例將5g固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃溶解于45ml磷酸緩沖液(0.03mol/l，ph＝7.00)中，制成10％的抑菌液。將抑菌液用滅菌的蒸餾水進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)玫綕舛炔煌臏y(cè)試液，稱(chēng)取2.5ml不同濃度測(cè)試液分別與2.5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯(30.00gtsb，加1000ml蒸餾水溶解，121℃高壓滅菌20min)混合。取本實(shí)施例中配置的0.1ml的菌懸液于含不同濃度的抑菌液的營(yíng)養(yǎng)肉湯試管中，37℃恒溫培養(yǎng)48h，得到固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃對(duì)嗜酸乳桿菌、具核梭桿菌的最小抑菌濃度(mic)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)固載溶菌酶的多級(jí)孔生物活性玻璃對(duì)嗜酸乳桿菌、具核梭桿菌具有抑菌性。

實(shí)施例9

本實(shí)施例取1.0g配制的牙膏(配方一)，加入3ml滅菌的去離子水稀釋。取干燥無(wú)菌的6mm濾紙片浸漬在上述牙膏溶解液中，干燥備用。按照營(yíng)養(yǎng)瓊脂配方制備培養(yǎng)基。將實(shí)施例7中的菌懸液均勻涂于平板表面，待菌液滲入瓊脂平板后，將本實(shí)施例中制得的6mm濾紙片貼于平板表面。于37℃恒溫培養(yǎng)48h，計(jì)算紙片周?chē)志χ睆酱笮?，以此衡量該配方牙膏的抑菌性?/p>

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。說(shuō)明本實(shí)施例中牙膏抑菌性較好。