本申請(qǐng)是以下申請(qǐng)的分案申請(qǐng)：申請(qǐng)日：2012年5月25日；申請(qǐng)?zhí)枺?01280031821.0(pct/ep2012/059879)；發(fā)明名稱：同上。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2011年5月26日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/490,205和2011年12月15日提交的61/570,966的較早申請(qǐng)日的權(quán)利，所述申請(qǐng)的公開內(nèi)容并入本文。依照37c.f.r.§1.71(e)的版權(quán)通告本專利文件的部分公開內(nèi)容含有受到版權(quán)保護(hù)的材料。版權(quán)所有者不反對(duì)專利文件或?qū)＠_內(nèi)容中使用的提交到專利與商標(biāo)局(patentandtrademarkoffice)的專利文件或記錄中出現(xiàn)的任何復(fù)制件，但除此之外保留所有版權(quán)權(quán)利。背景登革熱是通過蚊子傳播的人類急性病毒性疾病。其為全球熱帶和亞熱帶的地方性疾病，每年估計(jì)有100,000,000例發(fā)生。雖然比較罕見，但是登革出血熱(dhf)和登革休克綜合征(dss)在兒童中是主要的致死原因。目前，還沒有保護(hù)免于登革熱的疫苗，而通過控制蚊子媒介來防病的試圖也被證明基本無效。因此，仍然需要安全和有效的疫苗來保護(hù)免于由登革熱病毒導(dǎo)致的疾病。簡(jiǎn)述本發(fā)明公開內(nèi)容涉及配制引發(fā)針對(duì)登革熱病毒的免疫應(yīng)答的組合物。附圖簡(jiǎn)述圖1是泊洛沙姆表面活性劑α-羥基-ω-羥基聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)三嵌段共聚物的通式的圖示說明。圖2a和b是說明包含純化的滅活登革熱病毒的免疫原性組合物的純化和滅活的示例性過程的流程圖。圖2c和d是說明純化和滅活的可替代過程的流程圖。圖3a和b是說明包含純化的滅活登革熱病毒的免疫原性組合物的配制的示例性過程的流程圖。圖4a-b是說明配制包含純化的滅活登革熱病毒的免疫原性組合物之后產(chǎn)物表征的代表性結(jié)果的表。圖5a-c是說明凍干和重構(gòu)之后產(chǎn)物表征的代表性結(jié)果的表。圖6a和b是穩(wěn)定性特征的圖示代表(a：固有熒光280/320；b：elisa)。詳述介紹本公開內(nèi)容涉及配制免疫原性組合物。具體而言，本公開內(nèi)容涉及配制組合物，諸如原料疫苗制品(bulkvaccinepreparation)和免疫原性組合物，其含有一株或多株純化的滅活登革熱病毒。本文公開的配制方法增加了含有純化的滅活登革熱病毒的免疫原性組合物的回收率和穩(wěn)定性，促進(jìn)它們的產(chǎn)生、儲(chǔ)存和分配。本公開內(nèi)容的第一個(gè)方面涉及組合物，其包含一種或多種純化的滅活登革熱病毒與緩沖劑和表面活性劑的組合。有利地，此類組合物是適合于配制成免疫原性組合物(例如，防止由于登革熱病毒的感染和/或疾病的疫苗)的滅活登革熱病毒的原料制品(bulkpreparation)。例如，與不包含表面活性劑的制劑相比，添加選擇的表面活性劑增強(qiáng)了抗原性保存的滅活登革熱病毒的回收率。含有表面活性劑的純化的滅活登革熱病毒的制劑具有減少(例如，在凍干、儲(chǔ)存和重構(gòu)過程中)滅活病毒的非特異性吸附和/或聚集的有利特性。本文公開的組合物可以包含一種或多于一種血清型的登革熱病毒。通常，該組合物包括來自多于一種血清型的多種登革熱病毒，即登革熱血清型1、登革熱血清型2、登革熱血清型3和/或登革熱血清型4(分別為den-1、den-2、den-3、和/或den-4)。例如，組合物可以包含來自不同血清型的登革熱病毒中的兩種、三種或四種不同的病毒。在一個(gè)具體實(shí)例中，該組合物包括四種不同的純化的滅活登革熱病毒，每種不同的血清型能夠引發(fā)對(duì)于每種不同血清型的登革熱病毒特異性的免疫應(yīng)答。因此，該組合物有利地包含四種不同的純化的滅活登革熱病毒，其引起針對(duì)所有den-1、den-2、den-3和den-4的免疫應(yīng)答。一種或多種病毒可以選自野生型病毒(即，從天然存在的分離株的強(qiáng)毒病毒繁殖或者對(duì)應(yīng)于天然存在的分離株的強(qiáng)毒病毒)，或者一種或多種病毒可以選自減毒病毒。選擇的病毒可以是重組病毒。例如，重組病毒可以是嵌合病毒，例如，具有來自登革熱病毒的核酸和來自另一種黃病毒(諸如不同登革熱病毒、黃熱病病毒或日本腦炎病毒)的核酸的病毒。通常，嵌合病毒包括登革熱m和登革熱e蛋白中的一種或兩種。單一組合物可以以任何組合包含一種或多種野生型病毒、一種或多種減毒病毒、一種或多種重組病毒、和/或一種或多種嵌合病毒。可以單獨(dú)或組合使用化學(xué)、物理和/或輻射滅活劑滅活純化的滅活登革熱病毒?？梢酝ㄟ^暴露于甲醛、β-丙內(nèi)酯(bpl)、過氧化氫、紫外線輻射和γ輻射或這些技術(shù)的任何組合滅活純化的滅活登革熱病毒。通常，單次人劑量的免疫原性組合物含有至少0.1μg、0.2μg、至少0.25μg、至少0.3μg、至少0.33μg、至少0.4μg、至少0.5μg、至少1.0μg、或至少2.0μg、或至少3.0μg、或至少5.0μg、或至少10.0μg(或0.1和10.0μg之間的任何量)的每種血清型的病毒。通常，單次人劑量的免疫原性組合物含有不超過100μg的每種血清型的病毒，例如，不超過90μg、或不超過80μg、或不超過75μg、或不超過70μg、或不超過60μg、或不超過50μg、或不超過40μg、或不超過30μg、或不超過20μg、或不超過10μg(或10和100μg之間的任何量)的每種血清型的病毒。例如，單次人劑量的免疫原性組合物可以包括0.1至10μg，或約0.25至5μg，例如，在0.05至2ml的體積中，諸如0.5至1.5ml的體積中進(jìn)行施用。在某些實(shí)施方案中，將一種或多種純化的滅活登革熱病毒吸附到鋁鹽(“alum”)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁或羥基磷酸鋁上。當(dāng)包括多種登革熱病毒時(shí)，每種都可以吸附到相同鋁鹽上，或者不同病毒可以吸附到不同鋁鹽上。因此，在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容涉及含有吸附(例如，預(yù)吸附)到鋁鹽上的至少一種純化的滅活登革熱病毒與緩沖劑和表面活性劑的組合的免疫原性組合物。在本文公開的免疫原性組合物(和由其制備成品免疫原性組合物的原料制品)的背景下，選擇表面活性劑以適合用于施用于受試者，特別是人受試者。在某些實(shí)施方案中，選擇表面活性劑適合用于腸胃外施用，例如，用于肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮或皮內(nèi)施用。適合用于本文公開的登革熱組合物的示例性表面活性劑包括泊洛沙姆表面活性劑，以及適合用于施用于人受試者的其他表面活性劑。因此，合適的表面活性劑(除了泊洛沙姆表面活性劑以外)可以選自：聚山梨醇酯表面活性劑、辛苯昔醇(octoxinol)表面活性劑、聚多卡醇表面活性劑、聚氧乙烯硬脂酸酯表面活性劑、聚氧乙烯蓖麻油表面活性劑、n-辛基葡糖苷表面活性劑、聚乙二醇15羥基硬脂酸酯和它們的組合。在某些實(shí)施方案中，泊洛沙姆表面活性劑特別適合用于其中一種或多種純化的滅活登革熱病毒沒有吸附到鋁鹽上的制劑。泊洛沙姆表面活性劑是聚乙二醇-聚丙二醇線性共聚物。商業(yè)上，這些通常被稱為普朗尼克表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，泊洛沙姆表面活性劑選自聚乙二醇-聚乙二醇共聚物，其平均分子量為至少約1000kd，并且平均分子量不超過約15,000kd。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，免疫原性組合物用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物泊洛沙姆188來配制，其以商標(biāo)pluronic?f68、lutrol?f68和kolliphor?p188進(jìn)行商業(yè)銷售，其平均分子量為8600kd，聚氧丙烯分子量為1800g/摩爾，并且聚氧乙烯含量為80％。組合物(原料制品和免疫原性組合物)還包括一種或多種緩沖劑。登革熱病毒在酸性條件下失去免疫原性，因此選擇緩沖劑以保持ph接近或高于中性。通常選擇一種或多種緩沖劑以維持組合物的ph等于或高于ph6.4，優(yōu)選高于6.8，且最優(yōu)選高于ph7.0，例如等于ph7.4或約ph7.4?？紤]到某些額外組分(例如，某些佐劑)可能需要調(diào)節(jié)緩沖劑的量或選擇緩沖劑，在配制的免疫原性組合物的其他組分的背景下，選擇緩沖劑以維持所需ph。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑包括磷酸鈉和磷酸鉀中的一種或兩種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑包括三(羥甲基)氨基甲烷。(“tris”)。原料制品和免疫原性組合物還可以包括額外組分，諸如一種或多種礦物鹽，例如，以便在所需范圍內(nèi)改變或維持漲度。最通常，該鹽是礦物鹽，諸如氯化鈉。有利地以維持配制的組合物等于或接近等滲所需的量添加此類鹽。精確量取決于制劑中的其他組分，最特別取決于一種或多種緩沖劑的選擇而不同，并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在不進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn)的情況下來確定。本文公開的原料制品和免疫原性組合物還可以包括一種或多種賦形劑，以便在溶液中和/或在加工(例如，凍干)過程中增強(qiáng)純化的滅活登革熱病毒的結(jié)構(gòu)和/或免疫學(xué)穩(wěn)定性(或改變制劑的其他性能，諸如漲度)。在一些實(shí)施方案中，賦形劑包括玻璃形成糖或多元醇。在某些實(shí)施方案中，玻璃形成糖或多元醇選自：蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、山梨醇和乳糖酸、葡萄糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖、乳果糖、麥芽糖、乳糖、異麥芽糖、麥芽糖醇、帕拉金糖醇(palatinit)、水蘇糖、松三糖、葡聚糖或它們的組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，賦形劑包括蔗糖。任選地，糖或多元醇可以與氨基酸，諸如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸和/或谷氨酰胺組合使用。在某些實(shí)施方案中，組合物是液體制劑，例如溶液或懸浮液。在其他實(shí)施方案中，組合物是凍干制備的，并且在施用前重懸浮。例如，免疫原性組合物可以配制在等滲液體制劑中用于通過注射施用。在某些實(shí)施方案中，免疫原性組合物配制用于施用于人受試者。對(duì)于施用于人受試者，可以將免疫原性組合物配制為至少0.05ml和不超過2ml的單次劑量，諸如0.5至1.5ml的單次劑量。任選地，本文公開的免疫原性組合物可以包括佐劑。在一些實(shí)施方案中，例如，其中純化的滅活登革熱病毒吸附到鋁鹽上的實(shí)施方案中，鋁鹽充當(dāng)佐劑。在其他實(shí)施方案中，佐劑是不含鋁的佐劑。無論是否與鋁鹽組合，例如，吸附到鋁鹽上，佐劑都可以包括一種或多種免疫刺激性組分。免疫刺激性組分可以包括以下中的一種或多種：油和水乳劑、脂質(zhì)體、脂多糖、皂苷和寡核苷酸，如下文更詳細(xì)地描述。本公開內(nèi)容的另一個(gè)方面涉及用于配制包含一種或多種純化的滅活登革熱病毒的原料抗原制品和免疫原性組合物的方法。此類方法包括：提供包含緩沖劑和表面活性劑的溶液；并且將一種或多種純化的滅活登革熱病毒與溶液混合。在一些實(shí)施方案中，將一種或多種純化的滅活登革熱病毒吸附到鋁鹽上(例如，以產(chǎn)生預(yù)吸附的滅活的登革熱病毒的原料制品)，然后與溶液混合。通常，將單一株的純化的滅活登革熱病毒吸附到鋁鹽(例如氫氧化鋁、磷酸鋁或羥基磷酸鋁)上，以產(chǎn)生預(yù)吸附的單一原料。為了產(chǎn)生多價(jià)免疫原性組合物，然后以所需比例(例如，基于重量1:1:1:1，或基于相對(duì)免疫原性進(jìn)行調(diào)整)將個(gè)別單一原料與含有緩沖劑和表面活性劑的溶液組合。通常，將一種或多種純化的滅活登革熱病毒添加至適合(在最終制劑中)用于腸胃外施用的溶液。在一些實(shí)施方案中，溶液是等滲溶液。在一些實(shí)施方案中，溶液還包括一種或多種賦形劑，諸如鹽和/或玻璃形成的糖或多元醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，以連續(xù)順序，將玻璃形成糖或多元醇、緩沖劑、鹽和表面活性劑(如上面所討論的)添加至注射用水(例如，無菌、無內(nèi)毒素的水)。將如上所討論的一種或多種純化的滅活登革熱病毒添加至制備的溶液中。在一些實(shí)施方案中，該方法然后包括凍干含有一種或多種純化滅活的登革熱病毒的溶液(例如，原料制品)，以產(chǎn)生凍干的組合物。在包括凍干免疫原性組合物(例如，用于儲(chǔ)存和/或分配)的實(shí)施方案中，在施用之前，凍干組合物通常懸浮在合適量，例如，0.05-2ml，通常0.5至1.5ml，例如，0.5或1.0或1.5ml的藥學(xué)可接受的溶液(諸如注射用水)中。任選地，藥學(xué)可接受的溶液包括如上文所公開的至少一種免疫刺激性組分。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容涉及用于通過配制如上所述的一種或多種滅活登革熱病毒而減少一種或多種純化的滅活登革熱病毒或含有其的組合物的非特異性吸附和/或聚集的方法。在又另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容涉及用于通過配制如上所述的一種或多種滅活登革熱病毒而增強(qiáng)抗原性保存的一種或多種滅活登革熱病毒或含有其的組合物的回收率。術(shù)語除非另有解釋，本文使用的所有科技術(shù)語與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意義相同。分子生物學(xué)常見術(shù)語的定義可見benjaminlewin,genesv,oxforduniversitypress出版,1994(isbn0-19-854287-9);kendrew等人(編),theencyclopediaofmolecularbiology,blackwellscienceltd.出版,1994(isbn0-632-02182-9);以及roberta.meyers(編),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,vchpublishers,inc.出版,1995(isbn1-56081-569-8)。除非上下文明確另有說明，單數(shù)術(shù)語“一個(gè)(一種)”(“a”、“an”和“the”)包括復(fù)數(shù)指示物。類似地，單詞“或”意味著包含“和”，除非上下文明確另有說明。術(shù)語“多個(gè)(多種)”是指兩個(gè)(種)或更多個(gè)(種)。還應(yīng)當(dāng)理解，給出的核酸或多肽的所有堿基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子質(zhì)量數(shù)值都是近似值，僅用于描述目的。此外，就物質(zhì)(諸如抗原)濃度或水平給出的數(shù)值限制是近似的。因此，當(dāng)濃度被指明是至少(例如)20μg時(shí)，是指濃度應(yīng)理解為至少接近(或者“大約”或“～”)20μg。雖然與本文描述的方法和材料類似或等同的那些方法和材料可以用于實(shí)施或測(cè)試本公開內(nèi)容，以下描述了合適的方法和材料。術(shù)語“包含”意味著“包括”。因此，除非上下文另有要求，單詞“包含”(“comprises”及其變形，諸如“comprise”和“comprising”)理解為表示含有所述化合物或組合物(例如核酸、多肽、抗原)或者步驟，或者一組化合物或步驟；但不排除任何其他化合物、組合物、步驟或化合物、組合物或步驟的組?？s寫“e.g.”來自拉丁文exempligratia，用于本文表示非限制性的實(shí)例。因此，縮寫“e.g.”是術(shù)語“forexample(例如)”的同義詞。為了協(xié)助對(duì)本公開內(nèi)容各個(gè)實(shí)施方案的理解，提供以下術(shù)語解釋。在本公開內(nèi)容的背景下可以給出其他術(shù)語和解釋。滅活登革熱病毒的“原料制品”在本文中是指關(guān)于純化和滅活的最終抗原形式期望施用于受試者的登革熱病毒。原料制品或原料制劑可以進(jìn)一步處理，例如，通過稀釋、濃縮，諸如通過凍干和再懸浮，和/或作為免疫原性組合物或疫苗包裝進(jìn)，例如，多劑量或單劑量小瓶或注射器中用于施用。術(shù)語“純化”(例如關(guān)于病原體或含有病原體諸如登革熱病毒的組合物)是指從組合物中除去那些不希望有的組分的過程。純化是一個(gè)相對(duì)術(shù)語，不要求不需要的組分全部都被從組合物中除去。在疫苗生產(chǎn)的背景下，純化包括諸如離心、透析、離子交換層析和大小排阻層析、親和純化或沉淀的過程。因此，術(shù)語“純化的”不要求絕對(duì)純；而是一個(gè)相對(duì)術(shù)語。因此，例如純化病毒制品是其中病毒比它通常環(huán)境(例如它天然情況下在其中復(fù)制的細(xì)胞或細(xì)胞群或者人工環(huán)境)中更富集的制品?；炯兊牟《局破房梢约兓?，從而使得所需病毒或病毒組分代表制品中總蛋白含量的至少50％。某些實(shí)施方案中，基本純的病毒代表制品中總蛋白含量的至少60％、或至少70％，諸如至少80％、至少85％、至少90％、或者至少95％或以上。或者，病毒制品的純化可以評(píng)估為制劑中污染物諸如宿主細(xì)胞蛋白的減少。因此，基本上純的病毒(例如，純化的滅活登革熱病毒)的制品通常包括少于30%或少于25％的殘余宿主細(xì)胞蛋白。例如，包含純化的滅活登革熱病毒的原料制品或免疫原性組合物可以包括少于20％的殘余宿主細(xì)胞蛋白，或甚至少于15％或10％或更少(例如，基于wt/wt進(jìn)行測(cè)量)的殘余宿主細(xì)胞蛋白。術(shù)語“滅活的”在登革熱病毒疫苗的背景下意味著抗原組分(例如病毒)不能在體內(nèi)或體外復(fù)制。例如，術(shù)語“滅活的”涵蓋已經(jīng)在例如體外復(fù)制，然后利用化學(xué)或物理手段殺死，從而使得再不能復(fù)制的病毒。該術(shù)語還可以包括通過進(jìn)一步加工(例如裂解、分級(jí)等)產(chǎn)生的抗原以及通過重組手段在例如細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的組分。“佐劑”是與在所述試劑不存在的情況下施用抗原相比，能夠增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)生的試劑。常見佐劑包括含有鋁的佐劑，其包含抗原可以吸附其上的礦物質(zhì)懸液(或礦物鹽，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、羥基磷酸鋁)。其他佐劑包括促進(jìn)產(chǎn)生增強(qiáng)的抗原特異性免疫應(yīng)答的一種或多種免疫刺激性組分。免疫刺激性組分包括油和水乳劑，諸如油包水和水包油型(及其變體，包括復(fù)乳劑和可逆乳劑)、糖脂、脂多糖、免疫刺激性核酸(諸如cpg寡核苷酸)、脂質(zhì)體、toll樣受體激動(dòng)劑(特別是，tlr2、tlr4、tlr7/8和tlr9激動(dòng)劑)和這些組分的各種組合。佐劑可以包括免疫刺激性組分的組合?！懊庖咴越M合物”是適合(例如，在試驗(yàn)設(shè)置中)施用于人或動(dòng)物受試者的物質(zhì)組合物，其能夠引發(fā)例如針對(duì)病原體，諸如登革熱病毒的特異性免疫應(yīng)答。因此，免疫原性組合物包含一或多種抗原(例如其整個(gè)純化的病毒或免疫亞單位，例如多肽)或抗原表位。免疫原性組合物還可以包含一或多種其他能夠引發(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的組分，諸如賦形劑、載體和/或佐劑。某些情況下，施用免疫原性組合物以便引發(fā)免疫應(yīng)答以保護(hù)受試者免于病原體引起的癥狀或狀況。某些情況下，在受試者暴露于病原體(例如登革熱病毒)后，通過抑制病原體的復(fù)制來防止(或者治療，例如減少或改善)病原體所導(dǎo)致的癥狀或疾病。在本公開內(nèi)容的背景下，術(shù)語免疫原性組合物理解為涵蓋這樣的組合物，所述組合物是為了引發(fā)針對(duì)登革熱的保護(hù)性或緩解性免疫應(yīng)答的目的而施用于受試者或受試者群體(即疫苗組合物或疫苗)。“免疫應(yīng)答”是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，諸如b細(xì)胞、t細(xì)胞或單核細(xì)胞對(duì)刺激的應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以是導(dǎo)致產(chǎn)生特異抗體(諸如抗原特異性中和抗體)的b細(xì)胞應(yīng)答。免疫應(yīng)答也可以是t細(xì)胞應(yīng)答，諸如cd4+應(yīng)答或cd8+應(yīng)答。某些情況下，應(yīng)答對(duì)特定抗原是特異的(即，“抗原特異性應(yīng)答”)。如果所述抗原來源于病原體，則抗原特異性應(yīng)答是“病原體特異性應(yīng)答”?！氨Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答”是抑制病原體的有害功能或活性、減少病原體感染或者減輕病原體感染所造成的癥狀(包括死亡)的免疫應(yīng)答。保護(hù)性免疫應(yīng)答可以通過噬斑減少試驗(yàn)或者elisa中和分析法中病毒復(fù)制或噬斑形成受到的抑制來測(cè)量，或者通過體內(nèi)測(cè)量對(duì)病原體攻擊的抗性來測(cè)量。“受試者”是活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體。在本公開內(nèi)容的背景下，受試者可以是實(shí)驗(yàn)受試者，諸如非人動(dòng)物，例如小鼠、棉田鼠或非人靈長動(dòng)物?？商娲?，受試者可以是人受試者?！熬彌_劑”是單獨(dú)或組合地增加當(dāng)添加酸或堿時(shí)溶液維持ph或抵抗ph變化的能力的化合物或組合物。術(shù)語緩沖劑包括各種各樣的化合物和組合物，通常，是弱酸或弱堿，當(dāng)分別與它們的共軛堿或酸存在時(shí)，其可以用來將ph維持在所需值或在所需范圍內(nèi)?！氨砻婊钚詣被虮砻婊钚詣┦翘卣髟谟谟H水性頭部和疏水性尾部的兩親性分子。當(dāng)被吸附在液體表面上時(shí)，表面活性劑的作用是降低液體的表面張力，兩種液體之間的界面張力，或液體和固體之間的張力。表面活性劑可以充當(dāng)去污劑、潤濕劑、乳化劑、發(fā)泡劑和/或分散劑。本文公開的組合物包含一或多種純化的滅活登革熱病毒抗原。在各個(gè)方面，組合物是制備的滅活登革熱病毒的原料制品，例如在液體制劑中，在選擇規(guī)模的固體(例如，凍干)制品，或者配制用于施用于受試者(通常是人受試者)的免疫原性組合物。例如，原料制品(無論液體或固體)和/或免疫原性組合物可以包含單一株的登革熱病毒(即單價(jià)組合物，諸如單價(jià)原料制品或單價(jià)免疫原性組合物)，或者它們可以含有多于一株登革熱病毒(即多價(jià)組合物，諸如多價(jià)原料制品或多價(jià)免疫原性組合物)。通常，多價(jià)組合物含有選自不同血清型的病毒株。因?yàn)橛兴姆N可以引起疾病的登革熱病毒血清型，即登革熱1型(den-1)、登革熱2型(den-2)、登革熱3型(den-3)和登革熱4型(den-4)，而且因?yàn)榻徊娣磻?yīng)性非中和抗體傾向?qū)е赂鼑?yán)重形式的登革熱疾病，為了保證保護(hù)免于四種血清型中任何一種引起的疾病，可以給每種血清型選擇一個(gè)代表包括到原料制品(bulkpreparation)和最終疫苗中。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物是包含選自登革熱病毒四種血清型的每一種的病毒株的四價(jià)組合物。用作抗原的病毒可以選自基本上一株或多株任何登革熱病毒。例如，可以基于與血清型給定(例如共有)序列的一致性給每個(gè)血清型選擇病毒株，所述給定序列是諸如den-1共有序列、den-2共有序列、den-3共有序列或den-4共有序列。此類病毒可以是天然存在的或合成的。例如，可以選擇與疫苗要施用的區(qū)域或群體中流行的病毒株(例如，天然存在或“野生型”病毒株)有關(guān)的病毒株。另一個(gè)選擇是根據(jù)可得性或以前的經(jīng)驗(yàn)方便地選擇每種血清型的病毒株。例如，美國專利號(hào)6,254,873中描述了示例性病毒株，該專利通過引入并入本文。其他合適的病毒株在例如美國專利號(hào)7,226,602中描述，該專利也通過引入并入本文。在例如vbrc病毒基因組數(shù)據(jù)庫(http://athena.bioc.uvic.ca/organisms/flaviviridae/dengue/curated_genes)和登革熱病毒數(shù)據(jù)庫(http://www.broad.mit.edu/annotation/viral/dengue/projectinfo.html)中可以找到其他病毒株。在純化的滅活登革熱病毒疫苗的背景下，可以使用強(qiáng)毒株或減毒株。通常強(qiáng)毒株在宿主細(xì)胞內(nèi)可以繁殖到更高滴度，有助于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。但是，強(qiáng)毒株需要在操作時(shí)特別注意以防止參與生產(chǎn)的人員被感染。減毒株，例如通過適應(yīng)在培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生、選擇減弱的毒性和/或在登革熱的蚊子媒介中復(fù)制下降而建立起來的減毒株，需要較少的預(yù)防措施但可能很難制備。適合在含有滅活登革熱病毒的免疫原性組合物的情況下使用的示例性減毒株在wo2000/057907和美國專利號(hào)6,638,514,以及wo2000/058444和us6,613,556、wo2002/066621(美國公開號(hào)2004052818),wo2000/057904(美國專利號(hào)6,528,065、wo2000/057908、wo2000/057909(美國專利號(hào)no.6,511,667)；wo2000/057910(美國專利號(hào)6,537,557)、wo2002/095075(例如，美國專利號(hào)7,226,602)和wo2002/102828(美國專利號(hào)7,569,383)中描述，這些專利均通過引用并入本文。嵌合“登革熱”病毒也適用于本文公開的制劑的背景下。此類嵌合病毒通常表達(dá)登革熱病毒包膜蛋白，例如，使用不同登革熱病毒或不同黃病毒，諸如黃熱病病毒或日本腦炎病毒的核酸骨架。嵌合登革熱病毒的實(shí)例可見，例如，wo98/37911(美國專利號(hào)6,696,281；6,962,708)、wo96/40933和wo2001060847(美國專利號(hào)7,094,411；7,641,909；8,025,887)和ep1159968。用于產(chǎn)生此類嵌合登革熱病毒的方法也可見wo03/101397。出于提供適合用于本文公開的制劑和方法的背景下使用的示例性嵌合登革熱病毒的目的，這些公開的申請(qǐng)和專利的公開內(nèi)容通過引用并入本文。因此，所選一種或多種病毒株一般從可供在適合生產(chǎn)人使用材料的細(xì)胞(例如，認(rèn)證為不含病原體的細(xì)胞)中復(fù)制的大量病毒株中進(jìn)行選擇。例如，可以對(duì)病毒株進(jìn)行篩選來鑒定那些能夠在所選細(xì)胞系中生長至最高滴度的病毒，例如至少大約5x106pfu/ml的滴度，優(yōu)選至少1x107pfu/ml或更高的滴度；(ii)選擇登革熱病毒中那些在所選細(xì)胞系中能夠生長至最高滴度的病毒株；和(iii)通過再在所選細(xì)胞系中傳代一次到幾次使那些選擇的病毒株進(jìn)一步適應(yīng)提高生長。選擇的病毒(例如，從登革熱病毒四種血清型中選擇的)可以通過另外的細(xì)胞培養(yǎng)傳代或者通過基因操縱使之進(jìn)一步適應(yīng)生長至高滴度，從而制備高滴度主病毒株和生產(chǎn)種子批次。產(chǎn)生一種或多種登革熱病毒的方法是本領(lǐng)域已知的，并且在以下中詳細(xì)描述足以指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，例如，公開的pct申請(qǐng)?zhí)杦o2010/094663、美國公開號(hào)2011318407。用于在無血清條件下產(chǎn)生病毒的方法也可見，例如，美國公開號(hào)20060183224。這些公開的專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用并入本文，以提供關(guān)于繁殖和純化用于包括在本文公開的原料制品和免疫原性組合物中的登革熱病毒的其他細(xì)節(jié)。類似地，用于滅活登革熱病毒以產(chǎn)生純化的滅活登革熱病毒的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括暴露于化學(xué)、物理和/或輻射劑。合適的方法包括，例如，暴露于甲醛、β-丙內(nèi)酯(bpl)、過氧化氫、紫外線輻射和γ輻射或它們的組合。此類方法的細(xì)節(jié)可見，例如，公開的pct申請(qǐng)?zhí)杦o2010/094663(美國公開號(hào)2011318407)，和美國公開號(hào)20070031451，其出于說明滅活登革熱病毒的示例性方法的目的通過引用并入本文。用于純化登革熱病毒的示例性程序描述于圖2a-d的流程圖中。為了產(chǎn)生適合于商業(yè)用途的量的登革熱病毒，易感細(xì)胞系生長在合適培養(yǎng)基中的體外培養(yǎng)物中。通常，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如腎或肺上皮細(xì)胞。存在幾種合適的細(xì)胞系，例如，非洲綠猴腎細(xì)胞，諸如vero細(xì)胞、mrc-5細(xì)胞、mdck細(xì)胞和frhl-2細(xì)胞?？商娲?，可以使用昆蟲細(xì)胞，特別是蚊子細(xì)胞，諸如白紋伊蚊細(xì)胞系c6/36。細(xì)胞可以培養(yǎng)在含血清培養(yǎng)基或無動(dòng)物成分的培養(yǎng)基(af培養(yǎng)基)中。任選地，培養(yǎng)基最初或定期補(bǔ)充添加劑，諸如葡萄糖、氨基酸、合成的生長因子或其他蛋白。將細(xì)胞擴(kuò)增，通常是通過一系列漸增的容器大小(例如，175cm2燒瓶；cf2(1200cm2)；cf10(6000cm2)；cf40(50l生物反應(yīng)器)；200l生物反應(yīng)器)。在較大容器大小，通常采用懸浮的微載體用于細(xì)胞結(jié)合。任選地，通過灌注提供培養(yǎng)基，或者可以定期為培養(yǎng)物進(jìn)料。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是vero細(xì)胞，其可以在商業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞按比例生長至所需密度，并且用病毒感染(例如，選擇以提供den-1、den-2、den-3和/或den-4的抗原決定簇的病毒株)。用選擇的病毒以合適的moi(例如，0.01-0.1moi，例如0.05moi)感染細(xì)胞。當(dāng)采用含有血清的培養(yǎng)基用于預(yù)培養(yǎng)和/或感染時(shí)，可以將培養(yǎng)基替換為af培養(yǎng)基，以減少在收獲和純化階段過程中外來蛋白含量。例如，在1至4天、例如約2天的初始感染階段之后，將培養(yǎng)基替換為af培養(yǎng)基。任選地，af培養(yǎng)基最初或定期補(bǔ)充葡萄糖、氨基酸等。在合適期間病毒生長(例如，最少6天和8天)之后，從細(xì)胞收獲病毒。任選地，可以在感染后約6天后開始，以一定時(shí)間間隔(例如2天的時(shí)間間隔)增量收獲病毒。收獲可以有利地繼續(xù)幾天、例如高達(dá)第10天，諸如直到第12天或第14天或更長時(shí)間的期間。澄清含有病毒的培養(yǎng)基，通常通過一系列漸降的孔徑(例如，8μ、0.6μ、0.45μ、0.2μ)。合適的商業(yè)可獲得的濾器和過濾裝置是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以由技術(shù)人員來選擇。示例性過濾裝置包括，例如，millipore?millistak?d0hc和sartobran?p過濾裝置。任選地，如果需要，澄清的病毒收獲物可以儲(chǔ)存在-70℃。然后濃縮病毒懸浮液(例如，20-50x或更多，諸如30x或40x)，并且將培養(yǎng)基替換為合適的緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，125mm檸檬酸鹽，ph7.6)，例如，通過超濾和滲濾。在該階段和在整個(gè)純化中選擇的緩沖劑被選擇來在加工過程中維持ph、減少聚集和保存病毒的抗原性。本文所示的緩沖劑僅為實(shí)例，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員出于所示目的選擇可替代的緩沖劑。初始濃縮和緩沖液替換隨后為進(jìn)一步過濾和大小排阻層析(sec)，使用，例如，sephacryls-400hr或sepharose4ff樹脂。任選地，在進(jìn)一步處理之前，在濃縮步驟之前或之后，將澄清的病毒懸浮液通過暴露于uv輻射(100-500j/m2之間，例如200j/m2)而滅活。任選地，所述大小排阻層析法步驟隨后為一個(gè)或多個(gè)步驟，以去除殘留核酸，諸如細(xì)胞dna。出于該目的，一種合適的方法是膜層析，例如，sartobind-q膜層析法(以負(fù)模式)和過濾。通常優(yōu)選將殘余dna降低到少于或等于100pgdna/μg蛋白(或降低到少于100pg/劑量)。有利地，在該階段，在滅活之前，可以將選擇用于包含在原料制品和/或免疫原性組合物中的表面活性劑諸如如本文公開的泊洛沙姆表面活性劑添加至緩沖液?；蛘?，可以在滅活之后將表面活性劑添加至緩沖液。然后通過本領(lǐng)域已知的任何一種或多種方法，包括通過化學(xué)滅活和/或通過輻射將病毒滅活?；瘜W(xué)滅活，例如，通過甲醛，β-丙內(nèi)酯(bpl)或通過過氧化氫已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述用于登革熱病毒的滅活，并且可以用來在本文公開的制劑的背景下提供純化的滅活登革熱病毒。例如，通過在室溫暴露于甲醛(約100μg/ml)通常7至10天之間的期間而將該病毒滅活。任選地，將懸浮液在滅活過程期間的中間時(shí)間點(diǎn)，諸如第2天、第3天、第4天、或第5天過濾(例如，0.22μ)，以去除聚集物并改善甲醛暴露。滅活的化學(xué)方式可以單獨(dú)或組合使用。可替代地，或與一種或多種化學(xué)方式組合，該病毒可以通過輻射(例如uv或γ輻射)滅活。然后去除或中和甲醛或其他化學(xué)滅活化合物(例如，在甲醛的情況下，用亞硫酸氫鈉)?？梢圆捎贸瑸V/滲濾以去除化學(xué)滅活劑，然后將純化的病毒置于合適的緩沖液中用于隨后配制。然后將純化的滅活登革熱病毒最終無菌過濾以產(chǎn)生滅活登革熱病毒的原料制品。任選地，將蔗糖添加至原料制品的最終制劑中。如果期望，最終的原料制品可以儲(chǔ)存在，例如，-70℃。如本文所述，配制選擇的純化滅活病毒以產(chǎn)生原料制品和免疫原性組合物，所述原料制品和免疫原性組合物是穩(wěn)定且具有免疫原性，并且可以以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，而在凍干和重構(gòu)過程中不具有以前獲得的方法和制劑觀察到的顯著損失。上述方法可以導(dǎo)致純化的滅活登革熱病毒制品是至少70％、通常至少80％的登革熱病毒材料。該制品含有少于25％，并且通常少于20％宿主細(xì)胞蛋白。此外，根據(jù)上述方法，純化的滅活登革熱病毒的回收率得到顯著增強(qiáng)，從而使得大于90％(或大于95％)的病毒材料被回收在最終制品中。即，在滅活純化的原料的最終0.2μ過濾之后觀察到少于10％或甚至少于5％病毒材料的損失。因此，本公開內(nèi)容尤其提供了用于減少純化的滅活登革熱病毒的非特異性吸附和/或聚集中的至少一種的方法和用于根據(jù)公開的方法通過配制的滅活登革熱病毒而增強(qiáng)抗原性保存的滅活登革熱病毒的回收率的方法。在某些實(shí)施方案中，在與溶液混合之前，將一種或多種純化的滅活登革熱病毒吸附到鋁鹽上，以產(chǎn)生預(yù)吸附的滅活登革熱病毒的原料制品。將登革熱病毒與鋁鹽在溶液中組合，并允許與鋁顆粒接觸一定時(shí)間，所述時(shí)間允許滅活病毒吸附至鋁顆粒。合適的鋁鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、羥基磷酸鋁和硫酸鋁鉀。通常，將每種選擇的病毒獨(dú)立地吸附至鋁上以允許經(jīng)驗(yàn)性優(yōu)化病毒：鋁比例。在一個(gè)有利的實(shí)例中，將每種選擇的登革熱病毒單獨(dú)吸附至氫氧化鋁上以產(chǎn)生鋁鹽吸附的單一原料，然后用免疫原性組合物的其他組分進(jìn)行配制?？商娲?，將每種選擇的登革熱病毒吸附至磷酸鋁或另一種藥學(xué)可接受的鋁鹽上。如果需要，可以以所需比例組合純化的滅活登革熱病毒，然后作為混合物吸附至選擇的鋁鹽上?？商娲?，可以如下所述將純化的滅活登革熱病毒重懸浮在含有選擇的鋁鹽的溶液中，而不是預(yù)吸附到鋁鹽上。在本文公開的制劑的背景下，其中混合純化的滅活登革熱病毒(任選預(yù)吸附到鋁鹽上)的溶液含有緩沖劑。即，如下所討論，所述溶液是能夠抵抗否則可能由將其他組分添加至制劑或用于施用的免疫原性組合物的最終制品引起的ph變化的緩沖溶液。登革熱病毒對(duì)酸性ph敏感，在酸性ph下，重要的免疫表位可能丟失，減少了純化的滅活病毒抗原引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。因此，選擇緩沖劑以維持ph等于或接近中性或等于微堿性ph。為了改善在一些制劑中的最終ph，選擇緩沖劑以促進(jìn)初始制劑中的ph(例如，在添加某些組分諸如可以具有酸性ph的佐劑之前)高于施用于受試者的最終組合物中期望的ph。因此，選擇緩沖劑(或緩沖劑的組合)以維持ph等于或高于ph6.4。更優(yōu)選地，選擇緩沖劑以保持ph等于或高于ph6.8，最優(yōu)選地，選擇緩沖劑以保持ph等于或高于中性，例如，等于或接近7.4的生理ph，并且在一些情況下等于或高于ph7.5，諸如等于或高于ph8.0，或甚至ph8.5。合適的緩沖劑包括碳酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、葡糖酸鹽和酒石酸鹽緩沖劑、以及更復(fù)雜的有機(jī)緩沖劑。在某些實(shí)例中，緩沖劑包括含有磷酸鈉和/或磷酸鉀的磷酸鹽緩沖劑。通常，此類緩沖劑或系統(tǒng)包括磷酸鈉和磷酸鉀兩者，其比例選擇以實(shí)現(xiàn)所需ph。在另一個(gè)實(shí)例中，緩沖劑含有配制以實(shí)現(xiàn)所需ph的三(羥甲基)氨基甲烷或“tris”。配制緩沖劑至所需ph的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可以基于所需ph在不需要過多實(shí)驗(yàn)的情況下確定合適組成。在本文公開的原料制品和免疫原性組合物的配制中，含有一種或多種純化的滅活登革熱病毒的溶液還包括表面活性劑。許多表面活性劑是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于藥物制劑中。選擇本文公開的制劑的背景下的表面活性劑以保留純化的滅活登革熱病毒的免疫學(xué)特性(例如，構(gòu)象和免疫表位)，同時(shí)增強(qiáng)制劑的穩(wěn)定性和增強(qiáng)回收率，例如，通過減少病毒的非特異性吸附和/或聚集。表面活性劑是兩親性分子，具有主要親水性的“頭部”和疏水性“尾部”。表面活性劑可以根據(jù)它們的頭部和尾部部分的組成進(jìn)行分類?；谒鼈冾^部部分的特征，表面活性劑可分為：非離子型(不帶電荷)或離子型(帶電荷)。離子表面活性劑可分為陰離子型(帶負(fù)電荷)、陽離子型(帶正電荷)和兩性型，例如，兩性離子型(2個(gè)帶相反電荷的基團(tuán))。表面活性劑可以根據(jù)它們尾部部分的組成進(jìn)行分類。合適的表面活性劑包括具有烴(例如芳烴、烷烴、烯烴、環(huán)烷烴和炔烴)尾部；烷基醚尾部、乙氧基化(聚環(huán)氧乙烷)尾部；丙氧基化(聚環(huán)氧丙烷)尾部的表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，選擇的表面活性劑是兩性離子型表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面活性劑是可注射的表面活性劑。在即用制劑的背景下，一種合適種類的表面活性劑包括泊洛沙姆表面活性劑。如圖1圖示說明，泊洛沙姆是由中央聚氧丙烯(聚環(huán)氧丙烷)疏水鏈和側(cè)翼的兩個(gè)聚氧乙烯(聚環(huán)氧乙烷)親水鏈構(gòu)成的非離子型三嵌段共聚物。泊洛沙姆也已知為商品名pluronics?，并且這些中的某些以商品名lutrol?或kolliphor?進(jìn)行銷售。泊洛沙姆表面活性劑特別適用于其中一種或多種純化的滅活登革熱病毒沒有吸附到鋁鹽上的制劑。在某些實(shí)施方案中，泊洛沙姆表面活性劑選自室溫下為固體形式的聚乙二醇-聚乙二醇共聚物，例如平均分子量為至少約4500kd，并且平均分子量不超過約15,000kd。例如，泊洛沙姆表面活性劑可以選自pluronic?f108、pluronic?f127、pluronic?f188、pluronic?f38、pluronic?f68、pluronic?f77、pluronic?f87、pluronic?f88、和pluronic?f98。各種pluronic?表面活性劑也以商品名lutrol?(現(xiàn)在為kolliphor?)進(jìn)行銷售。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，免疫原性組合物用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物來配制，其稱為pluronic?f68或lutrol?f68(kolliphor?p188)，其平均分子量為8600kd，聚氧丙烯分子量為1800g/摩爾，并且聚氧乙烯含量為80％?；蛘撸梢圆捎迷谑覝叵聻楦酄罨蛞后w形式的泊洛沙姆表面活性劑，例如，分子量至少約1000kd，諸如pluronic?l10、pluronic?l101、pluronic?l121、pluronic?l31、pluronic?l35、pluronic?l43、pluronic?l44、pluronic?l61、pluronic?l62、pluronic?l64、pluronic?l81、pluronic?l92、pluronic?p103、pluronic?p104、pluronic?p105、pluronic?p123、pluronic?p65、pluronic?p84或pluronic?p85。在本文公開的制劑的背景下，除了上述泊洛沙姆表面活性劑以外，合適表面活性劑的其他實(shí)例包括選自以下的表面活性劑：泊洛沙姆、聚乙二醇15羥基硬脂酸酯、聚山梨醇酯、辛苯昔醇、聚多卡醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、n-辛基-葡糖苷和它們的組合?？梢砸灾辽?.0001％和高達(dá)1.0％的量將表面活性劑可以添加至制劑中。例如，可以以至少0.0005％和高達(dá)0.5％，諸如0.001至0.2%，例如，以0.0005%、或0.001%、或0.005%、或0.01%、或0.025%、或0.05%、或0.1%、或0.2%、或0.3%、或0.4%、或0.5%、或高達(dá)1.0%(或任何中間量)的濃度添加表面活性劑。這些濃度作為初始制劑中的重量/體積給出。但可以理解，在下面討論的實(shí)施方案中(其中將組合物凍干和/或凍干和重懸浮)，可以根據(jù)待施用于受試者的最終制劑的濃度或稀釋倍數(shù)基于重量/重量(對(duì)于固體組合物)重新計(jì)算和/或調(diào)整精確量。通常，最終量計(jì)算在允許每日暴露(pde)之內(nèi)。例如，對(duì)于pluronic?f68，接受的pde是注射150μg/每劑量。因此，最終制劑中的濃度可以根據(jù)待施用以實(shí)現(xiàn)可接受的pde的體積而變化。在一些實(shí)施方案中，本文公開的制劑包括額外的藥學(xué)可接受的組分來改變?nèi)芤旱臐q度、粘度、穩(wěn)定性、同質(zhì)性等。例如，溶液(和因此，制劑)可以包括一種或多種鹽。最通常，該鹽是氯化鈉。然而，如其他藥學(xué)可接受的鹽和離子一樣，也可以使用其他礦物鹽和離子，例如，鉀、鈣、鎂、錳、鋅的鹽。藥學(xué)可接受的鹽和它們的選擇是充分討論的，例如，pharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse,修訂第二版,p.heinrichstahl(編輯),camilleg.wermuth(編輯),wiley,2011。在一些實(shí)施方案中，溶液含有至少一種額外的賦形劑或載體。例如，溶液(和因此，制劑)可以包括至少一種糖或多元醇(或它們的組合)，包括碳水化合物和非碳水化合物多元醇，例如玻璃形成的糖和多元醇。通常選擇賦形劑以便在不明顯損失免疫的重要表位的情況下保存滅活登革熱病毒。合適的賦形劑的實(shí)例包括糖、糖醇和碳水化合物衍生物。碳水化合物包括，但不限于，單糖、二糖、三糖、寡糖和它們對(duì)應(yīng)的糖醇、多羥基化合物，諸如碳水化合物衍生物和化學(xué)修飾的碳水化合物、羥乙基淀粉和糖共聚物。天然和合成的碳水化合物都適合使用。合成的碳水化合物包括，但不限于，糖苷鍵被硫醇或碳鍵替代的那些碳水化合物?？梢允褂锰妓衔锏膁和l型兩者。碳水化合物可以是非還原性或還原性的。當(dāng)使用還原性碳水化合物時(shí)，優(yōu)選添加美拉德反應(yīng)(maillardreaction)的抑制劑。適合用于本發(fā)明中的還原性碳水化合物是本領(lǐng)域已知的那些，包括，但不限于，葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麥芽酮糖和乳果糖。非還原性碳水化合物包括，但不限于，選自糖醇和其他直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原性糖苷。其他有用的碳水化合物包括棉子糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖、蔗糖、纖維二糖、甘露二糖和糖醇。糖醇糖苷優(yōu)選為單糖苷，特別是通過還原二糖諸如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖獲得的化合物。通常，賦形劑選自碳水化合物(或其衍生物)，包括葡萄糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖、乳果糖、乳糖酸、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、異麥芽糖、甘露糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、山梨醇、帕拉金糖醇、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、甘露糖或葡聚糖、或它們的組合。在某些實(shí)例中，玻璃形成糖或多元醇選自：蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、山梨醇和乳糖酸、葡萄糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖、乳果糖、麥芽糖、乳糖、異麥芽糖、麥芽糖醇、帕拉金糖醇、水蘇糖、松三糖、葡聚糖或它們的組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，賦形劑是蔗糖。包括在溶液中的糖或多元醇的濃度可以為1％至50％重量/體積，諸如1-10%(例如1-5%、3-7%、5-10%、或任何中間間隔)，或10-15%、15-20%、20-25%或25-50%，最優(yōu)選小于或等于5%或小于或等于10%(w/v)?？商娲兀虼送?，賦形劑可以包括氨基酸，諸如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺，盡管可以包括任何氨基酸或氨基酸的組合、肽、水解蛋白或蛋白諸如血清白蛋白。示例性的制劑組合物提供在表1中。緩沖劑ph(+/10.1)5mmna/k2po4,50mmnacl7.65mmna/k2po4,50mmnacl,0.1%泊洛沙姆188,3%蔗糖7.610mmna/k2po4,0.1%泊洛沙姆188,3%蔗糖7.65mmk/k2po4,10mm檸檬酸鹽,0.1%泊洛沙姆188,3%蔗糖7.6pbs,125mm檸檬酸鹽7.65mmtris,5mm馬來酸鹽,0.1%泊洛沙姆188,3%蔗糖7.55mmtris,50mmnacl,0.1%泊洛沙姆188,3%蔗糖8.05mmtris,5mm馬來酸鹽,50mmnacl0.1%泊洛沙姆188,3%蔗糖7.510mmna/k2po4,0.1%泊洛沙姆188,1%山梨糖醇7.610mmk/k2po4,0.4%組氨酸,0.1%泊洛沙姆188,1%山梨糖醇7.6在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，緩沖劑包含5mmtris，50mmnacl，任選地包含表面活性劑，例如，泊洛沙姆188和糖，例如蔗糖。盡管如此，將理解的是，本文提供的緩沖劑實(shí)例并不旨在由特定組分或由作為實(shí)例提供的具體組合進(jìn)行限制。通常，通過將各種組分添加至不含內(nèi)毒素的水(例如，無菌水)中而制備其中配制一種或多種純化的滅活登革熱病毒的溶液。例如，通過將以下組分添加至不含內(nèi)毒素的水中而制備其中添加一種或多種純化的滅活登革熱病毒的溶液：玻璃形成糖或多元醇；緩沖劑；鹽；和表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，以以下順序依次添加組分：玻璃形成糖或多元醇；緩沖劑；鹽；和表面活性劑。組分可以是無菌的，和/或溶液可以是滅菌的，例如，通過過濾或其他方便的方法。在一種或多種純化的滅活病毒是含有包括在最終制劑中的一種或多種組分的溶液時(shí)，可以將所述量調(diào)整至最終原料制品或免疫原性組合物的選擇濃度。額外藥學(xué)可接受的載體和賦形劑也可以包括在制劑中，此類載體和賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且描述于，例如，remington’spharmaceuticalsciences,e.w.martin,mackpublishingco.,eastonpa，第5版。在某些實(shí)施方案中，將純化的滅活登革熱病毒添加至含有如上所述的緩沖劑和表面活性劑(和任選的額外組分)的溶液中之后，配制的免疫原性組合物作為液體儲(chǔ)存，例如，在室溫下，在0-4℃，或低于0℃，諸如在-20℃或約-20℃，或在約-70℃至-80℃?？商娲?，將配制的組合物干燥，例如通過凍干以產(chǎn)生干燥的或凍干的組合物。干燥(通過從制劑蒸發(fā)溶劑)可以通過凍干來完成。凍干在真空下在溶劑/溶質(zhì)混合物上進(jìn)行，導(dǎo)致溶劑的升華，并且留下一種或多種干燥溶質(zhì)，包括一種或多種純化的滅活登革熱病毒和制劑的其他組分。小于100μbar的任何壓力可能是合適的。通常至少約500mbar的真空足以促進(jìn)溶劑的有效蒸發(fā)，并且至少約6mbar的真空足以促進(jìn)溶劑的有效升華。盡管壓力可以進(jìn)一步降低，但是這樣做對(duì)干燥速率的影響很小，并且在非常低的壓力條件下，升華效率降低。盡管去除溶劑可以簡(jiǎn)單地通過將液體樣品置于真空室中而進(jìn)行，但是發(fā)泡或起泡可以導(dǎo)致產(chǎn)品損失，以及產(chǎn)品同質(zhì)性或免疫原性的降低。為了防止發(fā)泡或起泡，配制的免疫原性組合物首先可以冷凍，然后通過在真空下升華，即，通過凍干或冷凍干燥去除溶劑。一種示例性程序描述在實(shí)施例3中。因此，在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供滅活的登革熱病毒的凍干制品，其含有至少一種純化的滅活登革熱病毒和表面活性劑，諸如上面公開的表面活性劑，例如泊洛沙姆表面活性劑等。在一些情況下，凍干制品含有鋁鹽，諸如氫氧化鋁或磷酸鋁。例如，可以將一種或多種純化的滅活登革熱病毒吸附到鋁鹽上。凍干制品還可以包括至少一種充當(dāng)緩沖劑的組分，和/或玻璃形成糖和玻璃形成多元醇中的至少一種。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于上述公開內(nèi)容將認(rèn)識(shí)到進(jìn)一步的實(shí)施方案和替代方案。在其中配制的組合物是干燥的實(shí)施方案中，通常在施用(例如，作為可注射的液體)前將干燥組合物懸浮在藥學(xué)可接受的溶劑中。選擇其中混合純化的滅活登革熱病毒的溶液以適合用于藥物施用于人受試者。通常，選擇溶液為對(duì)于腸胃外施用(例如，通過肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮或皮內(nèi)施用)是可接受的。例如，將干燥組合物懸浮在注射用水，例如，無菌、無內(nèi)毒素水中?；蛘撸軇┛梢允撬軇┖陀袡C(jī)溶劑的混合物。在一些實(shí)施方案中，重懸浮的免疫原性組合物是等滲的?；蛘?，如果重懸浮的免疫原性組合物不是等滲的，則可以在施用之前例如通過添加鹽或其他賦形劑將漲度調(diào)節(jié)至等滲或接近等滲。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在凍干之前和任選之后，在相關(guān)情況下，可以根據(jù)方便選擇和調(diào)整體積。根據(jù)例如凍干之前和懸浮之后的制劑免疫原性組合物的相對(duì)體積，制備用于施用的最終組合物可以是較小或較大體積，并且因此可以比本文例舉的制劑濃度更高或更低。此類濃度的調(diào)整可以在無需過多實(shí)驗(yàn)的情況下容易地計(jì)算以滿足偏好。通常，每劑量免疫原性組合物中的病毒量要選擇為在典型患者中能夠誘發(fā)免疫保護(hù)性應(yīng)答(一個(gè)或多個(gè)劑量之后)、但沒有明顯有害副作用的量。該背景下的免疫保護(hù)性不需要是完全保護(hù)免于感染，它是指保護(hù)免于癥狀或疾病，尤其是與病毒相關(guān)的嚴(yán)重疾病?？乖牧靠梢愿鶕?jù)所采用的特定免疫原而變化。抗原含量可以在純化或部分純化的病毒抗原的μg總蛋白含量的方面或通過免疫學(xué)方法，例如，elisa或通過定量免疫印跡法諸如放射免疫擴(kuò)散來測(cè)量。通常，可以預(yù)期每個(gè)人用劑量包含0.01-100μg滅活病毒，諸如至少約0.1μg(例如0.1、0.2、0.25、0.3、0.33、0.4、或0.5μg)到不超過約50μg，例如約0.25μg到約30μg，諸如約0.25μg、0.33μg、0.5μg、1μg、約2μg、約2.5μg、約3μg、約4μg、約5μg、或約10μg(或0.1到10.0μg之間的任何量)的每種血清型病毒。通常，單次人劑量的免疫原性組合物含有不超過約100μg，例如，不超過約90μg、或不超過約80μg、或不超過約75μg、或不超過約70μg、或不超過約60μg、或不超過約50μg、或者不超過40μg、或不超過30μg、或不超過20μg、或不超過10μg(或10和100μg之間的任何量)的每種血清型病毒。例如，單次人劑量的免疫原性組合物可以包括0.10至10μg，或0.25至5μg/每人劑量，或上述個(gè)體參數(shù)定義的任何其他范圍?；谑茉囌呷后w(例如嬰兒)選擇免疫原性組合物中使用的量。特定組合物中的最佳量可以通過標(biāo)準(zhǔn)研究來確定，所述標(biāo)準(zhǔn)研究包括觀察受試者中的抗體效價(jià)和其他應(yīng)答。首次接種疫苗后，受試者可以在合適的間隔后(例如大約4周后)接受一次或多次額外的劑量。通常在至少兩個(gè)劑量的本文所述的免疫原性組合物之后可以導(dǎo)致免疫保護(hù)，并且在一些情況下在適當(dāng)間隔后遞送的兩個(gè)或三個(gè)或更多個(gè)劑量之后導(dǎo)致免疫保護(hù)。在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物包括至少一種免疫刺激性組分或佐劑。在一些情況下，佐劑包括礦物鹽，諸如鋁(alum)鹽，例如硫酸鋁鉀、磷酸鋁或氫氧化鋁。當(dāng)鋁存在時(shí)，該量通常為約100μg至1mg，諸如約100μg，或約200μg至約750μg，諸如約500μg/每劑量。如上所討論，在其中采用鋁鹽的制劑中，可以在配制到本文公開的組合物中之前將一種或多種純化的滅活登革熱病毒預(yù)先吸附到鋁鹽上。可替代地，鋁鹽可以包括在其中凍干的免疫原性組合物被重懸浮或添加至液體組合物中的液體中。除了鋁鹽以外，也可以采用鈣鹽，例如，作為微粒佐劑。可替代地或此外(例如，除了鋁鹽以外)，其中重懸浮干燥制劑的液體可以包括免疫刺激性組分。也可以在施用之前(例如，制備在兩個(gè)小瓶和/或注射器或其他容器中，并且在施用之前混合)，將免疫刺激性組分添加至液體制劑中。例如，當(dāng)免疫原性組合物配制用于肌內(nèi)施用時(shí)，有利地選擇包含3d-mpl、角鯊烯(例如qs21)、脂質(zhì)體、和/或油和水乳劑中的一種或多種的佐劑。適合與純化滅活登革熱病毒抗原組合使用的一種佐劑是無毒的細(xì)菌脂多糖衍生物。合適的脂質(zhì)a無毒衍生物的實(shí)例是單磷酰脂質(zhì)a或更具體而言是3-脫酰基單磷酰脂質(zhì)a(3d-mpl)。3d-mpl由glaxosmithklinebiologicalsn.a.以名稱mpl銷售，在本文件中稱為mpl或3d-mpl。參見例如，美國專利號(hào)4,436,727;4,877,611;4,866,034和4,912,094。3d-mpl主要促進(jìn)具有ifn-γ(th1)表型的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答。3d-mpl可以根據(jù)gb2220211a中公開的方法生產(chǎn)。從化學(xué)上來說，它是具有3、4、5或6個(gè)?；湹?-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)a的混合物。在本發(fā)明的組合物中，可以使用小顆粒3d-mpl。小顆粒3d-mpl的顆粒大小使它能夠經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌。wo94/21292中描述了此類制品。在每個(gè)人劑量的免疫原性組合物中可以使用1-50μg的量的脂多糖，諸如3d-mpl。此類3d-mpl可以以以下水平使用：約25μg，例如20-30μg，合適地21-29μg或22-28μg或23-27μg或24-26μg，或者25μg。另一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含以下水平的3d-mpl，約10μg，例如5-15μg，合適地6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或者10μg。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含以下水平的3d-mpl，約5μg，例如1-9μg，或2-8μg，或者合適地3-7μg或4-μg，或者5μg。在其他實(shí)施方案中，脂多糖可以是如美國專利號(hào)6,005,099和歐洲專利號(hào)0729473b1中描述的β(1-6)葡萄糖胺二糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這些文獻(xiàn)中的教導(dǎo)，很容易制備出各種脂多糖，諸如3d-mpl。不管怎樣，這些文獻(xiàn)均通過引用并入本文。除了以上提到的免疫刺激劑(與lps或mpl或3d-mpl結(jié)構(gòu)相似的)，是以上mpl結(jié)構(gòu)一部分的酰基化單糖和二糖衍生物也是合適的佐劑。在其他實(shí)施方案中，佐劑是脂質(zhì)a的合成衍生物，其中的某些被描述為tlr-4激動(dòng)劑，包括但不限于：om174(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(r)-3-十二?；趸孽；被鵠-4-o-膦酰基-β-d-吡喃葡萄糖基]-2-[(r)-3-羥基十四?；被鵠-α-d-吡喃葡萄糖基二氫磷酸酯)(wo95/14026)；om294dp(3s，9r)-3--[(r)-十二?；趸孽０被鵠-4-氧代-5-氮雜-9(r)-[(r)-3-羥基十四酰基氨基]癸烷-1，10-二醇1，10-雙(二氫磷酸酯)(wo99/64301和wo00/0462)；和om197mp-acdp(3s-，9r)-3-[(r)-十二?；趸孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(r)-3-羥基十四酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(wo01/46127)?？梢耘c一種或多種純化滅活登革熱病毒一起用于免疫原性組合物的其他免疫刺激性組分，例如單獨(dú)或者與3d-mpl或本文描述的另一種佐劑組合使用的其他免疫刺激性組分是皂苷，諸如qs21。lacaille-dubois,m和wagnerh.(1996.areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.phytomedicinevol2pp363-386)提供了關(guān)于皂苷的教導(dǎo)。皂苷是廣泛分布在植物和海洋動(dòng)物界的類固醇或三萜糖苷。皂苷的特點(diǎn)是在水中形成搖動(dòng)后發(fā)泡的膠態(tài)溶液并能沉淀膽固醇。當(dāng)皂苷靠近細(xì)胞膜時(shí)，它們能夠在膜上產(chǎn)生孔樣結(jié)構(gòu)導(dǎo)致膜破裂。紅細(xì)胞溶血即是該現(xiàn)象的一個(gè)實(shí)例，這是某些但并非全部皂苷的屬性。皂苷已知可以作為用于全身性施用的疫苗中的佐劑。各種皂苷的佐劑和溶血活性在本領(lǐng)域中已有廣泛研究(lacaille-dubois和wagner，同前)。例如，quila(來源于南美樹種莫利那肥皂草皂樹(quillajasaponariamolina)的樹皮)及其級(jí)分在us5,057,540和“saponinsasvaccineadjuvants”,kensil,c.r.,critrevtherdrugcarriersyst,1996,12(1-2):1-55；以及ep0362279b1中有描述。包含quila級(jí)分的顆粒結(jié)構(gòu)，被稱為免疫刺激復(fù)合物(immunestimulatingcomplexes，iscoms))是溶血性的，已被用于疫苗制備(morein,b.,ep0109942b1;wo96/11711;wo96/33739)。溶血皂苷qs21和qs17(quila的hplc純化級(jí)分)被描述為強(qiáng)力的全身性佐劑，它們的生產(chǎn)方法在美國專利號(hào)5,057,540和ep0362279b1中公開，所述專利通過引用并入本文。被用于全身性疫苗接種研究的其他皂苷包括來源于其他植物物種，諸如絲石竹屬(gypsophila)和肥皂草屬(saponaria)的皂苷(bomford等人，vaccine,10(9):572-577,1992)。qs21是來源于莫利那肥皂草皂樹皮的hplc純化的無毒級(jí)分。美國專利號(hào)5,057,540中公開了生產(chǎn)qs21的方法。含有qs21的非反應(yīng)性佐劑制劑在wo96/33739中有描述。以上提到的文獻(xiàn)通過引用并入本文。所述免疫活性皂苷，諸如qs21，在每個(gè)人劑量的免疫原性組合物中可以按照1到50μg之間的量使用。有利地是qs21以以下水平使用，約25μg，例如20-30μg，合適地21-29μg或22-28μg或23-27μg或24-26μg，或者25μg。另一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含以下水平的qs21，約10μg，例如5至15μg，合適地6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或者10μg。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含以下水平的qs21，約5μg，例如1-9μg或2-8μg，或者合適地3-7μg或4-6μg，或者5μg。此類包含qs21和膽固醇的制劑已被證實(shí)當(dāng)與抗原一起配制時(shí)是成功的th1刺激佐劑。因此，例如，一種或多種純化滅活登革熱病毒可以適合與包含qs21和膽固醇組合的佐劑一起用于免疫原性組合物中。其他可以使用的tlr4配體是烷基葡萄糖胺磷酸酯(agps)，諸如wo98/50399或美國專利號(hào)6,303,347(還公開了agps的制備過程)中公開的那些，合適的是rc527或rc529或者美國專利號(hào)6,764,840中公開的agps的藥學(xué)可接受鹽。某些agps是tlr4激動(dòng)劑，某些是tlr4拮抗劑。兩種都被認(rèn)為可以作為佐劑使用。其他能夠經(jīng)由tlr-4引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答(sabroe等人，ji2003p1630-5)的合適的tlr-4配體是例如，來自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖及其衍生物或者它們的片段，特別是lps的無毒衍生物(諸如3d-mpl)。其他合適的tlr激動(dòng)劑是：熱休克蛋白(hsp)10、60、65、70、75或90；表面活性蛋白a、透明質(zhì)酸寡糖、硫酸肝素片段、纖連蛋白片段、纖維蛋白原肽和b-防御素-2以及胞壁酰二肽(mdp)。在一個(gè)實(shí)施方案中，tlr激動(dòng)劑是hsp60、70或90。其他合適的tlr-4配體在wo2003/011223和wo2003/099195中有描述，諸如wo2003/011223的第4-5頁或者wo2003/099195的第3-4頁公開的化合物i、化合物ii和化合物iii，特別是wo2003/011223中公開為er803022、er803058、er803732、er804053、er804057、er804058、er804059、er804442、er804680和er804764的那些化合物。例如一種合適的tlr-4配體是er804057。其他tlr激動(dòng)劑也可以作為佐劑使用。術(shù)語“tlr激動(dòng)劑”是指這樣的試劑，所述試劑能夠作為直接配體或者通過產(chǎn)生內(nèi)源或外源配體間接引起經(jīng)由tlr信號(hào)傳導(dǎo)途徑的信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答。這些天然或合成tlr激動(dòng)劑可以作為替代的或額外的佐劑使用。kaisho&akira,biochimicaetbiophysicaacta1589:1-13,2002中提供了tlrs作為佐劑受體的簡(jiǎn)短綜述。這些潛在的佐劑包括，但不限于tlr2、tlr3、tlr7、tlr8和tlr9的激動(dòng)劑。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑和免疫原性組合物進(jìn)一步包含選自tlr-1激動(dòng)劑、tlr-2激動(dòng)劑、tlr-3激動(dòng)劑、tlr-4激動(dòng)劑、tlr-5激動(dòng)劑、tlr-6激動(dòng)劑、tlr-7激動(dòng)劑、tlr-8激動(dòng)劑、tlr-9激動(dòng)劑或它們的組合的佐劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由tlr-1引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由tlr-1引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的合適的tlr激動(dòng)劑選自：三酰基化脂肽(lps)；酚溶性調(diào)節(jié)蛋白；結(jié)核分枝桿菌lp；模擬細(xì)菌脂蛋白乙?；被说膕-(2，3-雙(棕櫚?；趸?-(2-rs)-丙基)-n-棕櫚酰基-(r)-cys-(s)-ser-(s)-lys(4)-oh，三鹽酸(pam3cys)lp；和來自伯氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)的ospalp。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由tlr-2引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由tlr-2引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的合適的tlr激動(dòng)劑是來自結(jié)核分枝桿菌、伯氏疏螺旋體或蒼白螺旋體的脂蛋白、肽聚糖、細(xì)菌脂肽；來自包括金黃色葡萄球菌的種的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏菌孔蛋白、細(xì)菌纖毛、耶爾森氏菌毒力因子、cmv病毒粒、麻疹病毒血凝素以及來自酵母的酵母聚糖中的一種或多種。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由tlr-3引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由tlr-3引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的合適的tlr激動(dòng)劑是雙鏈rna(dsrna)或聚肌胞苷酸(polyic)，后者是與病毒感染相關(guān)聯(lián)的分子核酸模式。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由tlr-5引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由tlr-5引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的合適的tlr激動(dòng)劑是細(xì)菌鞭毛蛋白。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由tlr-6引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由tlr-6引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的合適的tlr激動(dòng)劑是分枝桿菌脂蛋白、二?；痩p和酚溶性調(diào)節(jié)蛋白。其他tlr6激動(dòng)劑在wo2003/043572中有描述。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由tlr-7引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由tlr-7引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的合適的tlr激動(dòng)劑是單鏈rna(ssrna)、洛索立賓(loxoribine，位置n7和c8的鳥嘌呤核苷類似物)或咪唑并喹啉化合物或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，tlr激動(dòng)劑是咪喹莫特(imiquimod)。其他tlr7激動(dòng)劑在wo2002/085905中有描述。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由tlr-8引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由tlr-8引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的合適的tlr激動(dòng)劑是單鏈rna(ssrna)、具有抗病毒活性的咪唑并喹啉分子，例如雷西莫特(resiquimod，r848)。雷西莫特也能被tlr-7識(shí)別。其他可以使用的tlr-8激動(dòng)劑包括wo2004/071459中描述的那些。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由tlr-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠經(jīng)由tlr-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑是hsp90。替代地，能夠經(jīng)由tlr-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的tlr激動(dòng)劑是細(xì)菌或病毒dna，含有未甲基化的cpg核苷酸的dna，在特定序列背景下被稱為cpg基序。含有cpg的寡核苷酸誘發(fā)占優(yōu)勢(shì)的th1應(yīng)答。這些寡核苷酸是眾所周知的，在例如wo96/02555、wo99/33488以及美國專利號(hào)6,008,200和5,856,462中有描述。合適地，cpg核苷酸是cpg寡核苷酸。用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的合適寡核苷酸是含有cpg的寡核苷酸，任選含有被至少3個(gè)，合適的是至少6個(gè)或更多個(gè)核苷酸隔開的兩個(gè)或更多個(gè)二核苷酸cpg基序。cpg基序是胞嘧啶核苷酸和后面的鳥嘌呤核苷酸。本發(fā)明的cpg寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在特定實(shí)施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵是二硫代磷酸酯，或者合適的是硫代磷酸酯鍵，雖然磷酸二酯和其他核苷酸間鍵也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是具有混合的核苷酸間鍵的寡核苷酸。生產(chǎn)硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美國專利號(hào)5,666,153、5,278,302和wo95/26204中有描述。另一類用于具有一種或多種純化滅活登革熱病毒的制劑中的佐劑包括基于omp的免疫刺激性組合物?；趏mp的免疫刺激性組合物尤其適合作為粘膜佐劑，例如用于鼻內(nèi)施用?；趏mp的免疫刺激性組合物是一類來自革蘭氏陰性細(xì)菌(諸如，但不限于奈瑟氏菌)的外膜蛋白(omps，包括某些孔蛋白)制品(參見例如lowell等人,j.exp.med.167:658,1988;lowell等人,science240:800,1988;lynch等人,biophys.j.45:104,1984;lowell,"newgenerationvaccines"第2版,marceldekker,inc.,newyork,basil,hongkong,page193,1997;美國專利號(hào)5,726,292;美國專利號(hào)4,707,543)，其可以作為載體或用在免疫原(諸如細(xì)菌或病毒抗原)組合物中。某些基于omp的免疫刺激組合物可以稱為“蛋白體(proteosomes)”，它們是疏水的并且人可以安全使用。蛋白體有能力自動(dòng)組裝成約20nm到約800nm的囊泡或囊泡樣omp簇，并與蛋白抗原(ags)，特別是含有疏水部分的抗原非共價(jià)地合并、協(xié)作、關(guān)聯(lián)(例如靜電地或者疏水地)，或以其他方式合作。任何導(dǎo)致產(chǎn)生處于囊泡或囊泡樣形式中的外膜蛋白組分的制備方法，包括多分子膜結(jié)構(gòu)或者一或多個(gè)omps構(gòu)成的熔融球狀omp組合物，都包含在蛋白體的定義中。蛋白體可以按照例如現(xiàn)有技術(shù)(參見例如美國專利號(hào)5,726,292或美國專利號(hào)5,985,284)的描述制備。蛋白體還可以含有來自制備omp孔蛋白的細(xì)菌(例如奈瑟氏菌)的內(nèi)源脂多糖或脂肪寡糖(分別是lps或los)，其中脂多糖或脂肪寡糖只占整個(gè)omp制品的2％以下。蛋白體主要由化學(xué)提取的腦膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白(omps)(主要是孔蛋白a和b以及4型omp)組成，利用去污劑保持在溶液中(lowellgh.proteosomesforimprovednasal,oral,orinjectablevaccines.:levinemm,woodrowgc,kaperjb,cobongs,eds,newgenerationvaccines.newyork:marceldekker,inc.1997;193-206)。蛋白體可以與多種抗原通過例如滲濾或常規(guī)透析過程配制，所述抗原諸如來自病毒來源的純化或重組蛋白，包括本文公開的pref多肽。逐漸去除去污劑使得形成直徑約100-200nm的顆粒狀疏水復(fù)合物(lowellgh.proteosomesforimprovednasal,oral,orinjectablevaccines.in:levinemm,woodrowgc,kaperjb,cobongs,eds,newgenerationvaccines.newyork:marceldekker,inc.1997;193-206)。本文使用的“蛋白體：lps或protollin”是指混合蛋白體制品，例如通過外源添加至少一種脂多糖來提供omp-lps組合物(其可以作為免疫刺激性組合物)。因此omp-lps組合物可以由protollin的兩種基本組分構(gòu)成，所述組合物包含(1)由革蘭氏陰性菌，諸如腦膜炎奈瑟氏菌制備的蛋白體的外膜蛋白制品(例如projuvant)，和(2)一種或多種脂多糖的制品。脂肪寡糖可以是內(nèi)源的(例如omp蛋白體制劑天然含有的)，可以與來自外源制備的脂肪寡糖(例如由與omp制品不同的培養(yǎng)物或微生物制備的)的omp制品混合或組合，或者可以是其組合。這些外源加入的lps可以與omp制品來自相同的革蘭氏陰性細(xì)菌，或者來自不同的革蘭氏陰性細(xì)菌。protollin也應(yīng)被理解為任選包含脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白、小分子等，以及它們的組合。protollin可以按照例如美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0044425中的描述進(jìn)行制備。不同佐劑的組合，諸如以上提到的佐劑的組合，也可以與一種或多種純化滅活登革熱病毒一起用于組合物。例如，如已經(jīng)提到的，qs21可以與3d-mpl一起配制。qs21:3d-mpl的比率一般在1∶10到10∶1的水平；諸如1∶5到5∶1，常常基本是1∶1。通常，比率在2.5:1到1:13d-mpl∶qs21的范圍內(nèi)。任選地，此類組合可以是脂質(zhì)體形式。另一種組合佐劑制劑包含3d-mpl和鋁鹽，諸如氫氧化鋁。當(dāng)組合配制時(shí)，這種組合可以增強(qiáng)抗原特異性th1免疫應(yīng)答。某些實(shí)施方案中，佐劑包含油和水乳劑，例如水包油乳劑。水包油乳劑的一個(gè)實(shí)例是在水性載體中包含可代謝油(諸如角鯊烯)和表面活性劑(諸如山梨醇三油酸酯(span85tm)或聚環(huán)氧乙烷山梨醇單油酸酯(tween80tm)或其組合。水性載體可以是例如磷酸鹽緩沖鹽水。某些實(shí)施方案中，水包油乳劑不含有任何其他免疫刺激劑(特別是不含有無毒脂質(zhì)a衍生物，諸如3d-mpl；或皂苷，諸如qs21)。某些實(shí)施方案中，水包油乳劑含有母生育酚(諸如生育酚)，例如α-生育酚。此外，水包油乳劑可以含有卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了疫苗組合物，所述疫苗組合物包含抗原或抗原組合物，和包含水包油乳劑的佐劑組合物，以及任選的一或多種額外的免疫刺激劑，其中所述水包油乳劑包含0.5-10mg可代謝油(合適的有角鯊烯)、0.4-4mg乳化劑和任選地0.5-11mg母生育酚(合適的有生育酚，諸如α-生育酚)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，佐劑制劑包含制備成乳劑，諸如水包油乳劑形式的3d-mpl。某些情況中，乳劑的小顆粒直徑大小如wo94/21292中公開的低于0.2μm。例如，3d-mpl顆粒小到足以經(jīng)0.22微米膜過濾除菌(如歐洲專利號(hào)0689454中描述的)。替代地，3d-mpl可以制備成脂質(zhì)體制劑。任選地，含有3d-mpl(或其衍生物)的佐劑還包含其他免疫刺激性組分。選擇的佐劑在免疫原性組合物施用的群體中是安全有效的。對(duì)于成年和老年群體，制劑含有的佐劑組分通常比嬰兒制劑中的多。當(dāng)含有純化滅活登革熱病毒的免疫原性組合物是配制施用于嬰兒時(shí)，要確定佐劑的劑量在嬰兒受試者中是有效并且相對(duì)沒有反應(yīng)性的。通常，嬰兒制劑中的佐劑劑量比為施用于成年人(例如65歲及以上的成年人)設(shè)計(jì)的制劑中使用的量少(例如劑量可能是待施用于成年人的制劑中提供的劑量的一部分)。例如，3d-mpl在每劑量中的量通常在1μg-200μg的范圍，諸如10-100μg或者10μg-50μg。嬰兒劑量一般在該范圍的較低一端，例如約1μg-約50μg，諸如從約2μg，或約5μg，或約10μg到約25μg或約50μg。通常，當(dāng)制劑中使用qs21時(shí)，范圍是相當(dāng)?shù)?并且根據(jù)以上指出的比率)。對(duì)于油和水乳劑(例如水包油乳劑)的情況，提供給兒童或嬰兒的佐劑劑量可以是施用于成年人受試者的劑量的一部分。因此，配制的免疫原性組合物(包括任何佐劑)適用于施用于人受試者，并且將具有所需免疫原性特性以及可接受的安全性和反應(yīng)原性。通常，將配制的免疫原性組合物配制在至少0.05ml和不超過2ml，諸如0.5至1.5ml的單一劑量中。例如，單一劑量可以是0.5至0.5ml、或0.1至2ml、或0.5至1.5ml的量中，諸如在0.05ml、0.06ml、0.07ml、0.075ml、0.08ml、0.09ml、0.1ml.、0.2ml、0.25ml、0.3ml、0.33ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.66ml、0.7ml、0.75ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml、1.25ml、1.33ml、1.5ml或2ml或任何中間體積的量中。雖然組合物可以通過多種不同途徑施用，最常用的是將免疫原性組合物經(jīng)肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)施用途徑進(jìn)行遞送。通常，可以經(jīng)皮下、皮內(nèi)或者肌內(nèi)以足夠產(chǎn)生中和抗體和保護(hù)作用的劑量施用疫苗。疫苗的施用方式與劑量制劑相容，用量是預(yù)防和/或治療有效的。待施用的量通常在每劑量每株滅活病毒0.05-100μg范圍內(nèi)，取決于待治療的受試者、受試者的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，以及希望達(dá)到的保護(hù)程度。待施用疫苗的準(zhǔn)確量可能取決于醫(yī)務(wù)人員的判斷，對(duì)每個(gè)受試者可能是獨(dú)特的。疫苗可以以單次劑量方案給予，或者優(yōu)選以多個(gè)劑量方案給予，即疫苗接種的主要過程是1-10個(gè)獨(dú)立的劑量，之后根據(jù)維持和/或加強(qiáng)免疫應(yīng)答的需要在隨后的時(shí)間間隔給予其他劑量，例如1-4個(gè)月給予第二個(gè)劑量，并且如果需要，在幾個(gè)月或幾年后給予隨后的劑量。劑量方案還至少部分由個(gè)體的需要決定并取決于醫(yī)務(wù)人員的判斷。合適的免疫接種方案的實(shí)例包括：第一劑量，之后在第7天到6個(gè)月之間給予第二劑量，以及任選在首次接種后1個(gè)月到2年之間給予第三劑量；或者其他足夠引發(fā)賦予保護(hù)性免疫力所期望的病毒中和抗體效價(jià)的方案，例如選擇以對(duì)應(yīng)已建立的兒科疫苗接種方案?？梢院侠淼仡A(yù)期在包含1到3次接種的主要免疫過程后，用滅活病毒疫苗產(chǎn)生針對(duì)登革熱的保護(hù)性免疫力。可以通過以特定間隔(例如每兩年)給予的加強(qiáng)劑量補(bǔ)充這些，所述間隔被設(shè)計(jì)用來維持滿意水平的保護(hù)性免疫力。以下實(shí)施例僅供闡明某些特定特征和/或?qū)嵤┓桨浮＿@些實(shí)施例不應(yīng)被理解為使發(fā)明限于所描述的特定特征或?qū)嵤┓桨?。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，僅僅提供量，例如體積，作為實(shí)例，并且規(guī)模可以根據(jù)操作者的選擇進(jìn)行改變(增加或減少)。類似地，在純化中使用的部件，例如，濾器、柱，并非意在以任何方式限制或排斥，并且可以根據(jù)操作者的判斷替換為其他部件來實(shí)現(xiàn)相同的目的。實(shí)施例實(shí)施例1：用于產(chǎn)生純化的滅活登革熱病毒的純化方法登革熱病毒在vero細(xì)胞中生長，并且基本上如wo2010/094663中所述進(jìn)行純化。例如，登革熱病毒在vero細(xì)胞中、例如在無動(dòng)物成分的培養(yǎng)基中生長。通常，將細(xì)胞保持在固定的預(yù)培養(yǎng)階段(例如，在t型燒瓶或細(xì)胞工廠中)，在無動(dòng)物成分(af)培養(yǎng)基中，諸如從invitrogen可商業(yè)獲得的vpsfm培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞擴(kuò)增在生物反應(yīng)器中，通常結(jié)合到微載體(諸如cytodex1)，并且通過灌注或批處理模式培養(yǎng)。一旦細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到合適密度，在含有血清的培養(yǎng)基(例如，1.5％)或af培養(yǎng)基中用病毒以合適moi(例如，0.01-0.1，例如0.05)感染細(xì)胞。當(dāng)采用含有血清的培養(yǎng)基時(shí)，在初始感染階段(通常約2天)后，該培養(yǎng)基通常替換為af培養(yǎng)基。任選地，af培養(yǎng)基最初或定期補(bǔ)充葡萄糖、氨基酸等。在合適期間病毒生長(例如，最少6天和8天)之后，從細(xì)胞收獲病毒。任選地，可以在感染后約6天后開始，以一定時(shí)間間隔(例如2天的時(shí)間間隔)增量收獲病毒。示例性純化方法示意性地顯示在圖2a中。修改的純化方法示意性地顯示在圖2b中。盡管基本上類似于圖2的方法，但是該方法包括以下修改。用甲醛滅活之后，去除通過添加亞硫酸氫鈉中和原料中的游離福爾馬林的步驟。去除亞硫酸氫鈉中和顯著增加了隨后過濾步驟中的得率。通過滲濾步驟去除游離的福爾馬林。替代純化方法顯示在圖2c和d中。收獲之后，澄清含有病毒的培養(yǎng)基，通常通過一系列漸降的孔徑(例如，8μ、0.6μ、0.45μ、0.2μ)。然后將病毒懸浮液濃縮，培養(yǎng)基更換為緩沖液，例如，通過超濾和滲濾，隨后進(jìn)一步過濾和大小排阻層析(sec)，使用，例如，sephacryls-400hr或sepharose4ff樹脂。任選地，在進(jìn)一步處理之前，在濃縮步驟之前或之后，將澄清的病毒懸浮液通過暴露于uv輻射(100-500j/m2之間，例如200j/m2)而滅活。任選地，所述大小排阻層析法步驟之后為一個(gè)或多個(gè)步驟，例如，sartobind-q膜層析(以負(fù)模式)，和過濾以去除殘留dna。通常優(yōu)選將殘余dna降低到少于或等于100pgdna/μg蛋白(或降低到少于100pg/劑量)。然后通過在室溫暴露于甲醛(約100μg/ml)通常7至10天之間的期間而將該病毒滅活。任選地，將懸浮液在中間時(shí)間點(diǎn)，諸如第2天、第3天、第4天、或第5天過濾(例如，0.22μ)，以去除聚集物并改善甲醛暴露。滅活之后，可以將泊洛沙姆表面活性劑添加到緩沖劑，然后超濾/滲濾以去除甲醛，然后將純化的滅活登革熱病毒置于適于儲(chǔ)存的緩沖液中。然后將純化的滅活登革熱病毒最終無菌過濾，然后作為滅活登革熱病毒的原料制品進(jìn)行儲(chǔ)存。任選地，將蔗糖添加至原料制品的最終制劑中。實(shí)施例2：示例性免疫原性組合物的制劑在不同條件下評(píng)價(jià)純化的滅活登革熱病毒的制劑來解決在儲(chǔ)存、凍干和后續(xù)處理過程中產(chǎn)物的損失問題。在滅活登革熱病毒(每株3.3μg/ml)的原料制品的配制中評(píng)價(jià)以下變量：磷酸鹽緩沖液(ph8.5)濃度(5、15、30mm)、泊洛沙姆表面活性劑濃度(0、0.001%、0.2%)，在5％蔗糖存在的情況下，注射用水中的25mmnacl。將原料凍干并重構(gòu)在0.625ml懸浮溶液中。配制方法示意性地顯示在圖3a中。替代配制方法顯示在圖3b中，其中用tris緩沖液替代磷酸鹽緩沖液，并且將凍干之前生成單一劑量的單位體積從1.0ml降低到0.5ml。將被理解的是，體積調(diào)整和緩沖液改變是獨(dú)立變量，并且一種或兩種改變可以單獨(dú)或串聯(lián)進(jìn)行。在4℃和37℃孵育后7天之后，評(píng)價(jià)干燥餅的穩(wěn)定性。評(píng)價(jià)干燥產(chǎn)物的餅方面和殘余濕度。然后在nacl或在不同緩沖液中重構(gòu)凍干餅，以評(píng)價(jià)ph穩(wěn)定性。使用1.5ml的凍干前體積，導(dǎo)致用0.625ml重懸浮溶液重構(gòu)之后2.4倍濃度系數(shù)。通過固有熒光280/320nm、氮含量、elisa、動(dòng)態(tài)光散射、濁度測(cè)定、ph和重量摩爾滲透壓濃度分析所得懸浮的免疫原性組合物的餅質(zhì)量。示例性結(jié)果顯示在圖4a-b中。這些結(jié)果表明，在0.001%至0.2%表面活性劑(lutrol?)的濃度，產(chǎn)生了蛋白完全回收在所有測(cè)試的懸浮溶液中。這與在表面活性劑不存在的情況下蛋白含量的損失形成對(duì)比。不被理論所束縛，據(jù)信在表面活性劑不存在的情況下蛋白的損失是由于在小瓶上的非特異性吸附，可以通過添加合適的表面活性劑而防止這一點(diǎn)。在0.2％的濃度，表面活性劑也防止了病毒顆粒的聚集。緩沖液濃度和懸浮溶液的組成對(duì)初始產(chǎn)物回收率沒有任何影響。通過elisa的免疫學(xué)評(píng)價(jià)表明，在凍干和重構(gòu)之后保存了滅活登革熱病毒的免疫表位。關(guān)于凍干和重構(gòu)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)提供在實(shí)施例3中。實(shí)施例3：凍干原料制品和重構(gòu)為免疫原性組合物按照以下說明，如上所述將純化的滅活登革熱病毒配制成原料制品，并且顯示在圖3b中：5％蔗糖，1-31mmtris緩沖液，15mmnacl，0.015-0.2%泊洛沙姆188，對(duì)于四種病毒株中的每一種使用1.25μg/株的純化的滅活登革熱病毒。對(duì)于凍干，將原料制品分散為0.5ml等分試樣。然后以以下74小時(shí)冷凍干燥循環(huán)將原料制品進(jìn)行凍干：在1個(gè)大氣壓(arm.)下經(jīng)1小時(shí)冷凍到≤-52℃；如下在45μbar初始干燥：1)經(jīng)3小時(shí)從-52℃冷卻至-32℃；2)32℃32小時(shí)；3)以1℃增量連續(xù)下降溫度，下降10分鐘，隨后為2小時(shí)25分鐘的維持期間(共7小時(shí)55分鐘)；4)-28℃持續(xù)9小時(shí)；二次干燥如下：在45μbar下經(jīng)9小時(shí)溫度從-28℃增加至37℃，隨后在27μbar下37℃持續(xù)12小時(shí)。然后將凍干樣品平衡至2℃至8℃以完成循環(huán)。在再水化或以凍干形式37℃1個(gè)月或-20℃3個(gè)月或4℃5個(gè)月之后將所得凍干產(chǎn)物(“餅”)在室溫孵育24小時(shí)以評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。在選擇的緩沖液中重構(gòu)到0.625ml中之后，免疫原性組合物中的所得濃度如下：4％蔗糖，0.8-24.8mm磷酸鹽，12mmnacl，0.012-0.16%泊洛沙姆188，2.0μg的純化的滅活登革熱病毒。通過以下評(píng)價(jià)方法來測(cè)定所得免疫原性組合物的質(zhì)量、穩(wěn)定性和免疫原性：固有熒光、dls、濁度測(cè)定、ph和重量摩爾滲透壓濃度分析和elisa。代表性結(jié)果顯示在圖5a-c中。圖6a和6b圖示說明在表面活性劑的存在和不存在的情況下將凍干制品重構(gòu)在緩沖液中之后的穩(wěn)定性特征(分別為固有熒光和elisa)。所有數(shù)據(jù)均在預(yù)期值，與無表面活性劑的制劑相比，含表面活性劑的制劑的回收率明顯增加。在測(cè)試范圍內(nèi)沒有觀察到緩沖液(tris)濃度的影響。在各種重構(gòu)緩沖液中獲得了類似的結(jié)果(例如，為了獲得適合于與不同佐劑施用的液體免疫原性組合物)。這些結(jié)果證明，在泊洛沙姆表面活性劑和將ph維持在等于或高于中性的緩沖液存在的情況下凍干和重構(gòu)導(dǎo)致了在各種緩沖液組合物中的有利的穩(wěn)定性和免疫原性。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12