本發(fā)明屬于靶向藥物領(lǐng)域，涉及一種肝損傷治療的藥物，具體而言，涉及治療肝損傷的ggpps靶點，以及通過該靶點治療肝損傷的藥物。

背景技術(shù)：

我國是慢性肝病的高發(fā)地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計，我國目前約有1.2億肝病患者，另外每年近100萬新發(fā)病人群。每年因肝硬化、肝癌死亡人數(shù)則為40多萬人。近年來，衛(wèi)生部公布的我國疾病發(fā)生率數(shù)字表明，肝病發(fā)病率仍高居榜首。由于肝病預(yù)后差，相當一部分慢性肝病可轉(zhuǎn)為肝硬化和肝癌。因此慢性肝病對人類的健康危害極大，如何防治一直是我國傳染病工作的重中之重。

肝臟作為機體的主要代謝器官，起著去氧化、儲存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等等作用。肝臟是口服藥物、酒精和其它腸道吸收的異物的最初代謝場所，極易受到化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的損傷。諸如急性和慢性肝炎、肝中毒、肝細胞壞死、急性脂肪病變、膽汁淤積、肝硬化和肝癌等均可不同程度的對肝臟造成肝損傷。損傷程度有輕微的肝結(jié)構(gòu)和功能變化如急性肝衰竭、肝硬化，到肝癌不。肝損傷后會誘導(dǎo)肝臟發(fā)生一系列修復(fù)反應(yīng)，肝纖維增生就是其中極為重要的一個環(huán)節(jié)。肝纖維化(hepaticfibrosis,hf)的特點是細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和分解平衡被打破，造成膠原和其它細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過度沉積。肝纖維化是各種慢性肝病共有的病理基礎(chǔ)和必經(jīng)階段，是影響慢性肝病的重要環(huán)節(jié)。如不加控制，可逆的肝纖維化可進而發(fā)展成為不可逆的肝硬化，而且絕大多數(shù)還會導(dǎo)致肝癌形成。肝星狀細胞(hepaticstellatecell,hsc)是肝非實質(zhì)細胞的一種，存在于肝血竇內(nèi)皮細胞與肝細胞間的disse間隙，占肝臟中細胞比例的15％。hsc的活化、增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，因此，對hsc活化從而導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生機制的研究在臨床診斷治療纖維化方面具有重要的意義。當肝臟受損時，hsc被激活，失去了對維生素a和脂質(zhì)儲存的特性轉(zhuǎn)變成活化形式，即從靜止的肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞。hsc的活化過程受到轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，tgf-β)和血小板源生長因子(platelet-derivedgrowthfactor,pdgf)兩個細胞因子的調(diào)控，在這兩個細胞因子促進下活化的hsc表達α-平滑肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)、合成細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ecm)，最終會導(dǎo)致肝的纖維化。因此，在過去的一二十年中，對hsc的研究成為研究肝纖維化的主導(dǎo)方向。由于肝纖維化是各種慢性肝病最后走向肝硬化甚至于肝癌的必由之路，因而在此階段抗肝纖維化治療，可以阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生，從而防止肝硬化和肝癌的產(chǎn)生，對慢性肝病的防治具有重要的意義。

香葉基香葉基二磷酸合成酶(geranylgeranyldiphosphate,ggpp)是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵蛋白，在小g蛋白香葉基修飾中發(fā)揮重要作用，促進小g蛋白激活。香葉基化是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，一般發(fā)生在蛋白質(zhì)c末端保守的半胱氨酸。發(fā)生香葉基化的蛋白質(zhì)包括ras和ras相關(guān)的小g蛋白如rho、rab、rac，以及三聚體g蛋白的γ亞基，這些受調(diào)控的蛋白質(zhì)都是信號傳遞通路中重要的分子開關(guān)調(diào)節(jié)蛋白。已有研究報道過ggpp在逆轉(zhuǎn)他汀類藥物引起的肝損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當用他汀類藥物抑制hmg-coa還原酶活性時，可抑制肝細胞活性，引起細胞死亡。然而，這種抑制作用可以被甲羥戊酸或者ggpp所逆轉(zhuǎn)。ggpps可以催化法尼基焦磷酸(fanesylpyrophosphate，fpp)與異戊烯焦磷酸(isopentenypryophosphate，ipp)的縮合反應(yīng)，產(chǎn)生由20個碳組成的香葉基焦磷酸，促進下游蛋白發(fā)生香葉基化修飾。在甲羥戊酸代謝途徑中，ggpps是催化ggpp和fpp合成的分支點酶。ggpps這一催化酶的功能已經(jīng)在許多疾病中被揭示。近年研究發(fā)現(xiàn)ggpps在香煙煙霧導(dǎo)致肺部炎癥的信號通路中發(fā)揮作用。小鼠睪丸支持細胞中g(shù)gpps的特異性敲除引起不育癥，心臟特異性敲除ggpps導(dǎo)致了心肌細胞肥厚性增生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一個特異靶向治療肝纖維化的新靶點，本發(fā)明提供了一種肝損傷治療的靶點和藥物。

技術(shù)方案：用于調(diào)控肝星狀細胞活性以預(yù)防或治療化學(xué)性肝損傷導(dǎo)致的肝纖維化的物質(zhì)。

優(yōu)選的，所述物質(zhì)是香葉基二磷酸合成酶抑制劑。

進一步的，所述抑制劑是香葉基二磷酸合成酶特異性的干擾質(zhì)粒。

進一步的，所述干擾質(zhì)粒的小干擾rna的編碼序列為：seqidno:1～2。序列如下：

seqidno:15'-ccagauuagagaugauuautt-3'；

seqidno:25'-auaaucaucucuaaucuggtt-3'。

優(yōu)選的，所述干擾質(zhì)粒由維生素a偶聯(lián)的脂質(zhì)體包裹。

優(yōu)選的，所述干擾質(zhì)粒靶向干擾肝星狀細胞的ggpps。

優(yōu)選的，所述維生素a脂質(zhì)體包裹的干擾質(zhì)粒靶向干擾肝星狀細胞的ggpps，抑制肝星狀細胞的活化。

優(yōu)選的，所述維生素a脂質(zhì)體包裹的干擾質(zhì)粒靶向干擾肝星狀細胞的ggpps，抑制ccl4化學(xué)損傷誘導(dǎo)的肝纖維化。

上述任一所述物質(zhì)在制備預(yù)防或治療化學(xué)性肝損傷導(dǎo)致的肝纖維化的藥物或藥物組合物中的應(yīng)用。

有益效果：肝星狀細胞的活化、增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。當肝臟受到損傷刺激后，肝星狀細胞可以經(jīng)歷從靜止的肝星狀細胞到具有增殖性、成纖維性和收縮性的肌成纖維樣細胞(mf)的轉(zhuǎn)化過程。激活后的肝星形細胞可自分泌tgf、pdgf、et等細胞因子使活化得以持續(xù)并合成大量細胞外基質(zhì)，使得肝臟發(fā)生纖維化。

本發(fā)明所述藥物具有以下優(yōu)點：針對肝星狀細胞，并有高度的特異性；對肝實質(zhì)細胞及其他非實質(zhì)細胞的毒性??；應(yīng)能有效逆轉(zhuǎn)進展性肝纖維化，而不是僅僅阻止新的膠原的沉積。此外，本發(fā)明充分利用了肝星形細胞是維生素a的存儲細胞的特性，實現(xiàn)了將小干擾rna靶向到肝星狀細胞而不影響肝實質(zhì)細胞和其它的非實質(zhì)細胞。由于ggpps在肝星狀細胞活化過程中起著重要作用，利用小干擾rna特異的降低肝星狀細胞中g(shù)gpps的表達，能夠抑制肝星狀細胞的活化，并從根本上抑制了膠原的產(chǎn)生，有效的控制肝纖維化的發(fā)展。

相比較而言，目前科研領(lǐng)域雖然利用轉(zhuǎn)基因手段敲除肝星狀細胞中某些基因可以控制肝纖維化，但轉(zhuǎn)基因不可能作為抗纖維化治療的手段，僅適用于基礎(chǔ)研究。此外，一些藥物被報道可以作用到肝星狀細胞，但是鑒于其靶向性差，安全性差和副作用大，也未能成功的用于肝纖維化治療。綜上所述，本發(fā)明在肝纖維化治療上具有靶向性強、安全性高、作用明顯以及副作用小的特點，可能作為理想的纖維化治療手段。

附圖說明

圖1是ggppsmrna水平在肝硬化病人樣本中變化圖；a為定量pcr的方法檢測肝硬化病人病理組織中g(shù)gpps表達圖；b為定量pcr的方法檢測肝硬化相關(guān)基因col1a1的表達圖；c為定量pcr的方法檢測肝硬化相關(guān)基因ctgf的表達圖；*，與正常肝臟比p﹤0.05；d為免疫蛋白印記檢測肝硬化病人病理組織中g(shù)gpps以及肝硬化相關(guān)基因α-sma的表達圖；

圖2是ggppsmrna水平在ccl4誘導(dǎo)的肝損傷中變化圖；對ggpps肝臟敲除小鼠和對照小鼠腹腔注射ccl4，搜集不同時間肝臟樣品提取rna，熒光定量pcr檢測肝硬化相關(guān)基因col1a1(a)以及ggpps(b)的表達。**，與0小時相比p﹤0.01；

圖3是ccl4化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中g(shù)gpps特異的高表達于hsc；(a)免疫熒光染色檢測α-sma(綠)和ggpps(紅)在ccl4誘導(dǎo)的慢性小鼠肝纖維化中的表達(放大倍數(shù)：×200)；(b)密度梯度離心分離肝纖維化小鼠和對照小鼠的hsc，westernblotting檢測ggpps的表達；

圖4是va-liposome-sirnaggpps-fam靶向hsc；(a)熒光檢測冰凍切片中α-sma的表達以及fam的分布(放大倍數(shù)：×200)；(b)real-timepcr驗證hsc中g(shù)gpps的干擾；

圖5是靶向干擾hsc中g(shù)gpps表達可以抑制hsc活化和肝纖維化；(a)westernblotting檢測ggpps、α-sma和tgf-β1的表達；(b)real-timepcr檢測小鼠肝臟中hsc活化標志物和纖維化標志物的表達。*，與olive相比p＜0.05，**，與olive相比p＜0.01；##，與nc相比p＜0.01)；(c)天狼猩紅染色測定肝纖維化的代表圖片(放大倍數(shù)：×200)。右圖為天狼猩紅染色的統(tǒng)計結(jié)果，**，p＜0.01；

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1ggpps在肝硬化及ccl4誘導(dǎo)的急性肝損傷中表達的檢測

實驗中使用的是8周齡的雄性b6小鼠。急性損傷模型中，小鼠腹腔注射每克體重1ul的ccl4(ccl4與橄欖油1:3混合)。慢性肝損傷模型中，小鼠根據(jù)體重每周腹腔注射2次1ul/g的ccl4(ccl4與橄欖油1:3混合)，連續(xù)注射12周。

首先，對搜集的病人肝硬化樣品和對照樣品以及ccl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷樣品進行rna提取。具體方法如下；取肝臟組織約20mg于1mltrizol，組織勻漿器勻漿至無塊狀后，加入200μl氯仿劇烈震蕩，室溫靜置5min后4℃12000rpm離心15min。轉(zhuǎn)移上層水相至新的eppendorf管，加入等體積異丙醇后輕柔混勻，-20℃靜置30min。4℃12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用1ml預(yù)冷的75％的乙醇洗滌，rna最終溶于150uldepc水。55℃水浴充分溶解后測rna濃度。

接下來將rna反轉(zhuǎn)錄為反轉(zhuǎn)錄為cdna。該試驗采用takara公司的primescripttmrtreagent試劑盒進行。每10ul反應(yīng)體系中加入5×primerscriptbuffer4μl，rna800ng余下部分用ddh2o補足20μl。然后將加好的反轉(zhuǎn)錄體系置于pcr儀中，37℃反應(yīng)30min，然后85℃5s。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，cdna用ddh2o稀釋5倍后實時熒光定量pcr檢測ggpps、ctgf和col1a1的表達。事實熒光定量pcr中使用的引物序列如下：

此外，我們還在蛋白水平檢測了ggpps與纖維化相關(guān)因子α-sma和tgf-β的表達。取肝組織30mg，加入300μl組織裂解緩沖液(其中含20mmtris-hclph7.5；4mmedta；2％sds；1.0mmol/lna3vo4；2.0mmol/lnaf；100.0μg/mlpmsf；1.0μg/mlcocktail)，冰上勻漿后，4℃，12000rpm離心15min，收集上清夜于另一新eppendorf管中，進行western印跡，具體方法如下：測定濃度后蛋白樣品加入相應(yīng)量的6×蛋白上樣緩沖液，混勻后，99℃煮樣5min，使蛋白變性。將處理好的蛋白樣品按50μg/孔進行sds-page膠電泳分離，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至pvdf膜上，一抗ggpps(1:200稀釋)、tgf-β(1：100稀釋)、α-sma(1：1000稀釋)或β-actin(1:1000稀釋)4℃孵育過夜，pbst洗膜，每次10min，共3次。二抗使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)igg(1:20000稀釋)室溫孵育1h，再次pbst洗膜，每次5分鐘，共6次。之后暗室中配置ecl-plus顯色液，混勻后滴加在平整放置的pvdf膜上，反應(yīng)40sec，隨即將pvdf膜置于保鮮膜中固定在曝光盒內(nèi)，上層覆蓋感光膠片，根據(jù)熒光強度選擇不同的曝光時間，進行曝光。

實時熒光定量pcr和免疫蛋白印跡結(jié)果顯示ggpps在硬化樣品中顯著增加,具體結(jié)果如圖1和圖2所示。

實施例2免疫熒光檢測ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化中g(shù)gpps和α-sma的分布

肝臟石蠟切片的制作:肝臟組織樣生理鹽水洗后，4％多聚甲醛固定過夜。50％乙醇1h→75％乙醇1h→90％乙醇1h→100％乙醇1h梯度脫水，二甲苯透明15min×2times，60℃浸蠟≥3h，石蠟包埋并切片。

1)5um厚的石蠟切片脫蠟復(fù)水：二甲苯ⅰ30min→二甲苯ⅱ10min→100％乙醇3min→95％乙醇3min→85％乙醇3min→70％乙醇3min→50％乙醇3min→h2o5min×2

2)抗原修復(fù)：檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù)，高火3min，中高2.5min，低火7min，自然冷卻至室溫。

3)打孔：含0.5％tween-20和0.5％tritionx-100的pbs室溫處理15min。

4)封閉：正常山羊血清室溫封閉1h。

5)ki67抗體用山羊血清按1：200稀釋，滴于玻片上，4℃過夜。

6)pbs×3times，每次5min。

7)熒光二抗用山羊血清1：200稀釋，室溫1h。

8)pbs×3times，每次5min。

9)dapi(1μg/ml終濃度)室溫染15min。

10)pbs×3times，每次5min。

11)90％甘油封片

12)倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

通過免疫熒光共染ggpps和α-sma我們發(fā)現(xiàn)在小鼠肝纖維化的早期，ggpps特異的高表達與hsc細胞,具體結(jié)果如圖3所示。

實施例3原代hsc的分離

小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，75％乙醇消毒后固定在鼠板上。打開腹腔，暴露下腔靜脈和肝門靜脈。針頭從下腔靜脈插入，確定針頭插入血管后剪開肝門靜脈。灌注液1以10ml/min速度灌注7min后更換預(yù)熱的灌注液2，以同樣速度灌注10min。將消化好的肝臟取出放入20ml含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基終止消化。用鑷子將肝臟被摸撕開，晃散，然后滴管吹打，70um篩網(wǎng)過濾后，4℃，50×g離心2min。上清4℃，2000×g離心10min后，用2ml含胎牛血清的dmem懸浮，鋪在含33％percoll分離液的離心管中，2000×g離心10min。吸出hsc細胞，用滴管吸取純凈的星形細胞。在星形細胞中加入培養(yǎng)液使總體積約20ml，1000×g離心10min，以去除percoll。分離出來的原代hsc用于提取蛋白和rna。

實施例4va-liposome-sirnaggpps-fam混合物的制備

1)脂質(zhì)體準備：用ddh2o將凍干的脂質(zhì)體配置成1mm(dc-16-4)母液，邊加ddh2o邊震蕩。

2)va-coupledliposomes的準備：25℃下，在1.5mleppendorf管中將200nmol維生素a(dmso配制)通過vertex混合到100nmoldc-16-4中。

3)va-coupledliposomescarryingsirnaggpps(va-lip-sirnaggpps)準備：將sirnaggpps溶液(580pmol/mlinddh2o)加入到theva-coupledliposome溶液中，25℃。其中sirna和dc-16-4的比例為1:11.5(mol/mol)，sirna和liposome的比例(wt/wt)為1:1。

4)混合液用micropartitionsystem(vivaspin2concentrator30000mwcopes，vivascience)去除掉未與脂質(zhì)體結(jié)合的vitamina和sirna。micropartitionsystem(vivaspin2concentrator30000mwcopes，vivascience)。1500g25℃離心5min，共3次。用pbs洗脫一次，并配制成需要的比例。

ccl4誘導(dǎo)12周，將此復(fù)合物以0.75mg/kg濃度通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，連續(xù)6次注射后檢測小鼠肝纖維化的程度以及相關(guān)基因的表達。

實施例5肝臟冰凍切片的制備及免疫熒光染色

肝臟組織4％pfa室溫固定2h，轉(zhuǎn)移至30％蔗糖4℃脫水過夜，oct包埋后-20℃切片(8μm)。切片置于-80℃保存。

fam熒光與α-sma共染按以下步驟進行：

1)玻片室溫干燥，pbs洗5min×2；

2)含0.5％tween-20和0.5％tritionx-100的pbs室溫處理15min；

3)山羊血清室溫封閉1h；

4)α-sma抗體4℃孵育過夜；

5)pbs×3times，每次5min；

6)熒光二抗用山羊血清1：200稀釋，室溫1h；

7)pbs×3times，每次5min。

8)dapi(1μg/ml終濃度)室溫染15min。

9)pbs×3times，每次5min。

10)90％甘油封片

11)倒置熒光顯微鏡觀察拍照

α-sma染色顯示ccl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型建模成功。攜帶fam的小干擾rna分布在α-sma染色陽性的區(qū)域，說明利用維生素a將包裹ggppssirna的脂質(zhì)體靶向到hsc的行性,具體結(jié)果如圖4所示。

實施例6天狼猩紅染色

石蠟切片進行常規(guī)的脫蠟復(fù)水；天青石液染5-10min；蒸餾水洗3次；天狼星紅飽和苦味酸濃染15-30min；無水乙醇直接分化和脫水；二甲苯透明；中性樹膠封固。天狼星紅染色結(jié)果顯示，與對照組相比，hsc中g(shù)gpps特異敲降的小鼠肝臟中膠原的積累明顯減少具體結(jié)果如圖5所示。

sequencelisting

<110>南京大學(xué)

<120>肝損傷治療的靶點和藥物

<130>

<160>14

<170>patentinversion3.3

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