本發(fā)明涉及一種mir-647，具體涉及mir-647在制備治療胃癌的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

mirnaagomir是經(jīng)過特殊化學修飾的mirna激動劑，通過模擬mirna進入mirisc復合物來調(diào)節(jié)靶mrna的表達而發(fā)揮作用。與普通的mirnamimics相比，agomir在動物體內(nèi)具有更高的穩(wěn)定性和mirna促進效果，而且能克服體內(nèi)細胞膜、組織等障礙富集于靶細胞。在動物實驗中可以用全身或局部注射、吸入、喂藥等方法進行給藥，作用效果持續(xù)時間可長達6周。已有不少mirnaagomir相關(guān)研究成果發(fā)表。本研究用于動物實驗的agomir-647購自廣州市銳博生物科技有限公司(產(chǎn)品編號：mir40003317-1-10)。目前尚無該agomir-647的實驗研究成果報道。

ccg-1423是一種新型的rhoa/c介導的基因轉(zhuǎn)錄抑制劑，能抑制細胞的轉(zhuǎn)移前列腺癌pc-3細胞侵襲模型；通過抑制心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mrtf-a(myocardin-relatedtran-scriptionfactora，又稱mkl1)入核提高胰島素抵抗小鼠模型對葡萄糖的攝取和耐受?；谄鋵rtf/srf相關(guān)下游基因的轉(zhuǎn)錄抑制機制，還有研究發(fā)現(xiàn)ccg-1423可抑制心肌細胞h9c2中srf對stars基因的轉(zhuǎn)錄激活以及大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(vsmc)ccn1mrna的表達。目前尚無該藥物相關(guān)的胃癌研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對胃癌臨床治療療效尚不理想而提供了一種治療胃癌的藥物組合物，本發(fā)明提供了agomir-647和ccg-1423的聯(lián)合使用在制備治療胃癌的藥物中的用途。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種治療胃癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括mir-647類似物agomir-647，以及ccg-1423。

本發(fā)明提供了agomir-647和ccg-1423的聯(lián)合使用在制備治療胃癌的藥物中的用途。

本發(fā)明通過基礎(chǔ)實驗在細胞和動物水平首先證實mir-647對srfmrna的轉(zhuǎn)錄后抑制作用，并發(fā)現(xiàn)其可間接抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要骨架蛋白、srf下游分子ii型肌球蛋白a(myh9)的表達。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過胃癌組織qpcr和原位雜交等證實mir-647在胃癌中表達下調(diào)并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)；通過生物信息學靶標預測、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因篩選驗證及胃癌細胞株mir-647功能驗證等實驗，發(fā)現(xiàn)mir-647/srf/myh9軸在胃癌轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵抑制作用；通過裸鼠原位種植瘤實驗進一步發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射經(jīng)化學修飾的mir-647類似物(銳博公司產(chǎn)品)與腹腔注射ccg-1423(抑制心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mrtf-a(myocardin-relatedtran-scriptionfactora)入核的小分子抑制劑，阻斷依賴血清應(yīng)答因子srf激活的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄)聯(lián)合應(yīng)用對于抑制裸鼠胃癌的腹腔轉(zhuǎn)移有顯著作用。鑒于目前胃癌晚期患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移尚無很好的臨床治療方案，化學修飾的mir-647類似物(銳博公司產(chǎn)品)與腹腔注射ccg-1423聯(lián)合應(yīng)用于晚期胃癌患者治療的可行性值得進一步研究。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中mir-647在胃癌中表達下調(diào)，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的圖片；

圖2為本發(fā)明實施例2中胃癌細胞系中的mir-647影響轉(zhuǎn)移相關(guān)基因srf和myh9表達的圖片；

圖3為本發(fā)明實施例3中mir-647/srf/myh9信號軸顯著抑制胃癌細胞遷移的圖片；

圖4為本發(fā)明實施例4中mir-647表達影響患者預后，并與srf水平表達相關(guān)的圖片；

圖5為本發(fā)明實施例5中ccg-1423抑制胃癌預后相關(guān)的srf/myh9軸從而降低胃癌細胞遷移能力的圖片；

圖6為本發(fā)明實施例5中聯(lián)合應(yīng)用agomir-647和ccg-1423從不同層面抑制mrtf/srf/myh9信號軸從而顯著抑制胃癌原位種植瘤的進展的圖片；

圖7為本發(fā)明給藥方案流程圖；

圖8為本發(fā)明研究簡介模式圖。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明mir-647類似物指agomir-647。

實施例1：mir-647在胃癌中表達下調(diào)，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

實驗方法和結(jié)果如下(結(jié)果如圖1所示)：

圖1中a：通過qrt-pcr檢測109例人胃癌組織(t)以及相對應(yīng)的正常胃黏膜組織(n)中mir-647表達水平，其中使用u6rna作為內(nèi)參。***p<.001

圖1中b：用餅圖及瀑布圖展示mir-647人胃癌組織以及相對應(yīng)的正常胃黏膜組織中mrr-647相對表達水平。mir-647相對水平的變化倍數(shù)(t/n)>2或<1/2則認為有統(tǒng)計學意義。瀑布圖：mir-647相對水平的變化倍數(shù)(log2[t/n])>1或<-1則認為有統(tǒng)計學意義。

如圖1所示，圖1中a和b通過不同統(tǒng)計方法說明mir-647在胃癌中頻發(fā)表達下調(diào)。

圖1中c：mir-647表達水平與胃癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或局部浸潤情況的相關(guān)關(guān)系分析。*p<.05；**p<.01。如圖圖1中c所示，mir-647表達與t、n、和tnm臨床分期相關(guān)。

圖1中d：qrt-pcr檢測5種胃癌細胞株中mir-647表達水平結(jié)果。如圖所示mgc80-3表達最低，ags和snu-5表達最高。

圖1中e、f：qrt-pcr檢測轉(zhuǎn)染mir-647后的mgc80-3與mkn45胃癌細胞中mir-647表達水平。***p<.001。如圖圖1中e、f所示，兩種細胞均有較好的轉(zhuǎn)染效率。

圖1中g(shù)：3d細胞遷移侵襲實驗***p<.001

圖1中h：單層細胞劃痕試驗用于2d細胞遷移。***p<.001。

如圖1所示，圖1中g(shù)和h分別觀察mir-647穩(wěn)定過表達細胞株和過表達后瞬轉(zhuǎn)再次抑制其表達細胞株的遷移和侵襲情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-647過表達后細胞遷移和侵襲能力下降，抑制mir-647后該能力有一定程度恢復，說明mir-647表達抑制胃癌細胞遷移和侵襲能力。

實施例2：胃癌細胞系中的mir-647影響轉(zhuǎn)移相關(guān)基因srf和myh9表達

實驗方法和結(jié)果如下(結(jié)果如圖2所示)：

圖2中a：通過4個常用的mirna數(shù)據(jù)庫進行生物信息學預測mrr-647的潛在靶基因。其中展示了部分與細胞運動能力相關(guān)并且與rho通路相關(guān)的基因(標記為紅色)。

圖2中b：用mirbasetargets數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/targets)進行mrr-647靶基因通路富集分析。使用4個數(shù)據(jù)庫以及mirgator(nam,etal.,nucleicacidsresearch.36:d159-64；http://genome.ewha.ac.kr/mirgator)。細胞運動功能相關(guān)的基因如圖表所示。

圖2中c：通過qrt-pcr檢測mgc80-3與ags中rho通路相關(guān)基因的表達水平。其中由于mgc80-3胃癌細胞mir-647表達水平低，因此予mgc80-3胃癌細胞轉(zhuǎn)染mir-647類似物；而ags胃癌細胞中mir-647表達水平高，因此予ags胃癌細胞轉(zhuǎn)染mir-647抑制劑。u6作為內(nèi)參。***p<.001。如圖2中c所示，srf和myh9表達在兩種細胞中均明顯受mir-647表達影響。

圖2中d-e：用westernblot與qrt-pcr檢測5株胃癌細胞株中srf與myh9的表達水平。gadph作為內(nèi)參。如圖所示，ags和snu-5的srf和myh9表達相對較少；mgc80-3和mkn45細胞的srf和myh9表達相對較高。

圖2中f：westernblot檢測mgc80-3與mkn45胃癌細胞(均感染mir-647過表達的慢病毒或?qū)φ战M慢病毒)中的srf與myh9蛋白表達水平。gadph作為內(nèi)參。如圖2中f所示，加入mir-647過表達慢病毒后，細胞srf和myh9表達均下調(diào)。

圖2中g(shù)：westernblot檢測感染mir-647抑制劑或其陰性對照(inc)的mgc80-3-lv-mir-647與mkn45-lv-mir-647胃癌細胞中srf與myh9的蛋白表達水平。gadph作為內(nèi)參。如圖2中g(shù)所示，加入mir-647抑制劑后原來過表達mir-647的兩種細胞srf和myh9表達均有所恢復。

實施例3：mir-647/srf/myh9信號軸顯著抑制胃癌細胞遷移

實驗方法和結(jié)果如下(結(jié)果如圖3所示)：

圖3中a：通過targetscan與miranda數(shù)據(jù)庫預測mir-647在srf與myh9mrna的3’端非編碼區(qū)的結(jié)合序列。

圖3中b、c：向穩(wěn)定表達lv-mir-647或lv-nc的mgc80-3與ags(mgc80-3-lv-mir-647與ags-lv-mir-647)轉(zhuǎn)入3’端非編碼區(qū)報告質(zhì)粒(pgv306-wt1-3)、位點突變報告質(zhì)粒(pgv306-mut1-4)或?qū)φ召|(zhì)粒(pgv306空載)后的相關(guān)熒光素酶活性分析。以海腎熒光素酶活性作為參照。***p<.001。如圖3中b、c所示，srf的3’端非編碼區(qū)第1和第3位預測結(jié)合位點是mir-647的結(jié)合序列；myh9的預測結(jié)合位點未檢測到mir-647結(jié)合活性。提示mir-647靶向抑制srf而非myh9mrna的3’端非編碼區(qū)。

圖3中d、e：用雙熒光素酶報告基因分析驗證確定srf通過靶標結(jié)合myh9啟動子來調(diào)節(jié)myh9的表達。通過bioinformatics(proscan與jaspar)分析網(wǎng)站預測myh9啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的潛在序列。(d)本研究合成了myh9啟動子全長序列(熒光素酶質(zhì)粒構(gòu)建)pgl3-myh9-1300(野生型)以及5段截斷片段(pgl3-myh9-1000,pgl3-myh9-903,pgl3-myh9-753,pgl3-myh9-528andpgl3-myh9-328)。-589至-439位點含有srf結(jié)合位點的序列，在熒光素酶報告基因?qū)嶒炛邪l(fā)現(xiàn)對應(yīng)熒光素酶活性顯著增強(d)。通過進一步熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，srf能夠直接結(jié)合myh9啟動子上野生型序列(ccatatatgg在-589至-439位點中)，而不能結(jié)合其對應(yīng)突變型序列(aacgaccagag)(e)。***p<.001。因此，srf通過結(jié)合myh9啟動子區(qū)ccatatatgg促進myh9轉(zhuǎn)錄。

圖3中f：用chip-qpcr實驗方法分析驗證在mgc80-3與ags胃癌細胞中srf結(jié)合myh9啟動子情況。rna聚合酶ii(rnaii)能夠結(jié)合到gadph啟動子上，因此選其作為陽性對照。以相對于對照的igg富集倍數(shù)作為展示(mean±sd；*p<.05；**p<.01；***p<.001)。如圖3中f所示，srf和mrtf抗體均可拉下以ccatatatgg為核心的myh9啟動子區(qū)dna小片段，進一步說明srf和mrtf二者結(jié)合于ccatatatgg區(qū)域調(diào)控myh9表達。

圖3中g(shù)：蛋白srf靶結(jié)合myh9啟動子上的cargbox的圖解說明。

圖3中h：用westernblot檢測分析轉(zhuǎn)入srf質(zhì)粒或?qū)φ战M質(zhì)粒的mgc80-3-lv-mir-647與ags-lv-mir-647胃癌細胞中srf與myh9表達水平變化。gadph作為內(nèi)參。同時，westernblot也用于檢測分析轉(zhuǎn)入myh9質(zhì)?；?qū)φ战M質(zhì)粒的mgc80-3-lv-mir-647與ags-lv-mir-647胃癌細胞中srf與myh9表達水平變化。gadph作為內(nèi)參。如圖3中h所示，過表達mir-647下調(diào)srf和myh9表達；過表達srf恢復srf和myh9蛋白表達；而過表達myh9僅恢復myh9蛋白表達，srf表達未見明顯變化。這說明mir-647抑制myh9和srf表達，srf促進myh9表達。結(jié)合熒光素酶報告基因檢測結(jié)果提示，mir-647靶向抑制srf表達從而下調(diào)srf依賴性轉(zhuǎn)錄的myh9表達。

圖3中i：3d細胞遷移侵襲實驗：分別為：轉(zhuǎn)染srf、myh9及空載體的ags-lv-mir-647胃癌細胞。eachbarrepresentsthemean±sd.***p<.001。如圖3中i所示，mir-647過表達引起的細胞遷移侵襲減少在恢復srf或myh9表達后得到一定程度的恢復。結(jié)合之前實驗結(jié)果，說明mir-647是通過srf/myh9軸影響胃癌細胞遷移侵襲的。

實施例4：mir-647表達影響患者預后，并與srf水平表達相關(guān)

實驗方法和結(jié)果如下(結(jié)果如圖4所示)：

圖4中a：109例胃癌組織及對應(yīng)正常粘膜中的srf蛋白進行免疫組化。原始倍數(shù)，100×放大倍數(shù)。

圖4中b：根據(jù)srf表達水平的免疫組化結(jié)果進行評分作統(tǒng)計分析(卡方檢驗，***p<.001)。如圖4中b所示，正常組織與癌組織的srf表達評分存在顯著差異，癌組織中評分高的占多數(shù)(評分3的占44.96％，評分2的占32.11％)

圖4中c：109例胃癌組織樣品中srf表達水平與mir-647水平的相關(guān)關(guān)系分析，***p<.001。如圖4中c所示，mir-647與srf的qpcr表達檢測結(jié)果示二者表達呈負相關(guān)。

圖4中d：原位雜交實驗檢測mir-647在胃癌組織與鄰近正常黏膜組織中的表達情況。原始倍數(shù)，100×，200×。(diglabeledlnaprobesforu6andscramblewereusedaspositiveandnegativecontrols,respectively.)dig標記lna探針。分別作為陽性對照(u6)與陰性對照(scramble)。如圖4中d所示，mir-647在癌中表達較正常上皮明顯下調(diào)。

圖4中e、f：109例胃癌病例中mir-647與srf和myh9表達水平間相關(guān)關(guān)系。所示為兩代表性病例展示(e)。原始倍數(shù)、200×。組織標本中mir-647低表達或高表達以百分比表示，分析與srf和myh9表達水平的相關(guān)關(guān)系。*p<.05。如圖4中e、f所示mir-647表達與myh9、srf均呈負相關(guān)。

圖4中g(shù)：用kaplan-meier生存分析方法統(tǒng)計分析胃癌患者生存與其對應(yīng)srf表達水平相關(guān)關(guān)系(log-ranktest)。如圖4中g(shù)所示，mir-647表達高低與患者生存相關(guān)，mir-647低表達提示預后不良。

實施例5：ccg-1423抑制胃癌預后相關(guān)的srf/myh9軸從而降低胃癌細胞遷移能力

實驗方法和結(jié)果如下(結(jié)果如圖5所示)：

圖5中a：使用westernblot與qrt-pcr實驗檢測mgc80-3胃癌細胞感染srfsirna2質(zhì)粒或?qū)φ湛瞻踪|(zhì)粒(經(jīng)新霉素藥篩)后，srf與myh9表達水平的變化。如圖5中a所示，sirna2有良好的抑制效果(共檢測并比較了3條sirnas的抑制效果，余兩條結(jié)果未展示)，srf與myh9mrna和蛋白水平表達顯著受抑制。

圖5中b：使用westernblot與qrt-pcr實驗檢測srf敲除的mgc80-3胃癌細胞(mgc80-3-srf-kd)在感染srf質(zhì)?；?qū)φ湛瞻踪|(zhì)粒后，srf與myh9表達水平的變化。***p<.001。如圖5中b所示，轉(zhuǎn)染srf質(zhì)粒以后，srf與myh9mrna和蛋白水平表達得到逆轉(zhuǎn)，說明srf轉(zhuǎn)染有效，且myh9表達受srf影響。

圖5中c：3d細胞侵襲實驗(小室鋪有基質(zhì)膠)：分別轉(zhuǎn)染srfsirna2質(zhì)粒、srf質(zhì)粒及對照空白質(zhì)粒的mgc80-3。檢測ccg-1423(針對rhoa/srf介導基因轉(zhuǎn)錄活動通路中的一種抑制劑。)與其陰性對照dmso用于對胃癌細胞的侵襲能力影響。***p<.001；**p<.01。如圖5中c所示，不管加沒加ccg-1423，mgc80-3敲低后(srfsirna2組)細胞侵襲能力顯著下調(diào)；再加入srf質(zhì)粒(srf敲低后加srf質(zhì)粒組)侵襲能力得到一定恢復；加ccg-1423的四組較dmso對照組，其侵襲能力均下調(diào)。

圖5中d：使用westernblot與qrt-pcr實驗檢測上述mgc80-3胃癌細胞中srf與myh9的表達水平變化。如圖5中d所示，不管加沒加ccg-1423，mgc80-3敲低后(srfsirna2組)細胞srf和myh9蛋白表達下調(diào)；再加入srf質(zhì)粒(srf敲低后加srf質(zhì)粒組)細胞srf和myh9蛋白表達下調(diào)得到一定恢復；加ccg-1423的兩組較分別與同種質(zhì)粒處理的細胞dmso對照組比，其細胞srf表達無明顯變化而myh9蛋白表達進一步下調(diào)。

圖5中e：使用免疫熒光共聚焦實驗對srf與myh9蛋白在胃癌細胞(mgc80-3與ags)中的細胞內(nèi)定位。如圖5中e所示，srf不僅作為轉(zhuǎn)錄因子存在核表達還存在于細胞質(zhì)中；myh9剛除作為骨架蛋白“動力馬達”存在細胞質(zhì)，還存在細胞核內(nèi)。

圖5中f-i：胃癌患者中srf與myh9的表達。使用tma分析原發(fā)胃癌組織(n＝90)及對應(yīng)鄰近正常黏膜組織中srf與myh9表達水平(f)。原始倍數(shù)、35×，200×。用kaplan-meier生存分析方法統(tǒng)計分析胃癌患者生存與其對應(yīng)srf與myh9表達水平相關(guān)關(guān)系(log-ranktest)(g)。對tma中srf與myh9表達水平的免疫組化結(jié)果進行spearman秩相關(guān)分析(h)?；趖cga數(shù)據(jù)庫檢索所得rna序列數(shù)據(jù)對srf與myh9進行線性回歸分析(i)。如圖5中g(shù)所示，srf和myh9在組織中表達均與患者總生存相關(guān)，蛋白表達越高總生存時間越少，反之亦然。srf和myh9的蛋白表達(圖5中h)和mrna表達(圖5中i)均呈正相關(guān)。

實施例6：

聯(lián)合應(yīng)用agomir-647和ccg-1423從不同層面抑制mrtf/srf/myh9信號軸從而顯著抑制胃癌原位種植瘤的進展。

實驗方法和結(jié)果如下(結(jié)果如圖6所示)：

圖6中a-c用mir-647過表達慢病毒、srf過表達質(zhì)粒及二者相應(yīng)的對照構(gòu)建胃癌細胞基因異常表達穩(wěn)定株(lv-nc/vector是對照組；lv-mir-647/vector是mir-647過表達的胃癌細胞；lv-mir-647/srf是mir-647過表達后加入srf質(zhì)粒穩(wěn)定表達的細胞株，用于功能回復實驗，證明mir-647的功能是通過抑制srf表達實現(xiàn)的)。用三種細胞裸鼠皮下成瘤后再原位種植到胃壁進行觀察，每組各8只，對照組1只麻醉死亡。原位種植兩個月后解剖觀察，記錄原發(fā)腫瘤大小及轉(zhuǎn)移部位與數(shù)量，通過兩樣本t檢驗統(tǒng)計組間差異明顯。說明mir-647過表達的胃癌細胞成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力顯著下調(diào)，該現(xiàn)象在過表達srf水平后得到一定程度的逆轉(zhuǎn)，在體內(nèi)進一步說明mir-647發(fā)揮抑癌作用是通過影響srf表達實現(xiàn)的；

圖6中d-f是在原位種植瘤模型上檢測ccg-1423腹腔注射的抑癌效果(partii)，觀察記錄方法同前。在體內(nèi)證實ccg-1423對胃癌原位種植瘤的進展有顯著抑制效果；

圖6中g(shù)-i是在前兩個實驗基因上聯(lián)合尾靜脈注射mir-647agomir(agomir-647)與腹腔注射ccg-1423(partiii)，觀察記錄方法同前，說明聯(lián)合兩種藥物可以取得更好療效。

本發(fā)明給藥方案流程如圖7所示：細胞腋下成瘤第45天行胃癌瘤塊原位種植，待術(shù)后兩周開開始給藥。給藥方案如圖所示。ccg-1423(0.15mg/kg/d)采用腹腔注射，agomir-647(80mg/kg/3d)采用尾靜脈注射。

本發(fā)明研究簡介模式圖如圖8所示：

本研究發(fā)現(xiàn)mir-647通過抑制血清應(yīng)答因子srf信使rna翻譯抑制胃癌細胞srf蛋白表達，從而引起srf依賴性轉(zhuǎn)錄的myh9蛋白(myh9啟動子區(qū)含cargbox)表達下調(diào)，最終抑制胃癌細胞的侵襲、遷移和收縮等過程；ccg-1423作為srf核內(nèi)功能抑制劑可抑制mrtf入核，用之與胃癌細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)顯著抑制myh9表達及胃癌遷移侵襲能力。動物實驗進一步證實mir-647agomir與ccg-1423可聯(lián)合有效抑制胃癌原位種植瘤生長與轉(zhuǎn)移。

圖8中nucleus：細胞核；cytoplasm：細胞質(zhì)；invasion：侵襲；migration：遷移；adhesion：粘附；spreading：細胞伸展；contractility：細胞收縮；extracellularsignals：胞外信號cytoskeletalstress：細胞骨架應(yīng)力作用；rho：小g蛋白rho相關(guān)激酶(rho激酶)；profillin和mdia是rho下游效應(yīng)分子；srf:血清應(yīng)答因子；g-actin:肌動蛋白單體；f-actin:肌動蛋白多聚體、肌動蛋白纖維束；mrna:信使rna；mrtf：心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子；dissociation：分解；myh9gene：myh9基因。

最后所應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。